菠蘿蛋白酶的提取純化工藝研究

梁雪 方歡樂 劉建利

摘 要：為降低環境污染，提高菠蘿蛋白酶的附加值以及延長菠蘿的產業鏈，以菠蘿廢棄物為原料，采用鹽析濃縮-透析提純-乙醇有機溶劑沉淀相結合的方法提取菠蘿蛋白酶。實驗考察料液比、緩沖液溫度、攪拌時間、緩沖液pH值、鹽析濃度以及透析時間對菠蘿蛋白酶酶活性和酶活回收率的影響。結果表明，菠蘿蛋白酶的最佳工藝條件為料液比1.0∶1.5（m∶v）、緩沖液溫度30 ℃、攪拌時間40 min、緩沖液pH值7、鹽析濃度30%和透析時間28 h，該條件下菠蘿蛋白酶酶活回收率為68.45%。

關鍵詞：菠蘿蛋白酶；鹽析法；透析提純；有機溶劑沉淀

Abstract： In order to reduce environmental pollution， increase the added value of bromelain， and extend the industrial chain of pineapple， a method combining salt precipitation concentration dialysis purification ethanol organic solvent precipitation was used to extract bromelain from pineapple waste as raw material. The experiment investigated the effects of material liquid ratio， buffer temperature， stirring time， buffer pH value， salting out concentration， and dialysis time on bromelain enzyme activity and enzyme recovery rate. The results showed that the optimal process conditions for bromelain were material to liquid ratio of 1.0∶1.5（m∶v）， buffer temperature of 30 ℃， stirring time of 40 minutes， buffer pH of 7.0， salt out concentration of 30%， and dialysis time of 28 hours. Under these conditions， the recovery rate of bromelain enzyme activity was 68.45%.

Keywords： bromelain; salting out; dialysis purification; organic solvent precipitation

菠蘿蛋白酶為白色至淡棕黃色無定形粉末，是我國目前大規模生產的植物蛋白酶之一[1]。菠蘿俗稱鳳梨，是重要的水果之一。菠蘿成熟之后，除果實之外，大部分皮渣被丟棄，造成了資源浪費。本文以菠蘿廢棄物為原料，提取菠蘿蛋白酶，不僅可以降低環境污染，還能提高菠蘿蛋白酶的附加值以及延長菠蘿的產業鏈。

菠蘿蛋白酶能分解酰胺、酯、肽和蛋白質等進行各種生化反應，因此在食品、醫藥、美容以及畜牧生產方面有著重要的作用[2-5]。近年來，國內外科研工作者對菠蘿蛋白酶的提取純化方法進行了大量的研究，旨在尋找酶活回收率以及蛋白質含量較高的工藝。傳統的提取純化方法有高嶺土吸附法、單寧沉淀法以及超濾濃縮法[6-13]。其中，高嶺土吸附法和單寧沉淀法具有操作煩瑣、酶活回收率低以及環境污染較大等缺點。超濾濃縮法雖然會摻雜較多其他蛋白，但其操作簡單，無污染，因此被廣泛使用。目前，出現了越來越多的新方法，如雙水相（ATP）萃取、反膠束萃取、離子交換色譜層析法以及固定化金屬離子親和色譜等[14-18]。新方法雖然能提高酶活回收率，但不適合大規模生產，故需要進一步優化。

本實驗以菠蘿廢棄物為原料，從中提取菠蘿蛋白酶，并對影響菠蘿蛋白酶提取純化的各個因素進行優化，從而得到菠蘿蛋白酶的最佳提取純化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿廢棄物：水果超市收集；L-酪氨酸（BR）：天津市光復精細化工研究所；三（羥甲基）氨基甲烷、冰醋酸、三水醋酸鈉、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、硫酸銨、95%乙醇、L-半胱氨酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-2數顯恒溫水浴鍋：金壇市華峰儀器有限公司；H-1600A高速離心機臺式：上海立鑫堅離心機有限公司；752型紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平料學儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州科豐儀器設備有限公司；SL-250型高速多功能粉碎機：浙江省永康市松青五金廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取

取一定質量的菠蘿加工下腳料，洗凈，晾干，放入榨汁機中，加適量Tris緩沖液攪拌，汁液用200目的紗布過濾，備用。

1.3.2 純化

采用鹽析濃縮-透析提純-乙醇有機溶劑沉淀相結合的方法對菠蘿蛋白酶進行純化。取濾液加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，攪拌至完全溶解，靜置，待蛋白酶沉淀完全，將含有沉淀的蛋白酶溶液于1 600 r·min-1離心30 min，然后在得到的蛋白酶沉淀中加入BaCl2進行透析，取透析液加有機乙醇沉淀即得。

1.3.3 酶活測定

菠蘿蛋白酶酶活性采用F.I.P法[19]。準確移取2.5 mL底物溶液于15 mL比色管中，并置于35 ℃水浴中調溫后，再加入2.5 mL經預熱的酶溶液，混合均勻，精確保溫10 min后，立即加入5.0 mL蛋白質凝固劑，終止反應。此后將樣品繼續放在水浴中靜置30 min，過濾。用紫外可見分光光度計在275 nm波長下，測定其吸光度，空白值的做法為在加入蛋白質凝固劑之后再加酶溶液。菠蘿蛋白酶酶活性定義為在規定條件下[（35±0.20）℃，pH=7]，每分鐘水解酪蛋白釋出的三氯乙酸可溶物肽在275 nm下測得的吸光度與1 μmol酪氨酸（相對分子量為181.20）所產生的吸光度相等。酶活回收率按公式（1）計算。

酶活回收率=條件改變后的總酶活/條件改變前的總酶活×100%（1）

1.4 單因素試驗設計

1.4.1 料液比

緩沖液溫度為30 ℃，攪拌時間為40 min，緩沖液pH值為7，鹽析濃度為30%，透析時間為28 h，研究料液比（m∶v）（1.0∶1.1、1.0∶1.3、1.0∶1.5、1.0∶1.7、1.0∶1.9和1.0∶2.0）對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響，確定最佳料液比。

1.4.2 緩沖液溫度

攪拌時間為40 min，緩沖液pH值為7，鹽析濃度為30%，透析時間為28 h，料液比為1.0∶1.5，研究緩沖液溫度（10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃）對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響，確定最佳緩沖液溫度。

1.4.3 攪拌時間

緩沖液溫度為30 ℃，緩沖液pH值為7，鹽析濃度為30%，透析時間為28 h，料液比為1.0∶1.5，研究攪拌時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min）對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響，確定最佳攪拌時間。

1.4.4 緩沖液pH值

緩沖液溫度為30 ℃，鹽析濃度為30%，透析時間為28 h，料液比為1.0∶1.5，攪拌時間為40 min，研究緩沖液pH值（4、5、6、7、8和9）對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響，確定最佳緩沖液pH值。

1.4.5 鹽析濃度

緩沖液溫度為30 ℃，透析時間為28 h，料液比為1.0∶1.5，攪拌時間為40 min，緩沖液pH值為7，研究鹽析濃度（10%、20%、30%、40%和50%）對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響，確定最佳鹽析濃度。

1.4.6 透析時間

緩沖液溫度為30 ℃，鹽析濃度為30%，料液比為1.0∶1.5，攪拌時間為40 min，緩沖液pH值為7，分別在6 h、10 h、14 h、18 h、24 h、28 h、32 h、36 h觀察沉淀的消失時間，確定最佳透析時間。

2 結果與分析

2.1 料液比對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響

由圖1可知，料液比對酶活回收率有明顯影響，酶活回收率隨著提取液的增加而出現先上升后降低的趨勢，當料液比為1.0∶1.5時，酶活回收率達到最高。故料液比為1.0∶1.5為最佳料液比。

2.2 緩沖液溫度對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響

由圖2可知，緩沖液溫度對酶活回收率有明顯影響，酶活回收率隨著緩沖液溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。緩沖液溫度為30 ℃時，酶活回收率最高，為最佳緩沖液溫度。緩沖液溫度高于30 ℃時，菠蘿蛋白酶活性受損，菠蘿蛋白酶酶活回收率迅速下降；緩沖液溫度低于30 ℃時，酶活回收率隨著溫度的升高而增大。故在實驗時必須合理控制緩沖液的溫度，以保證菠蘿蛋白酶活性。

2.3 攪拌時間對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響

由圖3可知，攪拌時間小于40 min時，酶活回收率隨著攪拌時間的延長而逐漸升高，攪拌時間大于40 min時，酶活回收率隨著攪拌時間的延長而降低，攪拌時間為40 min時，酶活回收率最高。故攪拌時間40 min為最佳攪拌時間。

2.4 緩沖液pH值對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響

由圖4可知，緩沖液pH值對酶活回收率有明顯影響，酶活回收率隨著緩沖液pH值的增大呈先上升后下降的趨勢。緩沖液pH值小于7時，酶活回收率隨著緩沖液pH值的增大而增大，緩沖液pH值大于7時，酶活回收率隨著緩沖液pH值的增大而減小，緩沖液pH值為7時酶活回收率達到峰值。故緩沖液pH值為7是最佳緩沖液pH值。

2.5 鹽析濃度對菠蘿蛋白酶酶活回收率的影響

由圖5可知，鹽析濃度對酶活回收率有明顯影響，酶活回收率隨著鹽析濃度的增大呈先上升后迅速下降的趨勢。鹽析濃度為30%時，酶活回收率最高，為最佳鹽析濃度；鹽析濃度小于30%時，酶活回收率隨著鹽濃度的增大而升高，但相對平緩；鹽析濃度大于30%時，鹽析濃度過高，菠蘿蛋白酶活性受損，開始失活，酶活回收率迅速減小，故實驗過程中必須合理控制硫酸銨飽和濃度。

2.6 最佳透析時間的確定

由表1可知，透析時間低于28 h時，菠蘿蛋白酶的透析外液均有沉淀析出，透析時間高于28 h時，菠蘿蛋白酶的透析外液中幾乎觀察不到沉淀，故確定透析時間28 h為最佳透析時間。

3 結論

通過實驗可知，料液比、緩沖液溫度、攪拌時間、緩沖液pH值以及鹽析濃度均對菠蘿蛋白酶酶活回收率有較大的影響。提取菠蘿蛋白酶的最佳工藝條件為料液比1.0∶1.5、緩沖液溫度30 ℃、攪拌時間40 min、緩沖液pH值為7.0、鹽析濃度為30%飽和硫酸銨溶液、最佳透析時間28 h，此條件下菠蘿蛋白酶的回收率為68.45%。此工藝條件除具有菠蘿蛋白酶活性較高的優點外，還具有環境污染小、能耗低以及能夠規模化生產等優勢。本次研究對于提高菠蘿整果的利用率、提升其附加值至關重要，能夠為菠蘿蛋白酶的產業鏈發展奠定堅實的基礎，對今后菠蘿蛋白酶的進一步研究與發展具有重要意義。

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