UPLC-Q-Exactive-MS/MS測定傷痛寧膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ的含量

朱立華，黃生武，沈冰冰，謝誼

〔摘要〕 目的 建立UPLC-Q-Exactive-MS/MS測定傷痛寧膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ的含量。方法 采用Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.9 μm），流動相為乙腈和0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨），梯度洗脫，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃。采用電噴霧離子源正離子模式，進行平行反應監測模式，選擇質荷比（m/z）359.0→298.0和359.0→296.0離子對進行監測。結果 馬兜鈴酸Ⅰ在0.06～0.2 ng范圍內線性關系良好（R2=0.999 5），精密度和穩定性的RSD值均小于3%，加樣回收率均值為104.1%（RSD=4.29％）。不同批次傷痛寧膠囊樣品中馬兜鈴酸Ⅰ的含量均值為0.000 004 90%，從藥材到成品的轉移率均值為103.7%，RSD值為19.5%。結論 該方法專屬性好，靈敏度高，準確可靠、耐用，可以用于傷痛寧膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ的含量測定。

〔關鍵詞〕 傷痛寧膠囊；馬兜鈴酸Ⅰ；UPLC Q-Exactive MS/MS；定量分析

〔中圖分類號〕R284? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.011

Determination of aristolochic acid Ⅰ in Shangtongning

Capsule by UPLC-Q-Exactive-MS/MS

ZHU Lihua1， HUANG Shengwu1， SHEN Bingbing2， XIE Yi2*

1. Hunan Guohua Pharmaceutical Co.， Ltd.， Changsha， Hunan 410013， China;

2. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410013， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To develop a method of UPLC-Q-Exactive-MS/MS for the determination of aristolochic acid Ⅰ in Shangtongning Capsule. Methods The chromatography was performed on Hypersil GOLD C18 column （2.1 mm×50 mm， 1.9 μm） with mobile phases consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution （containing 5 mmol/L ammonium formate） at a gradient elution rate of 0.5 mL/min， and the column temperature was 30 ℃. Electrospray ionization in positive ionization mode was used for parallel reaction monitoring， and ion pairs with mass-to-charge ratios （m/z） of 359.0→298.0 and 359.0→296.0 were selected for monitoring. Results Aristolochic acid Ⅰ had a good linear relationship in the range of 0.06-0.2 ng （R2=0.999 5）， RSDs of precision and stability were less than 3%， and the average recovery was 104.1% （RSD=4.29%）. The average content of aristolochic acid Ⅰ in different batches of Shangtongning Capsule was 0.000 004 90%， the mean transfer rate from medicinal materials to finished products was 103.7% and RSD was 19.5%. Conclusion With high specificity， sensitivity， and accuracy， the method is reliable and reproducible， and can be used for the determination of aristolochic acid Ⅰ in Shangtongning Capsule.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Shangtongning Capsule; aristolochic acid Ⅰ; UPLC-Q-Exactive-MS/MS; quantitative analysis

傷痛寧膠囊是由制乳香、制沒藥、甘松、醋延胡索、細辛、醋香附、山柰和白芷8味藥組成，是《中華人民共和國藥典》（2020年版）收錄品種“傷痛寧片”的劑改品種[1]，具有散瘀止痛功效，主要用于跌打損傷、閃腰挫氣等[2]?，F代藥理動物實驗和人體臨床病例都已經證明，細辛中馬兜鈴酸類物質具有腎毒性、致癌和致突變作用[3-6]，2020年版《中華人民共和國藥典》也規定了馬兜鈴酸Ⅰ的限量標準（不得超過0.001%）。因此，為了保證用藥安全，對含馬兜鈴酸類物質的中藥復方進行含量檢測是非常必要的。

目前，有關馬兜鈴酸類成分的檢測方法主要有高效液相色譜法、液質聯用色譜法等[7-11]。近些年來，液相質譜聯用技術發展迅速，已成為中藥及復方研究的強大分析工具[12-13]。超高液相色譜分析時間短，對復雜樣品的高分離能力與質譜的高選擇性、高靈敏度，以及提供相對分子質量與結構信息的優點結合起來，在醫藥分析、食品安全和環境分析等領域獲得了廣泛的應用[14-16]。因此，本研究在原注冊標準基礎上進行提升，通過建立UPLC-Q-Exactive-MS/MS測定傷痛寧膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ含量的方法，為傷痛寧膠囊的安全性提供科學依據。

1 儀器與試劑

Thermo Q-Exactive型液質聯用色譜儀（美國賽默飛公司）；Mettler Toledo AL-204型電子天平、Mettler Toledo XPE-105型電子天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]；KM-500DB型中文液晶臺式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；乙腈色譜純（德國Merck公司）；甲酸色譜純[阿拉丁試劑（上海）有限公司]；純凈水[華潤怡寶飲料（中國）有限公司]；其余試劑均為分析純。馬兜鈴酸Ⅰ（中國食品藥品檢定研究院，批號：110746-201912，純度為99.1%）；甲酸銨（美國ACS恩科化學試劑公司，批號：AF-6266-0025）。細辛藥材（批號：B24-1811-007、ZY-026P-2204-002、ZY-026-2204-004和ZY-026-2212-001～ZY-026-2212-005）和傷痛寧膠囊（批號：S-20200801～S-20200803、220501～220503、220901、20230201～20230205）由湖南國華制藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1? 色譜條件

Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm），流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨），梯度洗脫（0～10 min，62%～55% B）；流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。

2.2? 質譜條件

四極桿/靜電場軌道肼質譜檢測器；電噴霧離子源；檢測方式：正離子模式；范圍：100～1 500 m/z；噴霧電壓：3.5 kV，鞘氣體積流量為35 arb，輔助體積流量為10 arb，輔助氣溫度375 ℃。毛細管溫度320 ℃，二級碰撞能量：10 eV。掃描方式采用全掃描一級質譜、特征離子掃描一級質譜，平行反應監測。

2.3? 溶液的制備

2.3.1? 馬兜鈴酸Ⅰ標準品的配制? 取標準品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含20 ng的溶液，作為對照品溶液。

2.3.2? 傷痛寧供試品溶液? 取傷痛寧膠囊樣品適量，研細，混勻，精密稱取1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.3.3? 細辛樣品溶液? 取細辛粉末（過三號篩），精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.3.4? 缺細辛陰性樣品溶液? 取除細辛外的其余處方量藥材，按生產工藝制成陰性樣品，取適量研細，混勻，精密稱取1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.4? 方法學考察

2.4.1? 馬兜鈴酸Ⅰ檢測離子對的選擇? 通過優化流動相，確定馬兜鈴酸Ⅰ標準品在0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）條件下的質譜響應較高，尤其是正模式下分子離子峰359.086 67[M+NH4]+（圖1）。在二級質譜圖中，主要產生298.070 62[M+H-CO2]+、296.067 26[M+H-NO2]+、281.068 12[M+H-CO2-H2O]+、265.037 05[M+H-NO2-OCH3]+等碎片離子，其中298.070 62的響應最高，作為定量離子，296.067 26可作為定性離子（圖2）。

2.4.2? 專屬性? 按照“2.1”項下色譜條件和“2.2”項下質譜條件，將馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液、傷痛寧膠囊溶液、細辛溶液和缺細辛陰性對照溶液分別進樣，記錄質譜色譜圖并積分，結果顯示在缺細辛陰性對照溶液的圖譜中，與馬兜鈴酸Ⅰ對照品溶液保留時間相同的位置上未顯示色譜峰。詳見圖3。

2.4.3? 檢出限? 取馬兜鈴酸Ⅰ標準品溶液逐步稀釋，以S/N=3∶1計算，得到馬兜鈴酸Ⅰ的檢出限為1 pg。

2.4.4? 線性關系? 取同一馬兜鈴酸Ⅰ標準品溶液，按照“2.1”項下色譜條件和“2.2”項下質譜條件，分別進樣3、4、5、6、8、10 μL，記錄質譜色譜圖并積分，以馬兜鈴酸Ⅰ的峰面積為Y，馬兜鈴酸Ⅰ的量（ng）為X進行線性回歸，得到回歸方程Y=115 901X-5 480.8（R2=0.999 5）。結果表明，馬兜鈴酸Ⅰ在0.06～0.2 ng范圍內線性關系良好。

2.4.5? 精密度? 取同一馬兜鈴酸Ⅰ標準品溶液，按照“2.1”項下色譜條件和“2.2”項下質譜條件連續進樣6次，記錄質譜色譜圖并積分，結果顯示馬兜鈴酸Ⅰ峰面積的RSD為2.78％，試驗表明本方法精密度良好。

2.4.6? 穩定性? 取同一馬兜鈴酸Ⅰ標準品溶液，按照“2.1”項下色譜條件和“2.2”項下質譜條件分別在0、2、4、6、8 h進樣，記錄質譜色譜圖并積分，結果馬兜鈴酸Ⅰ峰面積的RSD為1.92％，試驗表明本方法在8 h內穩定性良好。

2.4.7? 加樣回收率? 精密稱取同一傷痛寧膠囊制備供試品溶液，分別加入馬兜鈴酸標準品溶液（100 ng/mL）6.5、5、3.5 mL，按方法“2.3.2”項下處理供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件和“2.2”項下質譜條件依次進樣，記錄質譜色譜圖并積分，結果如表1所示，加樣回收率為104.1%（RSD=4.29％），試驗表明本方法加標回收率較好。

2.4.8? 樣品檢測? （1）細辛藥材馬兜鈴酸Ⅰ含量的檢測：按“2.3.3”項下方法處理供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件和“2.2”項下質譜條件依次進樣，記錄質譜色譜圖并積分。計算8批細辛藥材馬兜鈴酸Ⅰ的含量均值為0.000 107%，小于《中華人民共和國藥典》規定的0.001%[1]。詳見表2。

（2）傷痛寧膠囊馬兜鈴酸Ⅰ含量的檢測：按“2.3.2”項下方法處理供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件和“2.2”項下質譜條件依次進樣，記錄質譜色譜圖并積分，計算傷痛寧膠囊中馬兜鈴酸的含量和轉移率。詳見表2。

3 討論

根據國內外學者對馬兜鈴酸類成分的詳細研究，已證實馬兜鈴酸具有腎毒性和致癌性，大量服用可能會引起急性馬兜鈴酸腎病，出現急性腎小管壞死、急性腎衰竭等病理變化[17-19]。我國自2003年起，就已經對含馬兜鈴酸的藥材及中成藥采取了包括禁止使用馬兜鈴酸含量高的關木通、廣防己和青木香；調整藥材使用部位，將細辛的藥用部位由全草改為根和根莖等一系列風險控制措施[18]。因此，必須對含有馬兜鈴酸藥材作為原料生產的產品進行檢查，進一步加強檢測檢驗。目前，馬兜鈴酸Ⅰ的經典檢測方法主要是紫外分光光度法、色譜法和色譜-質譜聯用法，其中色譜-質譜聯用法是將液相色譜的高效分離技術和質譜的快速定性、定量技術相結合的一種重要的分析方法，具有操作簡單、高效靈敏、準確可靠等優點，因此，常被用于中藥（復方）中化合物的快速定性定量分析[20]。另外，還有一些新型的快速檢測方法被報道，例如熒光探針法[21]、酶聯免疫吸附法[22]、近紅外光譜法[23]等。本研究對象傷痛寧膠囊中存在含有馬兜鈴酸類成分的藥材細辛，并且復方化學類型多樣，成分復雜，常見的紫外檢測器等靈敏度難以滿足要求，因此，準確性、選擇性和靈敏度更高的液質聯用法是首選。馬兜鈴酸Ⅰ化合物是弱極性的小分子化合物，在電噴霧離子源質譜中的離子化效率不高。前期通過參考文獻[24-25]和單因素考察實驗，發現馬兜鈴酸Ⅰ在流動相中加入5 mmol/L甲酸銨的情況下出現分子離子峰359.0[M+NH4]+，且響應最高。因此，采用電噴霧離子源正離子模式，進行平行反應監測模式，選擇質荷比（m/z）359.0→298.0和359.0→296.0離子對進行監測。

因此，建立了UPLC-Q-Exactive-MS/MS測定傷痛寧膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ含量的方法。該方法在0.06～0.2 ng范圍內線性關系良好（R2=0.999 5），精密度、穩定性的RSD均小于3%，加樣回收率在99.75%～110.96%范圍內，RSD為4.29％，適合馬兜鈴酸Ⅰ的檢測。細辛樣品檢測馬兜鈴酸Ⅰ的含量均遠小于《中華人民共和國藥典》2020年版[1]規定的限量要求（不得超過0.001%）。傷痛寧膠囊中16 g細辛藥材制成1 000粒（每粒0.33 g），經藥味分析每克膠囊樣品含細辛藥材0.048 g，根據《中華人民共和國藥典》2020年版[1]規定細辛藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的限量，按照100%的轉移率可知，傷痛寧膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ的限量應不得超過0.000 048%。傷痛寧膠囊成品中6批未檢測出馬兜鈴酸Ⅰ，其余6批馬兜鈴酸Ⅰ的含量均值為0.000 004 90%，從藥材到成品的轉移率均值為103.7%，RSD值為19.5%，含量均遠小于0.000 048%的限量，是合格的、安全的。綜上所述，該方法專屬性好，靈敏度高，準確可靠、耐用，可以用于傷痛寧膠囊中馬兜鈴酸Ⅰ的含量測定。本研究不僅為傷痛寧中馬兜鈴酸Ⅰ的限量檢查提供了數據支撐，也為傷痛寧膠囊中細辛的合理、安全使用提供了科學依據。

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（本文編輯? 周? 旦）