左歸降糖益腎方HPLC指紋圖譜及4種成分的含量測定研究

惠博平，易子漾，陳林，陳海剛，喻嶸，黃建華

〔摘要〕 目的 采用HPLC建立左歸降糖益腎方指紋圖譜，并對4個主要成分進行含量測定。方法 對色譜柱型號、流動相系統、梯度洗脫條件、檢測波長以及供試品處理方法等條件進行優化，最終確定了最佳液相條件：選用色譜柱為Welch ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相系統為甲醇-0.1%甲酸溶液；紫外檢測波長為254 nm；供試品溶液提取溶劑為甲醇溶液。并對8批次左歸降糖益腎方HPLC指紋圖譜進行相似性分析判斷批次間穩定性。結果 利用HPLC指紋圖譜確定了左歸降糖益腎方21個共有峰，并指認了9個色譜峰；8批次左歸降糖益腎方指紋圖譜的相似度均大于0.920；4個有效成分馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的平均含量分別為（183.93±9.55）、（42.64±4.77）、（198.01±9.49）、（96.36±9.00） μg·mL-1。結論 建立的左歸降糖益腎HPLC方指紋圖譜方法簡便，準確、重現性好，可為左歸降糖益腎方的質量控制體系提供參考。

〔關鍵詞〕 左歸降糖益腎方；糖尿病腎病；高效液相色譜法；指紋圖譜；含量測定

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.012

HPLC fingerprint of Zuogui Jiangtang Yishen Formula and content determination of its four ingredients

HUI Boping1， YI Ziyang1， CHEN Lin2， CHEN Haigang3， YU Rong1*， HUANG Jianhua1，2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 3. China Resources Sanjiu （Chenzhou） Pharmaceutical Co.，Ltd.， Chenzhou， Hunan 423000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To establish the HPLC fingerprint of Zuogui Jiangtang Yishen Formula and to determine the content of its four main ingredients. Methods The chromatographic column type， mobile phase system， gradient elution condition， detection wavelength， and test product treatment were optimized. The optimal liquid phase conditions were： Welch ultimate AQ-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was selected as the chromatographic column， the methanol-0.1% formic acid solution was taken as the mobile phase system， the UV detection wavelength was 254 nm， and methanol solution was set as the extraction solvent of the test solution. And similarity analysis on the HPLC fingerprints of 8 batches of Zuogui Jiangtang Yishen Formula was performed to determine the stability among batches. Results A total of 21 common peaks were determined， and 9 chromatographic peaks were identified from HPLC fingerprint of Zuogui Jiangtang Yishen Formula. The similarity of fingerprints among 8 batches of Zuogui Jiangtang Yishen Formula was greater than 0.920. The average content of the four active ingredients （loganin， jatrorrhizine hydrochloride， berberine hydrochloride， and palmatine chloride） were 183.93±9.55， 42.64±4.77， 198.01±9.49， and 96.36±9.00 μg·mL-1， respectively. Conclusion The established HPLC fingerprint method is simple， accurate， and reproducible， which can provide references for the quality control system of Zuogui Jiangtang Yishen Formula.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Zuogui Jiangtang Yishen Formula; diabetic kidney disease; high performance liquid chromatography; fingerprint; content determination

糖尿病腎病（diabetic kidney disease， DKD）被認為是2型糖尿病最主要的并發癥之一，并且與蛋白尿、高血壓、水腫、腎功能不全和腎衰竭有關。然而，由于DKD發病機制的復雜性，其病理生理機制尚未完全闡明[1]。西醫治療DKD雖已取得一些新的進展，可以使患者的病情部分延緩或控制，但長期預后仍不盡如人意[2]，血管緊張素轉化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑具有腎臟保護作用，但很大一部分DKD患者最終會進展為終末期腎衰竭[3]。近些年來，中醫藥防治是干預臨床DKD非常重要的手段。中醫學認為，氣陰兩虛兼血瘀是糖尿病腎病的基本證候，且隨著病期的進展，脾腎陽虛、陰陽兩虛以及濁毒、水濕等證候增加，提示DKD出現陽虛、濕毒等證候時常意味著病情的加重[4]。在中醫藥理論指導下引入現代科學、實現中藥現代化已成為中藥發展的必由之路[5]，其在診治該疾病上具有一定的優勢和特色。

課題組長期致力于糖尿病及其并發癥的中醫藥防治研究[6]，左歸降糖益腎方是以明代醫家張景岳陰陽互濟法的代表方左歸丸、左歸飲化裁而成，由黃芪、丹參、山藥、黃連、牛膝、益母草、熟地黃、酒山茱萸、玉米須9味中藥組成。方中重用熟地黃，滋陰養腎為主藥，以填真陰[7]；黃芪益氣健脾；酒山茱萸、牛膝補益肝腎，強健腰膝；黃連清熱燥濕，瀉火解毒[8]；丹參、益母草活血化瘀；玉米須清熱利濕，利尿消腫；諸藥合用，共奏滋陰益氣，活血解毒，利尿消腫之功效[9]。經過長期的臨床實踐表明，左歸降糖益腎方可降低空腹血糖，改善糖耐量、抑制炎癥因子的產生和氧化應激作用，通過解除高血糖對腎小球的刺激，阻斷炎癥誘導的損傷從而達到減少蛋白尿、改善糖尿病早期腎臟損傷的目的[10]。

開展中藥質量控制研究是保證中藥安全和療效的關鍵，也是中藥生產現代化和質量標準科學化發展的關鍵[11]。對于成分復雜的中藥復方來說，中藥指紋圖譜可整體、全面地反映中藥及其復方制劑的化學成分信息，具有專屬性、特征性強，且重現性、穩定性好等諸多優點[12-13]。長期的臨床實踐和實驗研究表明，左歸降糖益腎方在DKD的防治中療效顯著[14-15]，然而該組方的化學成分還未進行系統全面的分析研究。因此，本文擬建立左歸降糖益腎方HPLC指紋圖譜，并定量分析其主要成分，為更全面開展其質量控制研究，為保證其臨床療效提供依據。

1 材料

1.1? 儀器與設備

AgiLent 1200高效液相色譜儀（美國AgiLent公司）；KQ2200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；真空冷凍干燥機（杭州旌斐儀器科技有限公司）；EXPE105型電子天平、XS205型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2? 藥材與試劑

1.2.1? 藥材? 左歸降糖益腎方組方藥材均購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，黃芪（批號：CK21063002；產地：四川）；熟地黃（批號：2103033；產地：河南）；牛膝（批號：SL21060301；產地：河南）；黃連（批號：HH21060704；產地：甘肅）；益母草（批號：200901；產地：湖南）；玉米須（批號：2021042602；產地：河南）；丹參（批號：HY21061501；產地：山東）；酒山茱萸（批號：TH21060703；產地：河南）；山藥（批號：CK21061807；產地：河南）。

1.2.2? 對照品? 鹽酸小檗堿（批號：CHB-Y-039）購自成都普菲德生物科技有限公司；異槲皮苷（批號：CHB201210）、京尼平苷酸（批號：CHB201204）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；莫諾苷（批號：111998-202104）、腺苷（批號：CHB210104）、鹽酸巴馬汀（批號：110732-20110）、鹽酸藥根堿（批號：110733-201619）、馬錢苷（批號：CHB180108）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均為98%。

1.2.3? 試劑? 甲醇為分析純（批號：20211023，湖南匯虹試劑有限公司）；甲醇為色譜純（批號：21115042，美國天地有限公司）；甲酸為色譜純（批號：20210303，天津市科密歐化學試劑有限公司）；怡寶水（批號：20211202，華潤怡寶飲料有限公司）。

2 方法與結果

2.1? 溶液制備

供試品溶液制備：取8批左歸降糖益腎方（S1～S8）各味中藥分別放于砂鍋中以10倍水浸泡30 min，武火加熱煮沸后，轉用文火煎煮1.5 h，紗布過濾藥液，藥渣再加8倍量水煎煮1 h并過濾，將兩次煎煮的濾液濃縮至約300 mL的流浸膏，于冷凍干燥機中減壓干燥得到凍干粉末，取復方凍干粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇40 mL，密塞，超聲處理30 min，取出，搖勻，放冷，過0.22 μm微孔濾膜，即得，置于4 ℃冰箱保存備用。

對照品溶液的制備：分別精密稱取對照品馬錢苷2.03 mg、鹽酸小檗堿3.02 mg、鹽酸藥根堿2.60 mg、鹽酸巴馬汀3.10 mg分別于5 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL各約含0.406、0.604、0.520、0.620 mg的對照品溶液，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

空白溶液：色譜甲醇溶液。

2.2? HPLC色譜條件

采用Agilent 1200高效液相色譜儀，Welch ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；柱溫為25 ℃；紫外檢測器檢測波長254 nm；進樣量為5 μL；流動相A為甲醇，流動B為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫（0～15 min，5%～13%A；15～28 min，13%～23%A；28～35 min，23%～26%A；35～50 min，26%～38%A；50～60 min，38%～53%A；60～65 min，53%～60%A；65～75 min，60%～95%A）；流速為0.8 mL/min。

2.3? 色譜條件的優化

2.3.1? 色譜柱考察? 采用不同色譜柱：色譜柱1為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色譜柱2為InertSustain AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色譜柱3為Generall C18親水AQ柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色譜柱4為Welch ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。按“2.2”指紋圖譜色譜條件進行測定，基于色譜柱4的色譜圖基線較為平穩、色譜峰分離效果和峰型較好、色譜峰響應高，故后續實驗選用色譜柱4。結果詳見圖1。

2.3.2? 流動相系統考察? 考察甲醇、乙腈和水不同組合洗脫條件下的分析結果，選擇流動相系統：流動相1（乙腈-0.1%甲酸溶液）、流動相2（甲醇-0.05%磷酸溶液）、流動相3（甲醇-0.1%磷酸溶液）、流動相4（甲醇-0.1%甲酸溶液），按“2.2”指紋圖譜色譜條件進行測定，記錄254 nm處色譜圖。結果如圖2所示，甲醇與水組成的流動相洗脫效果更好，得到的色譜圖色譜峰數目最多，當在水相中加入少量甲酸后，色譜峰分離效果變得更好，基線波動較緩，各成分色譜峰保留時間適中且數量最多，故選擇流動相4（甲醇-0.1%甲酸溶液）為流動相系統。

2.3.3? 梯度洗脫條件優化? 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.1%甲酸為流動相，按表1條件進行梯度洗脫優化；柱溫25 ℃；液相使用Agilent 1200高效液相色譜儀；色譜柱使用Welch ultimate AQ-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱。記錄檢測波長254 nm信號色譜圖。各梯度洗脫條件的結果如圖3所示，流動相A為甲醇，流動B為0.1%甲酸水溶液，選擇“洗脫梯度3”條件進行梯度洗脫，該條件色譜峰紫外吸收響應值較高且峰型、分離度均較好、雜峰較少，故選擇“洗脫梯度3”條件。

2.3.4? 最佳檢測波長考察? 對比紫外1（254 nm）、紫外2（245 nm）、紫外3（335 nm）不同紫外檢測器檢測波長，按“2.2”指紋圖譜色譜條件進行測定，結果如圖4所示，當檢測波長選擇254 nm時色譜圖中各色譜峰響應值較高，圖譜信息最為豐富，各峰吸收較均勻，故檢測波長選擇紫外1（254 nm）。

2.3.5? 供試品溶液提取溶劑考察? 本試驗分別選用提取溶劑1（70%甲醇）、提取溶劑2（50%甲醇）和提取溶劑3（甲醇）作為提取溶劑，按“2.1”項凍干粉末處理方法，分別精密加入70%甲醇、50%甲醇、100%甲醇40 mL。按“2.2”指紋圖譜色譜條件進行測定，比較不同溶劑的HPLC圖譜，結果如圖5所示，提取溶劑為70%甲醇、50%甲醇、色譜圖中信號峰數量基本一致，當提取溶劑為甲醇時，色譜圖基線較平穩，色譜峰數量多且響應較好，配制較為簡便，故提取溶劑選擇提取溶劑3（甲醇）。

2.4? 指紋圖譜研究

2.4.1? 指紋圖譜的建立? 指紋圖譜的建立：取8批左歸降糖益腎方樣品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，將8批樣品的色譜數據以AIA文件格式導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004版）軟件，以S1號色譜圖為參考，采用多點校正及自動匹配，建立共有模式，時間窗寬度設為0.1，中位數法生成對照圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”進行共有峰標識，獲得了21個共有峰，與對照圖譜相比，不同批次左歸降糖益腎方樣品化學成分輪廓基本一致。結果詳見圖6。

2.4.2? 共有峰的指認? 制備中藥化學對照品混合溶液，按照左歸降糖益腎方樣品指紋圖譜測定方法測定，對左歸降糖益腎方樣品HPLC 21個共有峰中的9個色譜峰進行了指認，分別為1號色譜峰（腺苷）、2號色譜峰（京尼平苷酸）、3號色譜峰（莫諾苷）、4號色譜峰（馬錢苷）、5號色譜峰（鹽酸藥根堿）、6號色譜峰（腺鹽酸小檗堿）、7號色譜峰（鹽酸巴馬汀）、8號色譜峰（β-蛻皮甾酮）、9號色譜峰（異槲皮苷）。結果詳見圖7。

2.4.3? 相似度評價? 將8批左歸降糖益腎方樣品指紋圖譜導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》軟件，經多點校正后，進行色譜峰匹配，計算相似度，結果見表2。8批次左歸降糖益腎方樣品色譜圖的相似度均＞0.920，表明不同批次樣品之間的差異較小，共有成分基本一致，8批次左歸降糖益腎方質量較穩定。

2.5? 含量方法學考察

2.5.1? 線性關系考察? 精密量取等體積“2.1”項下對照品貯備液搖勻，得到4種成分的系列濃度混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和線性范圍，取對照品溶液進行稀釋，分別按信噪比為10∶1和3∶1時的進樣量計算定量限和檢測限。詳見表3。

2.5.2? 精密度試驗? 取左歸降糖益腎方供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，以馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀等色譜峰為參照峰，計算峰面積和保留時間的RSD值，各特征峰保留時間RSD分別為0.45%、0.56%、0.52%、0.42%，峰面積RSD分別為1.86%、1.62%、0.98%、1.29%。表明儀器精密度良好。

2.5.3? 穩定性試驗? 取同一左歸降糖益腎方供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件，分別于制備后的0、2、4、6、8、10、12 h進樣檢測，以馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀等色譜峰為參照峰，計算峰面積和保留時間的RSD值，各特征峰保留時間RSD分別為0.54%、0.65%、0.60%、0.49%，峰面積RSD分別為2.41%、1.80%、1.73%、1.56%。表明供試品溶液12 h內穩定性良好。

2.5.4? 重復性試驗? 取同一批左歸降糖益腎方凍干粉末約1 g（6份），按“2.1”項下供試品溶液制備方法進行供試品溶液制備，按“2.2”項下色譜條件進行檢測，以馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀等色譜峰為參照峰，計算相對峰面積和相對保留時間的RSD值，各特征峰相對保留時間RSD分別為0.65%、0.61%、0.53%、0.41%，相對峰面積RSD分別為2.78%、1.74%、2.40%、2.16%，說明方法重復性良好。

2.5.5? 加標回收試驗? 取同一批已知含量的左歸降糖益腎方凍干粉末1 g，平行9份，精密稱定，按已知成分含量的50%、100%、150%加入相應量對照品，按“2.1”方法制備供試品溶液后，按“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積并計算馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的加標回收率。結果顯示，4種成分的平均加樣回收率在101.04%～105.00%之間，RSD在1.92%～3.81%之間（n＝9），表明該方法的準確度較好，結果見表4。

2.5.6? 樣品含量測定? 分別取8批次（S1～S8）左歸降糖益腎方凍干粉末適量，按“2.1”項下方法制備樣品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算樣品中馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的含量，結果見表5。

3 討論

DKD是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發癥之一，是終末期腎衰竭的主要原因。據報道，到2035年，全球糖尿病患者人口估計將達到5.29億。有30%～40%的患者可能發生DKD[16]。目前，DKD的主要治療方法主要集中在血壓、血脂和血糖控制，改變生活方式，尚無有效的DKD治療策略[17]。中醫學將DKD歸為“消渴”“水腫”等范疇，病機在于腎元虧虛、毒損腎絡，故治以活血、化瘀、益氣滋陰為主[18]。左歸降糖益腎方作為控制DKD癥狀的有效中藥復方[19]，組方中黃芪具益氣、免疫調節之功效，其廣泛用于糖尿病及其代謝綜合征的治療，特別是DKD的治療。多項臨床實驗表明，黃芪可顯著降低DKD患者的血糖、蛋白尿和血清肌酐等水平[20]，其活性成分黃芪甲苷在體內外具有多種藥理活性，包括抗氧化應激、抗炎、抗糖尿病和腎臟保護等作用[21-22]。熟地黃味甘，微溫，歸肝、腎經，具有補血養陰、益精填髓等功效。臨床證明熟地黃具有抗氧化、降血糖及減少骨丟失等作用[23]，因此，其被廣泛應用于治療DKD，其藥效成分地黃苷D、梓醇可降低糖尿病模型動物的高血糖水平[24-25]。黃連性味苦、寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經，能清熱燥濕、瀉火解毒。研究表明，黃連中的多種生物堿能夠減少肝臟糖異生，其藥效成分小檗堿、藥根堿能抑制磷酸化酶、６-磷酸果糖激酶和果糖雙磷酶催化，可降低糖化血清蛋白及糖化血紅蛋白，顯著降低空腹及餐后血糖[26]。此外，小檗堿還具有改善胰島素抵抗、降血脂、降血壓、降低蛋白尿、減少尿白蛋白排泄，保護腎功能的功效[27]。酒山茱萸中馬錢苷、莫諾苷對足細胞凋亡具有保護作用，馬錢苷還可改善腎臟病變及纖維化[28]。

本研究嘗試使用水煎煮液直接進行分析，但是結果發現液相色譜峰極性太大且譜峰高從而干擾到其他色譜峰檢測等問題，故采用提取溶劑（不同濃度的甲醇溶液）進行分析，發現使用甲醇溶液進行提取譜圖基線較平穩、色譜峰保留時間適中。進一步對供試品溶液的制備條件，對流動相（乙腈-甲酸水、甲醇-甲酸水）、梯度洗脫程序、紫外吸收波長、色譜柱型號等條件進行考察，最終確定了最佳實驗條件。在最優分析條件下，建立了左歸降糖益腎方HPLC指紋圖譜，在8個批次樣品中共標定了21個共有峰，指認了其中的9個色譜峰，8批次指紋圖譜的相似度大于0.920，表明各批次樣品所含成分相似、質量穩定均一。

中藥的物質基礎是揭示中藥作用本質的關鍵，更是解決中藥質量控制難題的根本保證。但考慮到左歸降糖益腎方的制備工藝為水煎煮，且經過甲醇提取后進行分析，因此，擇各藥味中具有特征性的水溶性成分作為質量指標進行測定。研究發現，組方中馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀色譜峰分離度較好，且可以準確定量。故研究它們作為含量測定指標。本研究采用HPLC技術建立了同時測定左歸降糖益腎方中馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀中4種藥效成分含量的分析方法，并進行了方法學驗證：馬錢苷、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的線性范圍分別為50.49～370.25、32.25～48.06、127.01～330.43、66.90～134.20 μg·mL-1，表明線性關系良好；加樣回收率分別為105.00%、92.01%、100.64%、101.04%；含量測定結果顯示8批次左歸降糖益腎方中4種成分平均含量分別為（183.93±9.55）、（42.64±4.77）、（198.01±9.49）、（96.36±9.00） μg·mL-1。本研究建立的指紋圖譜及含量測定方法重復性好、靈敏度高，能較全面、準確地分析左歸降糖益腎方的化學成分，該方法的建立有利于進一步研究該復方藥效物質基礎，指導臨床合理用藥以及為后期實驗研究提供參考依據，在一定程度上能有效提高左歸降糖益腎方的質量控制水平。黃芪與熟地黃作為該組方的君藥，由于黃芪皂苷類成分紫外光譜為末端吸收，不適于在紫外檢測器下檢測，地黃苷D含量較少且該組方藥味較多、成分復雜，其受其他藥味干擾較大，故本研究并未對以上成分進行含量測定，后期將會考慮采用蒸發光檢測器對相關成分進行含量測定。

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（本文編輯? 蘇? 維）