辛硫磷澆潑溶液體外透皮效果研究及臨床藥效試驗

王 方，王曉宇

(沈陽偉嘉生物技術有限公司，遼寧 沈陽 110000)

辛硫磷，又稱“肟硫磷” “克辛” “倍氰松”[1]，是一種廣譜、低毒、高效、低殘留的有機磷農藥[2，3]，是比較理想的驅蟲藥品種之一。辛硫磷對害蟲具有較強的殺傷作用，具有環(huán)保、成本低、低毒性和高效的原則，如天牛干性害蟲等，其防治作用主要來源于對害蟲的直接胃毒性、觸殺性及黑暗條件下殘效長特性[4]。隨著辛硫磷在制劑技術的發(fā)展與進步，辛硫磷澆潑劑研制成功，規(guī)模生產成本降低，辛硫磷在市場上需求量日益增加。辛硫磷澆潑可以通過皮膚滲透給藥，滲透藥量能夠保證驅蟲效果，通過皮膚給藥途徑的藥物不需要破壞通過胃腸道的消化液，生物利用度有所提高，同時避免了肝臟首過效應。澆潑劑還具有動物保定容易、給藥方便、對動物刺激小等優(yōu)點，該劑型是草原放牧條件下對群體牛防治寄生蟲的理想劑型[5]。

辛硫磷澆潑劑具有殺蟲效果好，毒性弱、殺蟲范圍廣、藥效持久等特點，對害蟲有強觸殺及胃毒作用。目前大量研究表明，辛硫磷澆潑劑對于豬疥螨病、牛皮蠅、癩皮病、羊螨病等家畜各種體表外寄生蟲病有較好的殺滅和治療效果。殺滅周圍環(huán)境的蠅、蚊、虱、蜱、蟑螂、臭蟲等[6]。澆潑劑的使用以涂擦、澆注等方式作用于畜體皮膚或采用浸浴的辦法，環(huán)境殺蟲采用噴灑施藥。但目前市面上的辛硫磷澆潑劑透皮性能較差，刺激性強，難以有效殺滅寄生在動物皮下的寄生蟲。

透皮吸收促進劑是指能夠滲透進入皮膚降低藥物通過皮膚阻力的材料，可以輔助藥物穿過角質層、擴散通過皮膚，由毛細血管進入體循環(huán)，達到局部用藥全身起效的作用，發(fā)揮全身系統(tǒng)治療作用。目前，市場上新型透皮制劑也很多，如復方左旋咪唑、阿維菌素、伊維菌素、環(huán)丙沙星等，對于各類體內及體表的寄生蟲均有驅殺效果。為了突破某些動物皮厚毛多的皮膚屏障結構，在獸藥的研發(fā)過程中透皮吸收促進劑是一種尤為重要的劑型，需要利用目前研究比較先進的微乳技術、脂質體、納米粒等透皮制劑技術，研發(fā)透皮制劑的關鍵是解決藥物的透皮問題。

本研究以辛硫磷為原料藥，結合透皮吸收促進劑，制備出高皮膚滲透性辛硫磷澆潑劑，初步評價了其體外透皮效果和臨床治療效果。本研究首先以體外皮膚累計滲透量為指標，采用Franz 擴散池法建立鼠透皮試驗模型[7]，運用高效液相色譜法(HPLC) 測定透過液中辛硫磷的含量，評價本公司辛硫磷澆潑劑產品(浴舒嘉) 透皮效果，并與市售普通40%辛硫磷澆潑溶液進行比較，試驗結果顯示本公司產品浴舒嘉具有良好的透皮效果，且臨床藥效試驗結果顯示產品性能更優(yōu)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品與試劑 辛硫磷標準品(北京德威鈉生物技術有限公司)、40%辛硫磷澆潑溶液(商品名為浴舒嘉，批號20040801)、市售普通40%辛硫磷澆潑溶液液(批號2371101)、色譜甲醇，色譜乙腈、異丙醇(天津市康科德科技有限公司)、生理鹽水。

1.1.2 試驗儀器 TP - 6 智能透皮擴散儀(天津精拓儀器科技有限公司)； 電子天平(FA-1104 型，上海民橋精密科學儀器有限公司)； 高效液相色譜儀(LC -10AD 型，大連依利特分析儀器有限公司)； 超聲波清洗儀器(DL-180 型，寧波新芝生物科技股份有限公司)； 高速臺式離心機(TGL -16G 型，上海安亭科學儀器廠)； 循環(huán)水多用真空泵(西安太康生物科技有限公司)。

1.1.3 試驗動物 健康昆明種雄性小鼠20只，體重18 ～24 g (遼寧長生生物技術有限公司)； 母豬80 頭，體重50 ～80 kg。

1.1.4 辛硫磷體外高效液相色譜法(HPLC)分析方法學建立

標準曲線的建立: 精密稱取辛硫磷對照品，配置質量濃度為0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5 和5.0 mg?mL-1的梯度對照品溶液，進行高效液相色譜檢測，于260 nm 紫外波長處測定吸光度值(A)，建立質量濃度(C) 與吸光度(A) 的標準曲線。

精密度試驗: 精密稱取辛硫磷對照品，配制成濃度為0.05，0.5 和5.0 mg?mL-1的梯度溶液，按5 次/d 統(tǒng)計日內誤差； 同法1 次/d測定5 d，統(tǒng)計日間誤差。

回收率試驗: 精密稱取辛硫磷對照品，配制成濃度為0.05，0.5 和5.0 mg?mL-1的梯度溶液，每組設置5 個平行組別，進行高效液相色譜檢測，于260 nm 紫外波長處測定吸光度值，與標準曲線的計算數(shù)值對比統(tǒng)計各梯度濃度回收率平均值及RSD 值。

1.2 試驗方法

1.2.1 體外透皮試驗

離體鼠皮的制備: 取昆明系小鼠，斷頸處死后，立即刮凈腹部毛發(fā)，剪取腹部皮膚，將取下的皮膚小心去除結締組織、皮下脂肪層，用生理鹽水沖洗，沖洗干凈后放置于盛有生理鹽水的容器中，放置在4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆茫囼炃靶枰匀唤鈨觯⒔菰谏睇}水中0.5 h，解凍后在1 周內進行試驗。每次試驗前仔細檢查鼠皮是否完整，保證不存在任何劃痕和破損。

陰性干擾試驗: 鼠皮膚固定于擴散池中，并按角質層向上放置。各加入等量的接收液，試驗24 h 取出100 μL 接收液更換為等體積的標準品、空白接收液、空白接收液＋標準品[8]以考察接收液對本試驗的影響。

體外透皮擴散試驗: 采用Franz 擴散池，接收池的有效滲透面積2.58 cm2，將處理好的小鼠皮膚用剪刀剪裁成適合尺寸，置于擴散池與接收池之間，用夾子固定，皮膚的真皮層要與接收液接觸，需要將氣泡排除，接收液為異丙醇: 生理鹽水(50/50，v/v) 17.8 mL，擴散池中分別加入浴舒嘉、市售普通40%辛硫磷澆潑溶液各3 mL，裝置恒溫水浴中 (37 ±1)℃，磁力攪拌轉速為350 r/min，于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 分別取樣0.5 mL，并隨即補充相同體積、相同溫度、相同組成的接收液。各時間點的接收液經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm) 過濾，40 μL 進樣，試驗重復3 次。計算單位面積的累積滲透量 (Q，mg/cm2)。

式中，Q: 單位面積累積透過量(mg/cm2)；A: 有效經(jīng)皮吸收面積(cm2)；V: 接收液體積(mL)；V0: 取樣體積(mL)；Cn: 為第n個取樣點測得的接收液中藥物濃度(mg/mL)；Ci為第i(i≤n-1) 個取樣點測得的接收液中藥物的濃度(mg/mL)。

按下式計算透過百分率Q%:

式中，QT: 供給室加入的總藥量； Qt: t時刻的藥物累積透過量。

1.2.2 臨床藥效試驗

試驗動物分組及試驗方法: 將感染豬疥螨的60 頭后備母豬隨機分為3 組 (A、B、C組)，每組20 頭； 把無寄生蟲感染的健康后備母豬20 頭作為健康空白對照組(D 組)； 各組分欄飼養(yǎng)，詳見表1。

表1 試驗動物分組

體表寄生蟲檢查: 在用藥前以及治療后的1、7、14、21、28 d 進行樣本采集，從每頭豬的四肢及耳郭內側有明顯病變處(每處4 cm2)采集樣本。在刮取樣本時，先將采樣處用純化水濕潤后用鈍刀刮，然后收集刮取物。在有水的平皿中分別加入刮取物樣本，搗爛并混勻，放置在顯微鏡下，觀察螨蟲狀態(tài)并記錄好感染豬頭數(shù)。療效觀察: 每天觀察用藥后各組豬的臨床癥狀，并做好結果記錄。判斷該藥物療效通過計算用藥后轉陰率: 轉陰率＝(用藥前陽性豬頭數(shù)-用藥后陽性豬頭數(shù)) /用藥前陽性豬頭數(shù)×用藥前陽性豬頭數(shù)。

2 結果與分析

2.1 辛硫磷高效液相色譜法(HPLC) 分析方法的建立

2.1.1 色譜條件的確定 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈一水(70∶30) 為流動相，檢測波長為260 nm，流速1 mL/min，進樣量40 μL，柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按辛硫磷峰計算應不低于5 000，辛硫磷主峰與雜質峰的分離度應符合要求[9，10]。

2.1.2 標準曲線的建立 精密稱定辛硫磷標準品適量，用乙腈溶解并稀釋至10 mg/mL 標準儲備溶液。再分別配成濃度為0.01，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5，5.0 mg/mL 的系列對照品溶液。分別吸取上述溶液40ul 進樣，測定，以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度(mg?mL-1) 為橫坐標(X)，按最小二乘法進行線性回歸得標準曲線方程y＝10 457x＋294.54，R2＝0.999 8。試驗結果表明: 辛硫磷濃度在0.01 ～5.0 mg?mL-1與峰面積呈良好的線性關系。結果詳見表2 和圖1。

圖1 辛硫磷HPLC 標準曲線

表2 辛硫磷HPLC 標準曲線試驗結果(n ＝3)

2.1.3 精密度試驗 試驗所得辛硫磷溶液日內日間精密度結果見表3。本法精密度良好，符合方法學要求。

表3 辛硫磷HPLC 日內日間精密度試驗結果(n ＝3)

2.1.4 回收率試驗 取 0.05，0.5 和5.0 mg?mL-1的辛硫磷溶液，測定其回收率(n＝3)，根據(jù)標準曲線方程，計算濃度及回收率。結果表明，回收率試驗符合方法學要求。試驗結果見表4。

表4 辛硫磷HPLC 回收率試驗結果(n ＝3)

2.2 體外透皮試驗結果

2.2.1 陰性干擾試驗 結果表明，在空白接收液辛硫磷出峰位置無干擾峰，分析條件可行，相關色譜圖見圖2。

圖2 體外透皮試驗接收液HPLC 色譜

2.2.2 體外透皮試驗結果 根據(jù)方法1.2.1.3計算，浴舒嘉、市售普通40%辛硫磷澆潑溶液兩個產品在0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 的累積透過量及透過率，結果見表5、表6。

表5 浴舒嘉體外透皮試驗結果(n ＝6)

表6 市售普通40%辛硫磷澆潑溶液體外透皮試驗結果(n ＝6)

應用Franz 擴散池法對比40%辛硫磷澆潑溶液(浴舒嘉)、市售普通40%辛硫磷澆潑溶液的體外透皮效果表明，由兩種辛硫磷澆潑劑皮膚累積滲透量數(shù)據(jù)(表5、表6) 和累積滲透曲線(圖3) 可知，本公司40%辛硫磷澆潑溶液產品(浴舒嘉) 24h 皮膚累積透過量是市售普通40%辛硫磷澆潑溶液的累積透過量的95 倍，表明本公司產品40%辛硫磷澆潑溶液(浴舒嘉) 透皮性能明顯優(yōu)于市售普通40%辛硫磷澆潑溶液。

圖3 40%辛硫磷澆潑透皮制劑體外皮膚累積滲透量曲線

2.3 臨床藥效試驗

2.3.1 臨床觀察 試驗期間，各試驗組母豬未出現(xiàn)中毒、過敏等毒副反應癥狀，各試驗組母豬采食飲水、精神狀態(tài)、排便、給藥部位均正常。

2.3.2 試驗結果 試驗結果顯示，使用40%辛硫磷澆潑溶液(浴舒嘉) 試驗組驅蟲后第28 d，試驗豬體表寄生蟲轉陰率為100%，使用市售普通40%辛硫磷澆潑溶液試驗組在驅蟲后28 d，試驗豬體表寄生蟲轉陰率為75%，表明浴舒嘉對豬疥螨感染具有良好的療效，且其效果優(yōu)于市售普通40%辛硫磷澆潑溶液。治療14 d 后，治愈率可達到85%，21 d 治愈率100%。詳見表7。

表7 各試驗組體表寄生蟲檢查結果

3 結論

從本試驗結果看，40%辛硫磷澆潑溶液經(jīng)皮膚外用給藥，滲透到皮下組織的藥量能夠保證驅蟲效果，經(jīng)皮膚涂抹和噴灑給藥途徑，藥物不需要通過胃腸道消化液的破壞，不經(jīng)過口腔黏膜吸收對黏膜的損害，通過試驗測定回收率和透過率，顯示辛硫磷澆潑溶液有提高藥物的生物利用度的作用，也避免了肝臟首過效應，降低藥物的不良反應發(fā)生率，尤其是規(guī)模化養(yǎng)殖和群體飼養(yǎng)家畜在防治寄生蟲疾病上的首選藥劑。2000 年以來，透皮給藥制劑技術研究的迅速發(fā)展，突破了傳統(tǒng)體外經(jīng)皮滲透給藥的觀念，以皮膚作為媒介，在產品研究開發(fā)過程中加入適當?shù)耐钙の沾龠M劑，能夠輔助藥物穿過角質層、促進通過批復擴散，由毛細血管將藥物輸入體內進入體循環(huán)，使藥物發(fā)揮治療的作用。目前，外用藥劑經(jīng)透皮給藥普遍存在療效差的問題，主要問題是通過透皮給藥途徑，批復對藥物透析的效果不明顯，藥物吸收的生物利用度差等原因導致，這也是經(jīng)皮外用給藥系統(tǒng)研究技術的關鍵。本公司開發(fā)的40%辛硫磷澆潑溶液(浴舒嘉)，通過體外透皮試驗方法評價，其透皮性能明顯提高，對豬疥螨感染具有良好的療效，治療14 d 后，治愈率可達到85%，21 d 治愈率100%，且優(yōu)于市售普通40%辛硫磷澆潑溶液； 并通過臨床藥效試驗證明浴舒嘉可發(fā)揮高效的驅蟲作用，對治療豬疥螨等體外寄生蟲感染具有廣闊應用前景。