遼寧某規(guī)模化豬場豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

王洪奎

(阜新蒙古族自治縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧 阜新 123125)

豬巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的急性流行性或散發(fā)性和繼發(fā)性傳染病，又叫豬肺疫。豬巴氏桿菌病根據(jù)臨床癥狀可分為急性型和慢性型2 類。急性型多以出血性敗血性病變、咽喉腫脹發(fā)炎和肺部充血、水腫、炎癥等為主要臨床表現(xiàn)，慢性病例多發(fā)病緩慢，主要表現(xiàn)為呼吸苦難，慢性肺炎，個別可見關節(jié)炎癥狀，且其常與豬瘟等混合感染，嚴重的可引起豬只死亡，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大[1，2]。

近日，遼寧某規(guī)模化豬場部分豬發(fā)病，病豬體溫升高，可達40 ～41 ℃，精神沉郁，食欲減少或不食，干咳，部分豬鼻孔流出漿性或膿性分泌物，呼吸困難，張口呼吸，結膜發(fā)紺，皮膚表面有大小不一致且形狀不規(guī)則的紅色斑塊，少數(shù)豬輕微腹瀉，部分豬于發(fā)病7 日內(nèi)死亡。剖檢死亡病豬后，可見咽喉部紅腫發(fā)炎，黏膜充血、水腫，胸腔與肺臟黏連，胸腔積液，肺充血、水腫，部分壞死，脾臟表面有散在出血點，輕微腫大。綜合臨床癥狀、剖檢變化及流行病學情況，疑似為巴氏桿菌引起。為進一步確診，現(xiàn)場采集病豬肺臟、淋巴結等組織樣品，對致病菌進行分離鑒定，同時進行藥物敏感性試驗，以期對臨床上該類疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 普通營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，LB 培養(yǎng)基，革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。DNA marker DL2000，TaKa-Ra Ex Taq DNA Polymerase (含dNTP Mixture)購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。細菌基因組DNA 提取試劑盒購于生工生物工程(上海) 股份有限公司。甲醇、無水乙醇、三氯甲烷等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自于北京六一儀器有限公司； c300 凝膠成像系統(tǒng)，購自于江蘇捷達科技有限公司； 電泳儀Power-Pac HC、電泳槽 GT1704482、T100 Thermal Cycler PCR 儀，購自于美國伯樂有限公司； 無菌工作臺，購自于青島海爾公司。

1.1.3 病料及實驗動物 豬場發(fā)病死亡豬2頭，剖檢后無菌采集肺臟組織樣品，-20 ℃保存待檢。SPF 級昆明小鼠20 只，雌雄各半，購自于沈陽長生實驗動物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 將病料組織樣品涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察。用接種環(huán)取單菌落，進一步劃線培養(yǎng)純化。同時挑取單個菌落在LB 培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌株進行革蘭染色鏡檢，觀察菌體染色特性及形態(tài)。

1.2.2 生化鑒定 參考生化試驗試劑說明書，將分離菌培養(yǎng)物接種于各生化反應管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結果。

1.2.3 細菌16S rRNA 基因序列分析 使用16 sRNA 通用引物進行普通PCR 擴增，上下游引物分別為5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3′和5′ GGCTACCTTGTTACGACTT 3′，引物由生工生物公司進行引物合成。擴增條件: 95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，退火溫度52 ℃，退火時間30 s，72 ℃延伸1.5 min，共34 個循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。然后取5 μL PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察結果，同時將PCR 產(chǎn)物送往上海生工生物公司進行測序。測序結果與NCBI 中已發(fā)表的基因序列進行同源性比對。

1.2.4 致病性試驗 無菌條件下挑取普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的單個菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h。取20 只健康的SPF 級小鼠，隨機分為試驗組和對照組，每組10 只。對試驗組小鼠腹腔注射0.2 mL 含有1 × 108個細菌的菌液，對照組小鼠注射等體積的LB 液體培養(yǎng)基，逐日觀察小鼠發(fā)病死亡情況。并對死亡小鼠及未死亡小鼠分別進行剖檢，觀察記錄小鼠各個組織病變情況，同時取病變臟器進一步分離病原菌。

1.2.5 藥敏試驗 采用紙片擴散法進行藥敏試驗。挑取瓊脂平板培養(yǎng)基上的單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h，取100 μL 菌液分點滴加在瓊脂平板上，應用玻璃棒均勻涂布于培養(yǎng)基上，將常用抗菌藥物藥敏紙片貼在平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈是否出現(xiàn)并測定其直徑。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

分離菌在普通瓊脂平板上生長出灰白色菌落，表面光滑且較為濕潤、邊緣整齊。血平皿上生長出灰白色菌落，表面光滑且較為濕潤、邊緣整齊且沒有溶血現(xiàn)象(圖1)。挑取單菌落至于載玻片上，進行革蘭氏染色。染色后將載玻片置于油鏡下觀察，鏡下可見本次分離菌株呈淡紅色、兩端鈍圓的短桿狀，為革蘭陰性菌(圖2)。

圖1 分離菌平板培養(yǎng)基菌落形態(tài)

圖2 分離菌革蘭氏染色結果(1 000 ×)

2.2 生化鑒定

生化試驗結果表明，本次分離菌株可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。對乳糖、鼠李糖、肌醇不發(fā)酵。可生成靛基質，甲基紅和VP 試驗陰性，不液化明膠(表1)。

表1 分離菌的生化鑒定結果

2.3 細菌16S rRNA 基因序列分析

菌液PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳結果顯示，擴增出預期1 420 bp 的單一條帶(圖3)。將目標片段測序后，通過BLAST 工具將其結果進行在線比對，結果顯示該序列與GenBank 中多殺性巴氏桿菌的核苷酸序列相似程度最高，同源性大于99.9%。

圖3 分離菌16S rRNA PCR 結果

2.4 動物試驗

分離菌菌液接種小鼠8 h 后，試驗組小鼠開始出現(xiàn)不同程度的臨床表現(xiàn)。主要表現(xiàn)為運動遲緩、食欲不振、呼吸急促、體溫升高等癥狀，36 h 后全部死亡，對照組小鼠全部正常。無菌采集小鼠肺臟，均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，鏡檢及菌液16S rRNA PCR 鑒定表明，試驗組小鼠肺臟中分離出的菌株為多殺性巴氏桿菌。

2.5 藥敏試驗

由表2 可知，本次分離的菌株對氟苯尼考、卡那霉素、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、多西環(huán)素敏感，對環(huán)丙沙星中介，對頭孢氨芐、克拉霉素、丁胺卡那、紅霉素、頭孢唑林耐藥。可推薦養(yǎng)殖場選擇使用氟苯尼考等藥物進行臨床治療。

表2 分離菌藥敏試驗結果

3 討論

多殺性巴氏桿菌是一種可引起多種畜禽疾病的革蘭氏陰性致病菌，可導致牛出血性敗血癥、禽霍亂等，在豬可引起豬肺疫和豬萎縮性鼻炎等。結合本次細菌分離培養(yǎng)、生化實驗和PCR 鑒定結果，初步確診該豬場發(fā)病為豬巴氏桿菌病，通過對臨床分離菌進行藥敏試驗，表明氟苯尼考、氧氟沙星等藥物對臨床分離菌株敏感，推薦養(yǎng)殖場采用上述藥物進行防治，3 ～5 d后豬群整體發(fā)病率得到了控制，發(fā)病豬只臨床癥狀也得到了控制，15 d 后豬場疾病得到了控制，取得了不錯的效果。

巴氏桿菌擁有莢膜、脂多糖、菌毛和黏附素等多種毒力因子，根據(jù)莢膜類型可將其分為莢膜A 型、莢膜B 型、莢膜D 型、莢膜E 型和莢膜F 型等5 種血清型。豬巴氏桿菌肺炎(豬肺疫) 主要由莢膜A 型引起，臨床癥狀根據(jù)病程的不同可分為多種病型，主要表現(xiàn)為呼吸困難、氣喘等，病情重時剖檢可見胸膜與病肺黏連，胸腔及心包積液。我國是畜牧業(yè)大國，生豬存欄量居世界前列，豬巴氏桿菌病在豬群中常年存在，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。李敏研究表明，豬巴氏桿菌病在成都市發(fā)病率約為8.97%，而李永剛的研究證實豬巴氏桿菌病發(fā)病率為3.27%，病死率高達54.72%[3，4]。臨床上針對該病的防控重點是疫苗免疫，國內(nèi)部分規(guī)模化豬場采用豬肺疫弱毒苗進行免疫，收到了不錯的預防效果。近期韋存莉嘗試推廣應用豬瘟、豬丹毒、豬巴氏桿菌病三聯(lián)疫苗對豬只進行免疫，起到了很好地預防效果。三聯(lián)苗不僅有效地降低豬巴氏桿菌病的發(fā)病率，同時也對豬瘟、豬丹毒起到了很好地預防作用。同時在豬場實行自繁自養(yǎng)、堅持標準化生產(chǎn)流程，采用免疫為主、綜合防控為輔的原則，對上述疾病防控取得了顯著效果[5]。2022 年6月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第573 號公告對原?一、二、三類動物疫病病種名錄? 進行修訂，將巴氏桿菌病由之前的二類疫病修改為三類疫病，但這并不代表巴氏桿菌病對畜禽養(yǎng)殖業(yè)的危害在逐年減小，反而應該更加引起畜牧獸醫(yī)工作者對該類疾病防控的重視。近年來隨著分子生物學、細胞生物學技術的不斷發(fā)展，巴氏桿菌病的臨床診斷技術也在不斷發(fā)展，多種敏感性高、特異性強的診斷技術不斷涌現(xiàn)，可以實現(xiàn)快速、精準的診斷，從而提升了對該類疾病的防控水平。李偉杰等[6]也在2018 年修訂了?豬巴氏桿菌病診斷技術? 行業(yè)標準，該標準的修訂也將為豬巴氏桿菌病診斷技術的提升起到積極的促進作用。