基于SRAP分子標(biāo)記的春大豆雜交種核心親本雜種優(yōu)勢群劃分

韓博文 姜 楠 楊緒磊 林春晶 彭 寶 趙麗梅 吳松權(quán) 張春寶*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 大豆研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜交大豆育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春 130033)

大豆(Glycinemax(L.) merr.)是我國重要的油料、糧食及飼料作物,營養(yǎng)價(jià)值豐富,應(yīng)用領(lǐng)域廣闊[1]。隨著近年來社會經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,我國對大豆的需求日益增高,然而國內(nèi)大豆種植面積和產(chǎn)量均有所下降,嚴(yán)重依賴國外進(jìn)口。根據(jù)海關(guān)總署公開數(shù)據(jù),2020年,我國大豆進(jìn)口量首次突破1億t;2022年中央一號文件提出加力擴(kuò)種大豆油料,這使得大豆種植面積創(chuàng)下了1958年以來新高,進(jìn)口量降至9 108萬t,但我國大豆對外依存度仍然在80%以上的高位。由于我國耕地資源有限,提高單位面積產(chǎn)量是提升大豆產(chǎn)能的有效出路。雜種優(yōu)勢利用是快速提高作物單產(chǎn)的有效途徑,已在水稻、玉米、高粱和棉花等多種作物的品種選育中獲得成功[2-4]。大豆同樣具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢,開展雜交大豆方面的研究對于提升大豆單產(chǎn)具有重要意義。我國從20世紀(jì)八十年代就開始大豆雜種優(yōu)勢利用研究,于2002年審定了世界上第一個(gè)大豆雜交種‘雜交豆1號’,在區(qū)域試驗(yàn)中較對照平均增產(chǎn)21.9%[5],目前已審定的雜交大豆品種近40個(gè),區(qū)試增產(chǎn)幅度達(dá)5.3%～22.7%,大豆雜種優(yōu)勢的利用對增產(chǎn)效果明顯[6]。

親本資源是雜交種選育的基礎(chǔ),然而在眾多材料中選擇適合的親本并配制強(qiáng)優(yōu)勢雜交組合,是雜交種選育考慮的首要問題,關(guān)系到其產(chǎn)出效率[7]。雜種優(yōu)勢群理論由Melchinger等[8]提出,指來自相同或不同群體的一組相關(guān)或不相關(guān)基因型,當(dāng)與其他遺傳背景不同的種質(zhì)群的基因型雜交時(shí),能表現(xiàn)出相似的配合力和雜種優(yōu)勢。雜種優(yōu)勢群理論已在玉米、油菜和小麥等作物中被廣泛應(yīng)用[9-11],其主要?jiǎng)澐址椒ㄓ斜硇途垲惙秩悍ā⑴浜狭Ψ秩悍ā⒎肿訕?biāo)記聚類分群法等[12]。白志元等[13]利用64對SSR分子標(biāo)記將68份雜交大豆親本中的恢復(fù)系和保持系分別聚為兩大類5個(gè)亞類,并發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與地理來源具有一定相關(guān)性。雷蕾等[14]利用14個(gè)產(chǎn)量性狀相關(guān)SSR分子標(biāo)記將30個(gè)已審定雜交大豆品種的43份親本分為2個(gè)類群,其中25個(gè)雜交種的親本分屬于2個(gè)類群。

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)能準(zhǔn)確地分析大豆材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系,但利用其對雜交大豆親本進(jìn)行優(yōu)勢群的劃分鮮見報(bào)道。本研究利用條帶清晰、多態(tài)性好的12對SRAP分子標(biāo)記組合,對東北三省春大豆區(qū)育成的100份核心親本進(jìn)行遺傳多樣性評價(jià)和親緣關(guān)系劃分,并利用已審定的10個(gè)強(qiáng)優(yōu)勢雜交種的親本進(jìn)行雜種優(yōu)勢群驗(yàn)證,旨在明確雜交大豆核心親本的遺傳多樣性特點(diǎn)及群體結(jié)構(gòu),以期為春大豆雜交種親本的遺傳改良及雜交組合配制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料

所用材料包括來源于中國(東北三省)、美國和意大利的49份不育系的同型保持系與51份恢復(fù)系,共100份雜交大豆親本材料(表1),均為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜交大豆研究團(tuán)隊(duì)選育及保存。所有試驗(yàn)材料種植于吉林省長春市范家屯鎮(zhèn)雜交大豆核心育種基地(124°83′ E, 43°43′ N)。

1.1.2SRAP引物

使用8個(gè)正向引物和6個(gè)反向引物(表2),共計(jì)48種組合,通過前期篩選獲得條帶清晰,多態(tài)性好的12種組合。本研究利用上述引物組合進(jìn)行100份親本材料的多態(tài)性分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取和PCR

從田間剪取親本材料的二節(jié)期(V2)葉片,共100份,液氮研磨后,使用CTAB法[21]提取DNA。經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn),條帶清晰無拖尾,符合SRAP試驗(yàn)要求,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠?2種SRAP引物(表3)組合對親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中DNA 模板2.0 μL,正向反向引物各0.5 μL(10 μmol/L),dNTPs 0.5 μL(10 mmol/L,北京鼎國),10×PCR buffer 2.5 μL(北京鼎國),Taq酶0.5 μL(2 U/μL,北京鼎國),ddH2O 18.5 μL。DNA擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。利用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后,使用ABI PRISM 377 sequencer測序儀檢測SPAP多態(tài)性結(jié)果,通過GENESCAN軟件進(jìn)行分析,在70～500 bp片段的DNA Marker范圍內(nèi),每2個(gè)堿基讀數(shù)1次,并記錄最終條帶數(shù)據(jù)。

表3 SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性分析結(jié)果Table 3 SRAP molecular marker polymorphism analysis results

1.2.2數(shù)據(jù)處理

雙邊匹配是研究由不可分對象構(gòu)成的兩不相交集合中主體的相互匹配過程，起源于Gale等[1]對學(xué)生入學(xué)和婚姻匹配問題的研究，該文開啟了雙邊匹配研究的先河，奠定了雙邊匹配的理論基石。現(xiàn)實(shí)社會中存在著大量的雙邊匹配問題，如勞動力市場中的員工與崗位匹配[2]、金融市場中的風(fēng)險(xiǎn)投資匹配[3]、電子商務(wù)中的買賣交易匹配[4]、供應(yīng)鏈管理[5]及知識服務(wù)[6]中的供需匹配等。由此可見，深入研究雙邊匹配問題具有十分重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,將有條帶的位點(diǎn)標(biāo)記為1,無條帶的位點(diǎn)標(biāo)記為0,轉(zhuǎn)化為0、1矩陣。使用NTsys2.10e軟件,計(jì)算遺傳相似系數(shù)(genetic similarity,GS),利用算術(shù)平均非加權(quán)方法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)對親本材料進(jìn)行聚類分析,獲得聚類樹狀圖。利用Popgene 32軟件計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC),公式如下:

式中:Pi為群體中含有第i個(gè)等位變異的比例。主效基因頻率(major alle frequency,MAF)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、基因多樣性指數(shù)(gene diversity,h)、Shannon信息指數(shù)(Shannon’s Information index,I)。根據(jù)SRAP標(biāo)記對100份親本材料分析得到的遺傳相似系數(shù)及分群結(jié)果,利用R語言ggplot 2作主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA),最終將各點(diǎn)PCoA結(jié)果坐標(biāo)繪制在二維平面上,制成散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性分析

利用12對多態(tài)性較好的引物組合,包括Me 1×Em 3、Me 1×Em 5、Me 2×Em 3、Me 2×Em 7、Me 3×Em 3、Me 4×Em 4、Me 5×Em 1、Me 5×Em 8、Me 6×Em 4、Me 6×Em 8、Me 7×Em 5和Me 8×Em 1,對49份保持系和51份恢復(fù)系進(jìn)行多態(tài)性分析(表3)。通過檢測,共擴(kuò)增出2 135條條帶,其中多態(tài)性條帶2 130條,每對引物組合擴(kuò)增出的多態(tài)性譜帶數(shù)為137～204條,平均為178條,多態(tài)性位點(diǎn)百分率平均值高達(dá)99.76%,PIC含量范圍在0.074 0～0.153 7,平均值為0.125 7,按照Botstein等[22]的標(biāo)準(zhǔn),PIC<0.25表明SRAP分子標(biāo)記攜帶信息量較少,100份親本材料間遺傳差異較大。

2.2 100份親本的聚類分析

由表4可知,100份雜交大豆親本材料間的GS在0.329 2～0.637 6,平均GS為0.473 3。GS最小的是來自黑龍江的JLCMS112B和美國材料JLCMS164B,GS最大的是來自美國的JLR60和JLR1。

由圖1可知,在GS為0.450 0處可劃分為I和II兩大類群,在GS為0.460 0處,類群I可劃分為2個(gè)亞群I-1和I-2,在GS為0.480 0處,類群II可劃分為II-1和II-2亞群。第I類群全部為保持系,共49份材料,其亞群I-1中有20個(gè)保持系,群體樣本數(shù)最少,主要以中國東北背景為主,包括有JLCMS103B、JLCMS91B、JLCMS188B、JLCMS9B等17個(gè)保持系,僅含JLCMS42B、JLCMS101B、JLCMS171B這3個(gè)美國背景的保持系;亞群I-2中有29份保持系,包括中國東北的JLCMS185B、JLCMS48B、JLCMS84B等20份保持系以及美國來源的JLCMS199B、JLCMS181B、JLCMS176B等10份保持系。51份恢復(fù)系全部被劃入第II類群,其中亞群II-1有26份恢復(fù)系,包括JLR522、JLR531、JLR12等20個(gè)來源美國的恢復(fù)系,JLR194、JLR192、JLR22等6份來源中國東北的恢復(fù)系;亞群II-2有25份恢復(fù)系,包括JLR46、JLR119、JLR107等來源美國的恢復(fù)系12份,來源意大利的1份為JLR8,來源中國東北的有10份,包括JLR210、JLR547、JLR209等。

GS為0.460 0處的綠色虛線將類群Ⅰ劃分為Ⅰ-1和Ⅰ-2兩個(gè)亞群; GS為0.480 0處的紅色虛線將類群Ⅱ劃分為Ⅱ-1和Ⅱ-2兩個(gè)亞群。The green dotted line at GS 0.460 0 divides group I into two subgroups, I-1 and I-2; The red dotted line at GS 0.4800 divides Group II into two subgroups, II-1 and II-2.圖1 SRAP標(biāo)記對親本材料的UPGMA聚類分析Fig.1 UPGMA cluster analysis of SRAP markers on parent materials

2.3 強(qiáng)優(yōu)勢雜交種親本的群內(nèi)驗(yàn)證

由表5可知,所有母本保持系均來自于類群I,其中3份母本劃入亞群I-1,4份母本劃入亞群I-2;所有父本恢復(fù)系都被劃入類群II,其中3份父本劃入亞群II-1,3份父本劃入亞群II-2,表明10個(gè)強(qiáng)優(yōu)勢雜交種的13份親本均來自本研究劃分的兩大類群。進(jìn)一步對親本來源地信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),所有母本均來源于中國東北的黑龍江和吉林;而所有父本的來源地均為國外,分別是美國和意大利。上述結(jié)果表明,10個(gè)強(qiáng)優(yōu)勢雜交種親本均來自于本研究所劃分的2個(gè)類群,且為中國(♀)×外國(♂)組合,說明通過SRAP分子標(biāo)記劃分的雜種優(yōu)勢類群結(jié)果與地理來源分布基本一致,且不同來源地之間選配有助于充分發(fā)揮大豆雜種優(yōu)勢。從親本間遺傳相似程度分析發(fā)現(xiàn),13份雜交種親本的遺傳相似性差異較大,GS在0.387 9～0.507 5,說明強(qiáng)優(yōu)勢雜交種親本間遺傳多樣性較為豐富。

表5 已審定的10個(gè)強(qiáng)優(yōu)勢雜交種的分群結(jié)果Table 5 Group division results of 10 released strong heterosis hybrids

2.4 100份親本的遺傳多樣性分析

由表6可知,總?cè)旱闹餍Щ蝾l率(MAF)均值為0.927 0,類群I的MAF為0.927 5,其中亞群I-1的MAF為0.926 1,亞群I-2的MAF為0.928 4;類群II的MAF為0.926 6,其中亞群II-1的MAF為0.931 0,亞群II-2的MAF為0.921 7。相較于類群和亞群間的MAF差異不大。總?cè)旱挠行У任换驍?shù)(Ne)為1.156 9,類群I的Ne為1.115 7,其中亞群I-1的Ne為1.159 1,亞群I-2的Ne為1.153 8;類群II的Ne為1.158 2,其中亞群II-1的Ne為1.158 2,亞群II-2的Ne為1.169 3。類群Ⅱ的Ne高于類群Ⅰ,亞群I-1和亞群II-2的等位變異數(shù)更高。總?cè)旱幕蚨鄻有灾笖?shù)(h)為0.135 1,其中類群I的h為0.134 1,其亞群I-1和I-2的h分別為0.136 4和0.132 3;類群II的h為0.135 0,其亞群II-1和II-2的h為分別為0.126 7和0.143 8。類群Ⅰ和Ⅱ的總體基因多樣性相似,其中亞群II-2的基因多樣性豐度高于II-1。總?cè)篒的h為0.260 2,其中類群I的h為0.258 6,其亞群I-1和I-2的h分別為0.261 6和0.255 5;類群II的I為0.260 0,其亞群II-1和II-2的I分別為0.244 3和0.272 6。類群間的I無顯著差異,亞群I-1和II-2的物種多樣性豐度大于亞群I-2和II-1。總?cè)憾鄳B(tài)信息量(PIC)為0.126 2,其中類群I的PIC為0.125 4,其亞群I-1和I-2的PIC分別為0.127 5和0.124 1;類群II的PIC為0.126 8,其亞群II-1和II-2的PIC分別為0.120 2和0.133 9。表明類群I與類群II存在較豐富的遺傳多樣性,4個(gè)亞群中,亞群I-1的遺傳多樣性豐度大于亞群I-2;亞群II-2的遺傳多樣性豐度則大于亞群II-1。

表6 不同群內(nèi)親本材料的遺傳多樣性分析Table 6 Genetic diversity analysis in different populations of parent material

由圖2可知,主坐標(biāo)1(Pco1)和主坐標(biāo)2(PCo2)分別解釋了38.29%和19.96%的群體遺傳變異。通過Pco1坐標(biāo)結(jié)果對100份親本劃分的4個(gè)亞群進(jìn)行分析,其中亞群I-1和I-2重疊位于PCo1為-0.06～0.01,表明2個(gè)亞群間可能存在遺傳親緣的交叉。亞群II-1和II-2重疊位于Pco1在0.00～0.04,2個(gè)亞群間遺傳親緣的交叉更為顯著。這表明雜交大豆親本在改良過程中,存在同一類群內(nèi)的不同亞群間親緣混合的情況。類群Ⅰ與類群Ⅱ的遺傳分布之間幾乎沒有重合,說明2個(gè)類群間遺傳親緣存在差距,并且類群Ⅰ的2個(gè)亞群的遺傳距離分布范圍更廣,散點(diǎn)密集度較小,證明類群Ⅰ的遺傳資源更為豐富。

圖2 100份核心親本材料主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal co-ordinate analysis of one hundred core parent materials

3 討 論

3.1 雜交大豆親本遺傳多樣性

本研究利用SRAP分子標(biāo)記根據(jù)遺傳相似系數(shù)對100份雜交大豆親本材料進(jìn)行了聚類分析,并劃分了兩大類群,即主要由中國東北保持系材料構(gòu)成的類群I和主要來源于美國恢復(fù)系材料的類群II;每個(gè)類群還可進(jìn)一步劃分為2個(gè)亞群。從來源地來看,盡管類群I包含的材料主要來自中國東北,但也有部分美國材料;類群II主要來自美國,但同樣也有部分中國東北材料。李瓊等[23]對黃淮海50份大豆資源的SSR分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn),大豆類群的形成與其來源地地理環(huán)境與生態(tài)類型相關(guān)。徐澤俊[24]對303份大豆種質(zhì)進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn),同一來源地的種質(zhì)不一定全都聚為一個(gè)群。造成上述情況的原因可能是由于中國是大豆原產(chǎn)國,早期由于資源外流,國外大豆親本的先祖源于我國,而我國近幾十年來對國外資源的引進(jìn)及雜交利用,使得部分優(yōu)異材料混有國外遺傳背景。本研究所用親本基本上符合按不同來源地劃分類群,但在亞群的劃分并沒有按地理來源而細(xì)化成諸如黑龍江省亞群或吉林省亞群,表明東北大豆材料遺傳關(guān)系較近。這與張振宇[25]對50份東北大豆骨干親本基于聚類分析結(jié)果顯示東北大豆材料間遺傳同源性較大,遺傳差異較小的結(jié)論相一致。

3.2 大豆雜種優(yōu)勢群的驗(yàn)證及利用

在本研究中,100份大豆親本之間的GS在0.329 2～0.637 6,R2為0.473 3,于0.450 0處劃分為2個(gè)類群,又在遺傳相似系數(shù)0.460 0和0.480 0處分別劃分為2個(gè)亞群。這與白志元等[13]基于SSR引物將68個(gè)大豆品種根據(jù)分析得出的GS聚類分析,將材料劃分為兩大類5個(gè)亞類的結(jié)果相似。雷蕾等[14]通過SSR標(biāo)記將已審定強(qiáng)優(yōu)勢大豆雜交種的親本劃分為來源于中國東北與國外材料的2個(gè)大群,且GS在0.400 0～0.600 0時(shí),雜種優(yōu)勢利用程度較高。本研究所分析的10個(gè)強(qiáng)優(yōu)勢雜交種的13份親本同樣是分別來自于中國×外國組合,其GS在0.387 9～0.507 5,表明利用SSR標(biāo)記和SRAP標(biāo)記均可較為明確的劃分大豆雜種優(yōu)勢群,且能得出相近的試驗(yàn)結(jié)果;同時(shí)發(fā)現(xiàn),目前已育成的強(qiáng)優(yōu)勢雜交種的親本組合并非遺傳相似系數(shù)越小越好,與Moll等[26]提出的雜交種親本不應(yīng)超過最佳遺傳距離的結(jié)論相符。然而Boeven等[27]對1 903個(gè)小麥雜交組合的分析發(fā)現(xiàn),其雜種優(yōu)勢隨著親本遺傳距離的增加而穩(wěn)步增加。因此,后續(xù)需要配制更多的雜交組合,獲得更多的產(chǎn)量數(shù)據(jù),結(jié)合親本間的GS數(shù)據(jù),更加全面的評估大豆雜種優(yōu)勢與親本間遺傳距離的相關(guān)性。

4 結(jié) 論

1)SRAP標(biāo)記共擴(kuò)增出2 135條條帶,其中多態(tài)性條帶2 130條,多態(tài)性位點(diǎn)占比99.76%,每對引物組合擴(kuò)增出的多態(tài)性譜帶數(shù)為137～204條,平均為178條,引物的多態(tài)性信息含量(PIC)范圍在0.074 0～0.153 7,平均值為0.125 7。

2)根據(jù)遺傳相似系數(shù)于0.450 0處劃分為2個(gè)類群,在遺傳相似系數(shù)0.460 0處將類群Ⅰ劃分2個(gè)亞群,又在遺傳相似系數(shù)0.480 0處將類群Ⅱ劃分2個(gè)亞群,并將保持系且主要來源于中國東北的材料劃分為類群Ⅰ,恢復(fù)系且主要來源于美國的材料劃分為類群Ⅱ。

3)通過對10個(gè)已審定強(qiáng)優(yōu)勢雜交種的13個(gè)親本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),雜交種親本間的遺傳相似性多分布在0.329 2～0.637 6;其中類群Ⅰ的中國東北材料與類群Ⅱ的國外材料之間雜交配制的組合存在較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。

4)對不同群內(nèi)親本材料的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn),類群I與Ⅱ的遺傳多樣性相似度較高,4個(gè)亞群中的亞群Ⅰ-1和Ⅱ-2遺傳多樣性高于亞群Ⅰ-2和Ⅱ-1;通過主坐標(biāo)分析,同樣將親本劃分為2個(gè)類群,驗(yàn)證了聚類分析結(jié)果,且類群Ⅰ的2個(gè)亞群存在較為豐富的遺傳多樣性。