馬鈴薯轉錄因子StNAC043基因的克隆及其生理功能分析

唐鑫華 曲自成 李世偉 劉玉霖 石 瑛*

(1.東北農業大學 農學院,哈爾濱 150030;2.國家大豆工程技術研究中心,哈爾濱150028)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界四大糧食作物之一,其塊莖營養豐富、含有人體必需的全部七大類營養物質[1]。中國是世界第一大馬鈴薯生產國,產量約占世界總產量的1/4[2]。我國已于2015年啟動馬鈴薯主糧化戰略,馬鈴薯將逐漸成為我國第四大主糧作物[3]。但常規栽培四倍體馬鈴薯由于種質資源遺傳基礎相對狹窄及育種年限較長等原因,導致品種資源更新較慢,目前我國馬鈴薯平均單位面積產量低于世界平均水平[1,4]。因此,豐富馬鈴薯育種材料對于豐富其種質資源具有重要的意義。

轉錄因子(transcription factor,TF)是與目的基因啟動子或增強子的區域相互作用來調控基因的表達的一類蛋白質[5]。NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)轉錄因子是植物特有的最大的轉錄因子家族之一,最早在矮牽牛屬植物發現[6],NAC蛋白結構由高度保守的N端和可變的C端(TR)組成[7-8],該轉錄因子家族在調控植物生長發育進程、響應生物脅迫和非生物脅迫方面具有重要作用[9-12]。在植株生長發育方面,研究表明轉錄因子AtNAC2基因在擬南芥中過表達可以促進轉基因植株側根生長[13];轉CarNAC1基因棉花的凈光合速率、抗氧化酶酶活、單鈴重均顯著高于野生型[14];番茄轉錄因子SlNAC1和SlNAC4基因通過影響乙烯合成和類胡蘿卜素積累可調控番茄的成熟[15-16];將紫花苜蓿MsNAC2基因轉入煙草,在非生物逆境脅迫下轉基因煙草的株高、根長、鮮重和干重等生長指標均高于野生型[17];轉錄因子ANAC071和ANAC096基因能夠促進擬南芥莖段愈傷組織細胞形成[18]。在植株抵御非生物抗性方面,研究表明水稻的ONAC045基因[19]、玉米的ZmNAC111基因[20]、棉花的CarNAC1基因[14]過量表達可以提高植株耐干旱脅迫能力,BraNAC基因上調表達能提高白菜型冬油菜耐低溫能力[21],細葉百合LpNAC6基因可以提高轉基因煙草的耐鹽性[22],而抑制水稻OsNAC2基因的表達能提高水稻抗旱性[23]、在轉基因擬南芥中BcNAC036表達與耐高溫性呈顯著負相關[24];馬鈴薯StNAC2基因參與Cd的脅迫響應過程[25],將梭梭HaNAC1基因轉入馬鈴薯、將馬鈴薯StNAC053基因轉入擬南芥后均可提高轉基因植株的耐鹽性和抗旱性[26-27]?？梢奛AC轉錄因子在植物生長和抗逆等方面具有重要作用,但目前對四倍體馬鈴薯NAC轉錄因子在生理功能方面的研究報道卻較少。本研究克隆了馬鈴薯轉錄因子基因StNAC043,用農桿菌介導法轉入馬鈴薯‘東農 310’,獲得StNAC043基因過量表達植株,并對轉基因株系的根和莖的生長指標、葉綠素相對含量(SPAD)以及熒光參數(Fv/Fm、ETRmax)進行測定,以轉錄組測序結合qRT-PCR驗證分析其下游調控基因,旨在探究馬鈴薯轉錄因子StNAC043基因的功能,以期為豐富馬鈴薯種質資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯‘東農 312’的脫毒組培苗和馬鈴薯‘東農 310’原原種,由黑龍江省哈爾濱市國家級農作物品種區域試驗站提供。

1.2 試驗方法

1.2.1目的基因的克隆和載體構建

基于曲自成等[28]對‘東農312’轉錄組測序和NCBI數據庫比對結果,獲得馬鈴薯轉錄因子StNAC043(LOC102584189)的CDS序列,根據該基因序列(去除終止密碼子)添加BamH I和XbaI限制性內切酶位點設計特異性引物(表1)。提取‘東農312’葉片總RNA、反轉錄合成cDNA;利用特異引物StNAC043-CLO-F、StNAC043-CLO-R擴增轉錄因子StNAC043基因;PCR程序為:98 ℃預變性2 min; 98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸15 s,35個循環; 72 ℃延伸10 min。用1%凝膠電泳檢測擴增產物、回收純化目的片段;將上述片段與pEASY?-Blunt克隆載體進行連接,轉入大腸桿菌感受態細胞,涂布在含有50 mg/L卡那霉素(Kan)的LB固體培養基,37 ℃培養。挑單菌落,以StNAC-CDS-F和StNAC-CDS-R特異引物PCR檢驗,反應體系:2xTaq MasterMix(Dye) 10 μL、引物各1 μL、菌液2 μL,加水至20 μL;反應程序:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35 個循環;72 ℃延伸10 min。選擇與目的片段大小一致的陽性克隆單菌落測序。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences in the study

提取測序正確的大腸桿菌單菌落質粒;使用BamH I和XbaI雙酶切上述質粒及pCAMBIA1302-GFP載體,凝膠電泳分離檢測目的基因和線性化載體,并用試劑盒回收;使用T4連接酶連接目的基因與線性化載體,構建植物過表達載體pCAMBIA1302-GFP-StNAC043,凍融法轉入農桿菌GV3101感受態細胞,搖菌后提取質粒;并用PCR擴增和BamH I、XbaI雙酶切上述載體檢測目的基因。

1.2.2目的基因遺傳轉化

將含有pCAMBIA1302-GFP-StNAC043質粒的農桿菌接種于含有50 mg/L Kan和20 mg/L利福平(Rif)的LB液體培養基,28 ℃、200 r/min震蕩培養至OD600為0.5。5 000 r/min離心10 min,棄上清液后加入50 mL MS液體培養基,重懸菌液,加入乙酰基丁香酮(AS)至50 μmol/L。將表面消毒并去除種皮的‘東農 310’原原種切成約1 cm×1 cm×2 mm薄片,浸泡在菌液中10 min,每隔2 min搖勻1次。吸干殘留菌液,平鋪于含4 mg/L 玉米素(ZT)+1 mg/L 生長素(IAA)+50 μmol/L AS的MS固體培養基上,23 ℃暗培養48 h。清洗后浸泡于含200 mg/L頭孢霉素(Cef)無菌水中30 s,沖洗、晾干后移至分化培養基(MS+4 mg/L ZT+1 mg/L IAA+500 mg/L Cef+6 mg/L潮霉素(Hyg),置于光照培養箱培養(25 ℃,16 h光照/8 h黑暗),每10 d繼代1次。待分化芽長到2～3 cm時,扦插至生根培養基中(MS+200 mg/L Cef+6 mg/L Hyg),并對經檢測的抗性植株進行無性系擴繁,備用。

1.2.3轉基因植株檢測

用植物基因組DNA提取試劑盒提取在生根培養基培育20 d的植株葉片基因組DNA,以其為模板,用載體基因GFP特異引物GFP-F和GFP-R進行PCR擴增檢測,1%凝膠檢驗擴增條帶。

1.2.4轉基因植株qRT-PCR檢測和分析

擴繁轉基因植株和非轉基因對照,培育20 d,用試劑盒提取植株根、莖、葉的總RNA,反轉錄合成cDNA,用Primer 5.0軟件根據StNAC043基因序列設計定量引物,用UltraSYBR一步法熒光定量PCR試劑盒,以馬鈴薯Elfα基因為內參基因,反應體系總體積20 μL,其中cDNA 2 μL、引物各0.5 μL、2×UltraSYBR Mixture 10 μL、ddH2O 7 μL;應用實時熒光定量PCR儀(Line Gene 9620,杭州博日科技股份有限公司)進行qRT-PCR檢測,反應程序為:預變性95 ℃ 10 min;95 ℃變性20 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸32 s,40個循環。每個株系進行3次生物學重復。采用2-ΔΔCt算法,對基因相對表達量進行標準化計算。

1.2.5植株表型指標和葉綠素熒光參數測定

取長勢均一的轉基因植株和非轉基因植株無性系擴繁,去除頂芽、切成1.5 cm莖段于MS培養基,光照培養箱培養25 d。用葉綠素儀SPAD-502(日本柯尼卡美能達公司)測定植株上部3片葉的葉綠素相對含量(SPAD);應用葉綠素熒光儀PAM-2500 (德國Heinz Walz GmbH公司)測定葉片葉綠素熒光參數(PSⅡ最大光化學量子產量Fv/Fm、最大電子傳遞速率ETRmax);應用LA-S型植物根系分析儀系統(LA-S,杭州萬深檢測科技有限公司)測定植株根系表型(總根長、根表面積、根直徑、根體積),測定根系鮮重、株高和節間距;每個株系測定9株。

1.2.6轉錄組測序分析

為明確馬鈴薯轉錄因子StNAC043調控的下游基因,對轉基因株系和非轉基因植株無性系擴繁培育20 d,每個株系取3株,分別提取總RNA,由北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序。應用百邁克在線數據分析平臺(www.biocloud.net)分析得出差異表達基因。結合表型數據和熒光參數差異選取部分差異表達基因qRT-PCR驗證,3 次生物學重復,分析轉錄因子StNAC043調控的下游基因。

1.2.7數據分析

應用Excel 2012記錄數據和做圖,應用SPSS 23進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 轉錄因子StNAC043基因的克隆及序列分析

由圖1可知,以馬鈴薯‘東農 312’葉片cDNA為模板,利用特異性引物,擴增出的條帶大小為955 bp(圖1)。經測序分析,PCR擴增產物片段序列與StNAC043基因一致(不含終止密碼子),StNAC043基因開放閱讀框(ORF)942 bp,編碼氨基酸313個(圖2)。

M,分子量標記5 000;1、2,StNAC043基因PCR產物。M, Marker 5 000; 1 and 2, PCR Product of StNAC043 gene.圖1 StNAC043基因電泳圖Fig.1 StNAC043 gene electrophoresis map

圖2 StNAC043基因核苷酸序列及所編碼氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of StNAC043 gene and the encoded amino acid sequence

2.2 轉基因植株檢測及qRT-PCR分析

由圖3可知,對6個抗性植株中長勢良好的3個植株(ST1、ST2和ST3)提取基因組DNA并經PCR檢測,ST1、ST2和ST3為轉基因植株。

M,分子標記2000;1,陽性對照;2,ddH2O;3,非轉基因植株;ST1、ST2、ST3抗性植株。M,DNA marker 2000; 1,positive control; 2,ddH2O; 3,non-transgenic plants; ST1, ST2, ST3 are resistant plants, respectively.圖3 植株PCR檢測電泳圖Fig.3 Plant PCR detection electrophoresis map

由圖4可知,經qRT-PCR檢測,ST1、ST2和ST3的StNAC043在植株的葉、莖和根部相對表達量均顯著高于CK,其中StNAC043基因在葉、莖和根的相對表達量分別比CK高 2.13～2.37、2.76～6.98和2.28～6.25倍,因此,ST1、ST2和ST3為StNAC043基因的過量表達植株。轉基因株系和非轉基因株系(CK)的莖和根中StNAC043相對表達量均高于葉片中的相對表達量,說明StNAC043基因在不同器官的表達存在顯著差異。

CK為非轉基因株系,ST1、ST2和ST3為轉基因株系。*表示轉基因株系和CK之間差異顯著(P<0.05)。下同。CK is non-transgenic control, ST1, ST2 and ST3 are transgenic lines. * indicates the significant difference between transgenic lines and CK (P<0.05). The same below.圖4 StNAC043基因在不同部位相對表達量Fig.4 Relative expression of StNAC043gene in different parts

2.3 植株表型指標及葉綠素熒光參數分析

由圖5可知,3個轉基因株系長勢均優于非轉基因對照。由表2可知,轉基因株系根的總長、表面積、體積、鮮重以及株高和節間距均顯著高于CK,其中轉基因株系總根長、根表面積、根體積、根鮮重、株高、節間距分別比CK高26.14%～37.20%、16.82%～26.03%、22.32%～37.50%、47.30%～83.78%、12.94%～25.53%、37.50%～46.88%。說明StNAC043基因過量表達可以促進馬鈴薯轉基因植株根系和莖的生長。

圖5 ‘東農 310’及轉基因植株的幼苗Fig.5 Seedling of ‘Dongnong 310’ and transgenic lines

表2 轉基因植株的表型指標Table 2 Phenotypic indicators of transgenic plant

由表3可知,轉基因株系葉片的SPAD、Fv/Fm、ETRmax均顯著高于CK,其中轉基因株系葉片的SPAD 比CK高4.37%～16.67%、Fv/Fm比CK高10.93%～15.63%、ETRmax比CK高21.65%～36.91%。表明StNAC043基因的過量表達可以提高轉基因植株葉片的SPAD、Fv/Fm和ETRmax。

表3 葉綠素熒光參數Table 3 Chlorophyll fluorescence parameters

2.4 轉錄組測序分析及qRT-PCR驗證

由圖6可知,轉錄組測序數據表明轉基因株系與非轉基因對照植株存在615個差異表達基因,其中432個基因表達量上調,183個基因下調表達。對差異表達基因進行KEGG分類,發現光合作用-捕光蛋白(Photosynthesis-antenna proteins)通路的P<0.01且富集因子最高,表明StNAC043基因過量表達所調控的下游基因在此通路高度富集。經qRT-PCR檢測表明轉基因株系在此通路中的StCAB1和StCAB2基因相對表達量分別比CK高3.84～8.83和4.02～10.93倍(圖7),說明轉錄因子StNAC043基因可以調控StCAB1和StCAB2基因表達。

圖6 差異表達基因功能的KEGG分類Fig.6 KEGG classification of differentially expressed gene function

圖7 StCAB1和StCAB2基因相對表達量Fig.7 Relative expression of StCAB1 and StCAB2

3 討 論

NAC轉錄因子在調控植物生長發育進程、響應生物和非生物逆境脅迫方面具有重要作用[9-12]。本研究將克隆的NAC轉錄因子家族中的StNAC043基因轉入馬鈴薯‘東農310’,使其過量表達,轉基因植株的根系生長指標均高于非轉基因對照,這與在煙草和擬南芥等模式植物中開展的研究結果一致[13,17,29]。Xie等[29]研究表明擬南芥NAC1基因在根尖和側根生長原基表達,可通過調控生長素應答因子AIR3(auxin-induced in rootcultures3) 和DBP(DNA-binding protein)基因表達促進根系的發育,推測StNAC043基因正向調控與根系生長相關的基因,因此StNAC043過表達馬鈴薯植株根系生長優于非轉基因對照植株。Huang等[30]在轉基因水稻中研究表明轉錄因子NAC29和NAC31能調控纖維素合成酶基因CESA的表達,CESA基因與植物次生細胞壁形成有關,通過正向調控CESA基因表達可以促進水稻莖稈生長。在本研究中轉基因植株的株高和節間距均高于非轉基因對照,推測在馬鈴薯過表達植株中StNAC043基因促進馬鈴薯植株次生細胞壁合成。發達的根系和莖對于植物吸收水、養分及促進植株生長具有重要的作用[31],可以促進植株蒸騰作用、進而提高凈光合速率,本研究中轉基因株系的ETRmax高于非轉基因植株,因此在轉基因馬鈴薯中StNAC034基因可通過促進根系和莖的生長進而促進植株水分和養分的吸收,從而影響植株光合作用。

本研究中對轉基因株系和非轉基因植株轉錄組測序以及qRT-PCR驗證表明轉錄因子StNAC043可以正向調控StCAB1、StCAB2基因表達,StCAB1、StCAB2基因均編碼捕光色素結合蛋白,該類蛋白主要功能是收集光能并傳遞給光反應中心,在光反應的光能吸收階段對光能捕獲過程具有重要作用[32],StNAC043基因的過表達可能通過增加捕光色素結合蛋白StCAB1、StCAB2含量的方式促進葉片的葉綠素含量升高,本研究中轉基因株系的Fv/Fm和SPAD均顯著高于非轉基因對照植株也與此推測吻合,轉錄因子StNAC043還可通過調控參與光反應的捕光色素結合蛋白基因的表達進而影響植株光合作用。

本研究中轉基因株系和非轉基因對照無性系扦插擴繁培養的環境條件相同,但非轉基因植株葉片Fv/Fm顯著低于轉基因株系,Fv/Fm反映PSⅡ光能轉換效率且非脅迫條件下該參數的變化極小、不受物種和生長條件的影響,而在脅迫條件下該參數顯著下降[33],在組培條件下植株生長消耗MS固體培養基中的養分和水分,隨著培養基中養分減少、pH和滲透壓變化等對植株造成了一定非生物逆境脅迫,而轉基因株系表現出所受脅迫影響較小,說明StNAC043基因的過量表達可能提高植株抗逆性、降低由于環境因素造成的非生物逆境脅迫對植株的影響,與申玉華等[17]、Zheng等[19]、劉彬等[22]在煙草等模式植物中的研究結果相似。StNAC043基因在馬鈴薯中提高非生物逆境脅迫抗性的機制仍需進一步深入研究。

4 結 論

馬鈴薯轉錄因子StNAC043基因在馬鈴薯‘東農310’中過量表達可以促進轉基因植株幼苗根系和莖的生長,顯著提高葉片SPAD、Fv/Fm和ETRmax;轉錄組測序表明轉基因株系與非轉基因株系的差異表達基因在光合作用-捕光蛋白通路高度富集;轉錄因子StNAC043可以調控捕光色素結合蛋白基因StCAB1和StCAB2的表達。