長鏈非編碼RNA CCAT1靶向調控miR-377對前列腺癌PC3細胞生物學行為的影響

王洪福 賈媛 劉楠 尹凱 齊文千 孫福祥

前列腺癌是全世界男性中最常見的惡性腫瘤之一,據估計2020年全球報告的新病例為64萬例,死亡人數為8萬多[1]。前列腺癌患者大多接受雄激素剝奪治療,盡管初始反應率很高,但10%～20%的患者出現去勢抵抗性前列腺癌,導致治療失敗[2,3]。因此,探索新的治療靶點對前列腺癌的治療意義重大。兩種類型的非編碼RNA(ncRNA)對表觀遺傳和翻譯后調控都很重要。研究表明,長非編碼RNA(IncRNA)在表觀遺傳調控中發揮作用[4]。長度>200個核苷酸的IncRNA定義為IncRNA,它保持RNA分子常見的經典poly-A尾和5’-帽。IncRNA已在許多組織類型中發現,并在發育過程中的特定時間表達。出于這個原因,IncRNA在人類癌癥的發病機制和其他生理過程中可能是必不可少的[5]。與IncRNA類似,microRNA(miRNA)在癌癥中得到了很好的表征。與IncRNA相比,miRNA相對較短(定義為長度為19～25個核苷酸)。除了蛋白質編碼調控外,這兩種類型的ncRNA也與轉錄后調控有關。LncRNAs和miRNAs被認為是相互影響的,從而產生了一層額外的調控復雜性[6]。例如,GAS5通過與miR-145結合再前列腺癌的進展中發揮重要調控作用[7]。本研究擬探討長鏈非編碼RNACCAT1靶向調控miR-377對前列腺癌PC3細胞生物學行為的影響,為前列腺癌的治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年12月本院行手術治療的前列腺癌78例為病理組,同時獲取78例相鄰的非惡性組織標本為癌旁組(≥3 cm)。患者年齡53～80歲,平均年齡(77.2±5.3)歲。所有組織標本經病理檢查確認。獲取樣本后冷凍于液氮。該研究經本院醫學倫理委員會批準,并獲得患者書面知情同意書。

1.2 納入與排除標準 (1)納入標準:①病理檢查確診的前列腺癌患者;②病歷完整患者。(2)排除標準:①被診斷患有其他疾病的患者;②治療期間轉入其他醫院的患者;③隨訪期間因其他原因死亡的患者。

1.3 主要試劑與儀器 miRNeasy Mini 試劑盒(Qiagen,Inc,USA,批號;65489),TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc,USA,批號;302158),TRIzol試劑(Invitrogen,批號:MN-20148),MMLV Reverse Transcriptase(中國碧云天生物科技,批號:20158),1st-鏈 cDNA 合成試劑盒(Lucigen Corporation,USA,批號:520158),SYBR?Green Real-Time PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific,批號:521489),Dulbecco改良Eagle培養基(中國碧云天生物,批號:526985),10%胎牛血清,青霉素、鏈霉素(美國默克生物科技,批號:51489、41555、96581),CCK-8 試劑盒(Dojindo Molecular Technologies,Japan,批號:521458),Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)(Dojindo,Kumamoto,Japan,批號:201596、30254),BD Biosciences 2 Laser 4 Color FacsCalibur 流式細胞儀(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA),BD Paint-A-GateTMPro軟件(BD Biosciences),trawnswell小室、Matrigel凝膠(美國BD Biosciences,批號254896、203658),UI-3265倒置顯微鏡(日本奧林巴斯),蛋白質提取試劑盒(中國Solarbio,批號:FG-4586.36),二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒(中國Beyotime,批號:NM-32589),12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(美國sigma,批號:SX-201558),聚偏二氟乙烯膜(美國Pall Corporation,批號:VB-89655),抗RUNX1、GAPDH抗體的特異性一抗(ab96587、20158、3258;英國Abcam,均為1∶1 000稀釋),辣根過氧化物酶偶聯二抗(ab215;英國Abcam,1∶5 000稀釋),化學發光試劑(ECL)試劑盒(中國Beyotime,批號:BO-32569)。

1.4 方法

1.4.1 2組miR-377、InRNA CCAT1水平的測定:為檢測miR-377表達水平,使用miRNeasy Mini 試劑盒從每0.1克組織標本和1×105個細胞中提取miRNA,以TaqMan MicroRNA Reverse Transcription 試劑盒制備PCR反應系統。為了檢測InRNA CCAT1的表達水平,使用TRIzol試劑從每個樣品的0.1 g組織標本和1×105個細胞中提取總RNA,使用MMLV Reverse Transcriptase、1st-鏈 cDNA合成試劑盒和 SYBR?Green Real-Time PCR Master Mix制備 qPCR反應系統。熱循環條件為95℃ 55 s,然后是95℃ 25 s和55.5℃ 30 s的40個循環。miR-377、InRNA CCAT1和內源性對照為U6和β-actin的引物由Sangon Biotech Co(中國上海)設計和合成。引物序列:miR-377正向,5’-TCGGCGCGCTAGTCGATCGATCGTAGCTAGCT-3’和反向,5’-TGGGCTGATCGATCGATCGTAGCTAGC-3’;U6正向,5’-TGGGGCTAGTCGATCGATGCTAGCTAGCA-3’ 和反向,5’-TGGGCGATGCTAGGAGTCGATCGATCAC-3’;InRNA CCAT1正向,5’-TCGGCGGCTAGGAGGATCGTAGCTAGCTAGCCC-3’ 和反向,5’-TGGGCTGACTGATCGATCGTAGCTAGCTACC-3’;β-肌動蛋白正向,5'-TGGGGCTAGTCGATCGATCGATCGACC-3’和反向,5’-TGGGGATCGATCGATGCTAGCTACAC-3’。使用2-ΔΔCt方法將miR-377的表達標準化為U6,并將 IncRNA CCAT1的表達標準化為β-肌動蛋白。

1.4.2 細胞培養及分組設計:本PC3人前列腺癌細胞系,細胞獲自美國典型培養物保藏中心 (ATCC; Manassas,USA),并在Dulbecco改良的Eagle培養基中培養(含有10%的胎牛血清,100 U/ml的青霉素和100 mg/ml的鏈霉素),并在在37℃、5%CO2的濕潤氣氛中生長。InRNA CCAT1 pcDNA3.1過表達載體(5’-TCGGGCGCTAGTCAGTCGATCGACC-3’),(InRNA CCAT1 mimics)、InRNA CCAT1 pcDNA3.1低表達載體(5’-TGGGGCTGGCGTGCTGCTAGCAC-3’),(InRNA CCAT1 inhibitor)、空載體(InRNA-NC)獲自Sigma-Aldrich (Merck KGaA,Darmstadt,Germany)。細胞轉染使用Lipofectamine?2000試劑 (Thermo Fisher Scientific,Inc)在37℃下進行,InRNA-NC、InRNA CCAT1 mimics、InRNA CCAT1 inhibitor的劑量分別為40、40和40 nmol/L。將細胞與轉染混合物一起孵育6 h。用Lipofectamine?2000 試劑處理InRNA CCAT1 mimics、過表達的成功轉染閾值為200%,InRNA CCAT1 inhibitor敲低的閾值為50%。在轉染后72 h進行進一步的實驗。

1.4.3 PC3細胞活力的檢測:使用CCK-8測定法檢測細胞增殖。在正常條件(37℃;5% CO2)和15 μl CCK-8 溶液在72 h添加到每個孔中,將細胞與CCK-8溶液一起孵育4 h,使用讀板器測量450 nm處的光密度值以確定細胞增殖率。

1.4.4 PC3細胞凋亡水平測定:流式細胞儀測定細胞凋亡。無血清 DMEM 制備細胞懸液(5×104個/ml)。將細胞轉移至6孔板(10 ml/孔)培養60 h,用0.25%胰蛋白酶消化細胞。Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色在室溫下在黑暗中進行30 min,然后使用BD Biosciences 2 Laser 4 Color Facs Calibur流式細胞儀檢測凋亡細胞。BD Paint-A-GateTMPro軟件分析數據。

1.4.5 PC3細胞侵襲水平測定:通過transwell測定法進行評估侵襲能力,將無血清培養基中的1×105個細胞接種到涂有 Matrigel 的插入物的上室中。將含有10%FBS的培養基添加到下室中。孵育24 h后,用脫脂棉去除上膜上殘留的細胞。已侵襲入膜的細胞用甲醇和0.1%結晶紫染色,成像,并使用倒置顯微鏡計數。實驗獨立重復3次。

1.4.6 PC3細胞miR-377、InRNA CCAT1 mRNA表達水平測定:首先,將細胞系制備成細胞懸液。然后,添加TRIzol試劑提取細胞總RNA,后續操作同1.4.1。

1.4.7 PC3細胞RUNX1表達水平測定:使用蛋白質提取試劑盒(中國Solarbio,批號:FG-4586.36)對培養結束的細胞進行蛋白質分離,然后用二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒(中國Beyotime,批號:NM-36523.63)定量30 μg將蛋白質樣品上樣到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(美國sigma,批號:SX-41526.36)上,后轉至聚偏二氟乙烯膜上(美國Pall Corporation,批號:VB-45213.32)。將膜在脫脂奶中封閉,然后與抗RUNX1、GAPDH抗體的特異性一抗(ab184787、36549、524596; 英國Abcam,均為1∶1 000稀釋)在4℃孵育過夜。與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(ab205718;英國Abcam,1∶5 000稀釋)在室溫下孵育2 h。使用化學發光試劑(ECL)試劑盒(中國Beyotime,批號:BO-4585.36)對蛋白條帶進行可視化和分析。

2 結果

2.1 癌旁組、病理組miR-377、InRNA CCAT1水平的比較 病理組miR-377水平低于癌旁組,InRNA CCAT1水平高于癌旁組(P<0.05)。見表1。

表1 癌旁組、病理組miR-377、InRNA CCAT1水平比較 n=78,

2.2 miR-377、InRNA CCAT1與前列腺癌臨床病理特征的關系 不同年齡特征組前列腺癌患者miR-377、InRNA CCAT1水平差異無統計學意義(P>0.05);而病理學分級越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結轉移、有復發,miR-377表達水平越低,InRNA CCAT1表達水平越高(P<0.05)。見表2。

表2 miR-377、InRNA CCAT1與前列腺癌臨床病理特征的關系

2.3 4組PC3前列腺癌細胞OD值、存活率比較 與PC3前列腺癌細胞組、InRNA-NC組比較,InRNA CCAT1 mimics組OD值、存活率升高(P<0.05),InRNA CCAT1 inhibitor組OD值、存活率降低(P<0.05);與InRNA CCAT1 mimics組比較,InRNA CCAT1 inhibitor組降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組PC3前列腺癌細胞OD值、存活率比較

2.4 4組PC3前列腺癌細胞凋亡率比較 與PC3前列腺癌細胞組、InRNA-NC組比較,InRNA CCAT1 mimics組細胞凋亡率降低(P<0.05),InRNA CCAT1 inhibitor組細胞凋亡率升高(P<0.05);與InRNA CCAT1 mimics組比較,InRNA CCAT1 inhibitor組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 4組PC3前列腺癌細胞凋亡率比較;A PC3前列腺癌細胞組;B InRNA-NC組;C InRNA CCAT1 mimics組;D InRNA CCAT1 inhibitor組

表4 4組PC3前列腺癌細胞凋亡率比較

2.5 4組PC3前列腺癌細胞遷移能力比較 與PC3前列腺癌細胞組、InRNA-NC組比較,InRNA CCAT1 mimics組穿膜數升高(P<0.05),InRNA CCAT1 inhibitor組穿膜數降低(P<0.05);與InRNA CCAT1 mimics組比較,InRNA CCAT1 inhibitor組穿膜數降低(P<0.05)。見表5,圖2。

圖2 穿膜數目比較(結晶紫染色×200);A PC3前列腺癌細胞組;B InRNA-NC組;C InRNA CCAT1 mimics組;D InRNA CCAT1 inhibitor組

表5 4組PC3前列腺癌細胞穿膜數比較

2.6 InRNA CCAT1對miR-377的靶向調節 生物信息學網站(www.Targetscan.org)檢索發現,InRNA CCAT1與miR-377有潛在的結合位點;螢光素酶結果顯示,InRNA CCAT1過表達可明顯降低miR-377-wt的熒光素酶活性,InRNA CCAT1低表達可明顯提升miR-377-wt的熒光素酶活性;表明InRNA CCAT1與miR-377存在靶向調節作用。見表6,圖3。

圖3 Targetscan預測InRNA CCAT1與miR-377 mRNA的互補配對系列

表6 螢光素酶報告基因實驗結果

2.7 4組PC3前列腺癌細胞InRNA CCAT1、miR-377表達水平比較 與PC3前列腺癌細胞組、InRNA-NC組比較,InRNA CCAT1 mimics組細胞InRNA CCAT1升高,miR-377降低(P<0.05),InRNA CCAT1 inhibitor組細胞InRNA CCAT1降低,miR-3771升高(P<0.05);與InRNA CCAT1 mimics組比較,InRNA CCAT1 inhibitor組細胞InRNA CCAT1降低,miR-377升高(P<0.05)。見表7。

表7 4組PC3前列腺癌細胞InRNA CCAT1、miR-377 mRNA表達水平比較

2.8 4組PC3前列腺癌細胞RUNX1蛋白表達水平比較 與PC3前列腺癌細胞組、InRNA-NC組比較,InRNA CCAT1 mimics組細胞RUNX1蛋白降低(P<0.05),InRNA CCAT1 inhibitor組升高(P<0.05);與InRNA CCAT1 mimics組比較,InRNA CCAT1 inhibitor組細胞RUNX1蛋白升高(P<0.05)。見表8,圖4。

圖4 4組SW1620前列腺癌細胞RUNX1蛋白比較;A PC3前列腺癌細胞組;B InRNA-NC組;C InRNA CCAT1 mimics組;D InRNA CCAT1 inhibitor組

表8 4組PC3前列腺癌細胞RUNX1蛋白表達水平比較

3 討論

IncRNA在癌癥發病機制中具有重要作用,可以為癌癥生物學提供新的見解。了解IncRNA功能的精確分子機制可能有助于開發IncRNA指導的癌癥診斷和治療方法。本研究發現,InRNA CCAT1是一種促癌CCAT1,可以下調miR-377的表達,miR-377通過下調RUNX1表現出致癌活性。

CCAT1是一種lncRNA,CCAT1基因也可以稱為DD3基因,僅在前列腺上皮細胞中表達,具有很高的腫瘤特異性[8]。因此,CCAT1在前列腺癌的早期診斷和治療中具有良好的臨床應用價值。如前列腺上皮細胞的分泌物和脫落細胞通過導管排入尿道,前列腺按摩后,尿液樣本中即可檢測到CCAT1的高表達[9,10]。相反,由于尿沉渣包含所有的細胞和細胞碎片,因此,尿沉渣可用于更準確地檢測CCAT1的表達。此外,有數據提示在肝癌患者中,與正常對照組相比,外周血中CCAT1基因表達水平增加了約34倍,表明CCAT1在肝癌中具有致癌基因作用[11]。本研究結果發現,病理組InRNA CCAT1水平高于癌旁組;且前列腺癌病理學分級越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結轉移、有復發,InRNA CCAT1表達水平越高。這說明,CCAT1能促進前列腺癌病理進展。

本研究結果顯示:與PC3前列腺癌細胞組、InRNA-NC組比較,InRNA CCAT1 mimics組OD值、存活率、穿膜數升高,凋亡率降低,InRNA CCAT1 inhibitor組OD值、存活率、穿膜數降低,凋亡率升高;與InRNA CCAT1 mimics組比較,InRNA CCAT1 inhibitor組OD值、存活率、穿膜數降低,凋亡率升高。這表明CCAT1有效促進前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移,并抑制其凋亡。近期研究發現,將LV3-shRNACCAT1皮下注射到腫瘤異種移植物中,LV3-shRNACCAT1有效促進異種移植物的生長[12]。此外,lncRNACCAT1表達的敲低導致肺癌細胞生長缺陷以及細胞凋亡率增加;CCAT1對MALAT-1的下調促進了胃癌細胞的生長、侵襲和遷移,并在細胞中誘導細胞周期停滯在G0/G1期[13]。

在肝細胞癌的發展過程中,miR-29a通過啟動子高甲基化抑制母體表達的lncRNA3表達;miRNA-218-5p受lncRNA結腸癌相關轉錄物1的負調控以促進膽囊癌發展[14]。本研究結果表明,病理組miR-377水平低于癌旁組;且前列腺癌病理學分級越高、TNM分期越高、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結轉移、有復發,miR-377表達水平越低。這說明,miR-377能抑制前列腺癌病理進展。近期研究發現,CCAT1可能間接下調胰腺癌細胞中的miR-377[15]。一項研究中,lncRNA CCAT1通過AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶/哺乳動物雷帕霉素靶點通路靶向miR-377,從而促肺癌的進展[16]。因此,miR-377也可能在lncRNA CCAT1的下游參與前列腺癌的發生發展。本研究螢光素酶報告基因實驗結果表明InRNA CCAT1與miR-377存在靶向調節作用。而RT-PCR結果更加直觀表明,InRNA CCAT1能靶向抑制miR-377表達。

Runt相關轉錄因子1(RUNX1)蛋白與細胞周期相關蛋白(如CyclinD1和p21)的轉錄調控有關,并且RUNX表達水平在細胞周期中有所不同。RUNX1可以通過調控p21和信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)等癌癥相關基因在不同細胞和組織中充當腫瘤抑制基因或癌基因RUNX1抑制p21并促進STAT3的激活,STAT3是一種具有致癌特性的轉錄因子,通過Jak/Stat通路促進其磷酸化[17]。在角質形成細胞和皮膚癌細胞中,RUNX1通過抑制細胞因子信號抑制因子(SOCS)來維持STAT3處于活躍狀態。RUNX1顯示在PCa組織中下調,并與PCa細胞增殖、遷移和侵襲有關[18]。本研究結果顯示:與PC3前列腺癌細胞組、InRNA-NC組比較,InRNA CCAT1 mimics組細胞RUNX1蛋白降低(P<0.05),InRNA CCAT1 inhibitor組細胞RUNX1蛋白升高(P<0.05);與InRNA CCAT1 mimics組比較,InRNA CCAT1 inhibitor組細胞RUNX1蛋白升高(P<0.05)。結合前述討論,這說明,InRNA CCAT1能靶向抑制miR-377進而抑制RUNX1的表達,這可能在前列腺癌的進展中發揮重要作用。

綜上所述,InRNA CCAT1在前列腺癌組織中高表達,miR-377在前列腺癌組織中低表達,InRNA CCAT1、miR-377與前列腺癌臨床病理特征具有一定相關性;InRNA CCAT1靶向抑制miR-377、RUNX1表達進而促進前列腺癌PC3細胞惡性生物學行為。