FOXD1、FOXD3蛋白在食管鱗狀細胞癌中的表達及與臨床特征和預后的相關性

吳崢 郭盛虎 李文 張躍華 潘騰 汪治宇

食管癌(ESCA)是對我國居民生命健康存在危害性的一大惡性腫瘤。基于世界衛生組織(WHO)數據可知,我國2020年的ESCA新發患者是32.4萬人,死亡患者是30.1萬人,近1/2的ESCA發病與死亡病例出現于我國,新發率與病死率相較美國不止10倍,我省更是ESCA高發區域之一[1]。在我國,以食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)病理分型最為常見,病理組織活檢為其主要診斷標準。ESCC患者早期通常無明顯表現,主要采取手術切除療法,并將放療、化療與多學科聯合療法等作為輔助,但晚期ESCC患者進展極為迅速,5年生存率只有20%～30%[2]。所以,深入了解本病的發病機制,挖掘具有高度特異性與敏感性的腫瘤標志物(TM)顯得非常關鍵,對臨床領域早期診斷有利,同時可指導治療以及作為治療靶點改善預后。叉頭框轉錄因子(FOX)家族的首次發現是在果蠅內,現今已劃分出19個亞家族,由FOXA至FOXS,這些亞家族在結構方面的最大表現為存在由100多個保守氨基酸(AA)序列構成的DNA結合域。諸多報道顯示,FOX家族對多種生物學功能具介導作用,包括細胞周期、胚胎發育、DNA損傷修復,還和腫瘤形成進行等若干復雜進程相關[3]。FOXD1、FOXD3均屬于FOXD亞族蛋白,FOXD1在早期胚胎發育和器官發生中具有公認的作用,并且其表達紊亂,與不同類型癌癥的生物學行為相關。類似地,FOXD3最早在胚胎干細胞中發現,維持胚胎干細胞的多能性,調節神經嵴的形成、分化和遷移。研究表明,FOXD3在細胞癌變過程中也發揮著重要作用,其異常表達可調控腫瘤的增殖、侵襲、轉移和血管生成等生物學功能[4]。本研究擬分析FOXD1、FOXD3在食管鱗癌患者中的表達情況,并探究兩者與患者預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2013年12月河北醫科大學第四醫院收治的符合納入及排除標準接受手術治療的食管鱗癌患者105例作為研究對象。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準:①初次就診,無外院診治史;②入組前未行放化療及免疫治療者;③經病理檢查明確診斷為食管鱗癌;④無食管狹窄和反流性食管炎等食管良性疾病;⑤患者和(或)其家屬對本研究知情同意并簽署相關知情同意書。

1.2.2 排除標準:①合并胃腸炎和腸結核等急性感染性疾病患者;②伴心肺功能衰竭患者;③伴免疫缺陷性疾病和精神障礙等患者。組織標本的切取和使用經過本院倫理委員會批準,患者已簽署知情同意書。

1.3 總RNA提取以及qRT-PCR檢測組織中FOXD1和FOXD3 mRNA表達 將食管鱗癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣>2 cm)研碎后加入Trizol試劑(美國Invitrogen公司),應用Trizol法提取組織中RNA。應用逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將RNA逆轉錄為cDNA,并采用熒光定量PCR技術檢測FOXD1、FOXD3 mRNA的相對表達量,反應體系共10 μl,引物由上海捷瑞有限公司設計,FOXD1上游引物序列為5’-TGAGCACTGAGATGTCCGATG-3’,下游引物序列為5’-CACCACGTCGATGTCTGTTTC-3’;FOXD3上游引物序列為5’CGCTGCCCAATCCTGGACTCTG-3’,下游引物序列為5’CCCATCCCCACGGTACTAAGAGC-3’。反應條件為50℃/2 min,95℃/3 min,95℃/30 s,60℃/1 min,共循環40次。以GAPDH為內部參照,采用2-ΔΔCT法計算FOXD1、FOXD3 mRNA的相對表達量。該實驗獨立重復3次。

1.4 免疫組織化學法檢測FOXD1與FOXD3蛋白表達情況

1.4.1 免疫組化實驗主要試劑:手工染色檢測食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1、FOXD3蛋白表達。依次實施石蠟切片處理、脫蠟水化處理、抗原修復、加入阻斷PO(內源性過氧化物酶)阻斷劑、室溫下一抗FOXD1與FOXD3(1∶100)反應1 h、復溫、室溫下二抗山羊抗兔IgG反應20 min,接著DAB顯色、蘇木素(Hematoxylin)復染、脫水封片與顯微鏡觀察。FOXD1的一抗購自Santa Cruz Biotechnology,FOXD3的一抗購自Abcam公司。

1.4.2 染色結果評估:根據染色強度和陽性細胞百分率對切片進行評分分級:①染色強度:未著色、淺著色、中等著色、強著色對應的分值依次為0分、1分、2分、3分;②陽性細胞占比:0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%對應的分值依次是1分、2分、3分、4分;③雙方乘積:0～1分、2～4分、5～8分、9～12分依次對應陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性,除了陰性,另3類皆屬于陽性[5]。

1.5 觀察指標 比較食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3 mRNA和蛋白的表達水平,并分析食管鱗癌組織FOXD1和FOXD3表達與食管鱗癌患者臨床病理特征關系,以及影響食管鱗癌患者預后生存的危險因素。

2 結果

2.1 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3 mRNA表達水平 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1 mRNA的相對表達量分別為1.085±0.432和 0.412±0.117,FOXD3 mRNA的相對表達量分別為0.397±0.120和1.143±0.335。在食管鱗癌組織中FOXD1相對表達量高于癌旁組織,FOXD3相對表達量低于癌旁組織,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3 mRNA相對表達水平;A FOXD1 mRNA相對表達水平;B FOXD3 mRNA相對表達水平;與癌旁組織同一指標比較,*P<0.05

2.2 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3蛋白表達水平 食管鱗癌組織FOXD1陽性表達率明顯高于癌旁正常組織,而食管鱗癌組織FOXD3陽性表達率明顯低于癌旁正常組織,差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖2,表1。

表1 食管鱗癌組織和癌旁正常組織2組FOXD1、FOXD3表達情況 n=105,例(%)

圖2 食管鱗癌組織和癌旁組織中FOXD1及FOXD3蛋白表達;A FOXD1免疫組化染色圖;B FOXD3免疫組化染色圖

2.3 食管鱗癌組織中FOXD1、FOXD3表達水平與臨床病理特征之間的關系 食管鱗癌組織中FOXD1表達水平與患者有無淋巴結轉移(χ2=5.512,P=0.019)、腫瘤浸潤深度(χ2=4.317,P=0.038)和腫瘤TNM分期(χ2=6.998,P=0.008)相關,與患者年齡、性別及病理分化程度均無關(P=0.712、0.820)。FOXD3表達水平與患者性別(χ2=4.162,P=0.041)、有無淋巴結轉移(χ2=7.581,P=0.006)、腫瘤浸潤深度(χ2=5.318,P=0.021)和腫瘤TNM分期(χ2=5.709,P=0.017)相關,與患者年齡及病理分化程度均無關(P>0.05)。見表2、3。

表2 FOXD1在ESCC組織中的表達與患者臨床病理特征的關系 例(%)

表3 FOXD3在ESCC組織中的表達與患者臨床病理特征的關系 例(%)

2.4 影響食管鱗癌患者預后生存的多因素分析 將所有可能影響病人預后的因素帶入COX回歸模型,結果顯示腫瘤TNM分期為Ⅲ/Ⅳ的ESCC患者死亡風險是腫瘤TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期患者的2.884倍(95% CI:1.846～4.508,P<0.05);淋巴結有轉移的ESCC患者的死亡風險是無淋巴結轉移患者的2.103倍(95% CI:1.091～4.159,P<0.05);FOXD3高表達的ESCC患者死亡風險是FOXD3低表達者的0.514倍(95% CI:0.314～0.843,P<0.05);FOXD1高表達的ESCC患者死亡風險是FOXD1低表達者的3.585倍(95% CI:1.843～5.841,P<0.05)。綜合以上結果,TNM分期、淋巴結轉移、FOXD1表達陽性及FOXD3表達陰性均是影響食管鱗癌患者總生存率的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

3 討論

ESCA發病隱匿,具強侵襲性,較易病死,為一大消化道惡性腫瘤,臨床表現主要為進行性吞咽障礙、癌痛與乏力等,如果未及時診治,一定會對病人的身心健康與生命安全產生影響[6]。研究發現,分子標志物在食管癌患者的診斷,治療以及預后評估中可發揮關鍵作用。

FOXD1也稱為BF2和FREAC-4,是FOX轉錄因子家族中的一員,本質為蛋白質。在染色體水平上,FOXD1是一種常染色體單外顯子基因,位于人類的5q12-q13。FOXD1含有鳥嘌呤-胞嘧啶(GC)富集區域,這些DNA區域容易形成發夾DNA結構和遭受聚合酶滑移,從而妨礙編碼區的克隆和測序。FOXD1首次在前腦神經上皮內被識別和描述,它被認為是視網膜發育過程中的一個重要因素[7]。目前,FOXD1已被確認為癌癥相關基因,它的異常表達在宮頸癌、腎透明細胞肉瘤、口腔鱗狀細胞癌、膠質瘤、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和結直腸癌中被觀察到,并參與了許多生物學過程[8-15]。Chen等[16]發現,FOXD1通過上調口腔鱗狀細胞癌中的lncRNA CYTOR來促進EMT和藥物的耐藥性;還有研究表明,FOXD1通過激活ERK1/2信號通路促進結直腸癌發生和進展,并預示著FOXD1可能為一種潛在的腫瘤治療靶點[17]。FOXD3同樣作為FOX家族的成員之一,也是目前研究較為廣泛,具有重要功能的轉錄因子之一。FOXD3位于人類染色體1p31.3上,FOXD3以共有序列5'A[AT]T[AG]TTTGTTT-3'與DNA結合。FOXD3作用于腫瘤的機制是多樣的,Xie等[18]發現FOXD3會抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲,PI3K/Akt信號通路對FOXD3抑制鼻咽癌細胞侵襲轉移有重要影響。其他研究表明FOXD3在非小細胞肺癌進展中同樣起著潛在的腫瘤抑制作用[19]。FOXD3可抑制多種癌細胞的遷移和侵襲,本研究結果進一步證實了FOXD3作為抑癌基因可通過抑制瘤細胞生長與侵襲在食管癌發生與進展中起關鍵作用。

本研究結果顯示,食管鱗癌組織中FOXD1 mRNA及蛋白表達量高于癌旁組織,而FOXD3 mRNA及蛋白表達量低于癌旁組織。同時發現,上述分子表達在不同浸潤深度、腫瘤TNM分期和淋巴結轉移患者中存在顯著差異,表明FOXD1和FOXD3表達可能與食管鱗癌惡性生物學行為有關。進一步建立多因素COX比例風險模型分析可知,TNM分期、淋巴結轉移、以及FOXD1與FOXD3的表達是影響ESCC患者總生存率的獨立危險因素,推測其主要通過影響腫瘤侵襲轉移能力及細胞敏感性[20],進而影響患者預后。由此可見FOXD1、FOXD3表達的高低與食管鱗癌患者預后有著密切的聯系。

綜上,FOXD1、FOXD3的異常表達是食管鱗癌患者預后的獨立危險因素,二者有望成為臨床評估食管鱗癌患者預后的潛在分子標志物。