骨關節炎模型構建的研究進展

楊博 劉峻承 鄭德勇 代國梅 晏和國

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是以關節軟骨局灶病變、軟骨下骨肥厚反應和關節邊緣骨贅形成為特征的慢性關節疾病[1]。關節疼痛是骨關節炎的主要臨床癥狀,伴有關節畸形、運動障礙等不良后果,嚴重影響了患者的生活質量[2,3]。由于多種社會及人文因素,OA發病群體不斷擴大,目前的發病率居高不下[4],是常見的關節炎癥疾病。骨關節炎的發病已經嚴重影響著人民群眾的生產生活,極大的降低了中老年人的生活質量[5]。目前骨關節炎的診療研究領域不僅有內科藥物治療、外科手術治療、物理療法等,還包括中醫、西醫、中西醫結合等藥物及非藥物治療方案的探討和研究[6]。設計并選擇合適的實驗研究模型成為實驗可行性、結果可信度的重要保證。通過查閱國內外文獻,本文旨在綜述各類骨關節炎模型的構建思路,并分析比較各模型建立的優勢及目前OA模型建立存在的問題,為骨關節炎的相關科學研究提供更多參考。

1 造模實驗動物

在解剖結構、發病基礎、病情進展等方面同人類相似的造模實驗動物是較為理想的動物模型,但難以同時做到,所以應選擇模型構建的不同側重點[7]。見表1。

表1 常見模型動物優勢及劣勢分析表

選擇造模動物的主要參考因素是實用性,應當依據各模型動物的特色和實驗研究方向選擇合適的造模動物[18]。

2 常見造模方式

依據OA造模的干預形式,動物模型可分為自發模型、誘發模型(手術型或非手術型)、轉基因模型;依據造模過程中干預手段的多寡也可以分類為單因素造模方式及復合因素造模方式。

2.1 自發OA模型 自發OA模型即實驗動物無任何有意識的人工處理,在自然情況下自發產生的或由基因突變致病后經定向培育使之具有穩定遺傳特性的實驗動物。該動物模型具有以下優點:模型在自然條件下發生疾病,與人類疾病的發生發展相似度高,應用價值高。但該類模型存在存活率低、造模周期長、遺傳病多、購買及飼養費用高的劣勢。在豚鼠自發性膝骨關節炎相關研究中,康鑫源[19]對不同月齡的Dunkin-Hartley豚鼠進行研究,證實該豚鼠在自然生長狀態下3月齡時會出現輕度關節軟骨退變,且病情隨著時間逐漸加重。此外,高齡的STR/ort小鼠可作為骨關節炎的自發動物模型,其疾病病理學始于生命早期,并顯示出許多類似于人類原發性OA的特征[20,21]。來源于B6C3F1小鼠的BCBC/Y小鼠[22]也能夠自發發生OA,以踝關節為典型的OA損傷部位,伴有關節腫脹和畸形,關節軟骨變薄且有裂隙及侵蝕,關節邊緣多形成骨贅,并且隨著鼠齡增長小鼠多有癱瘓。此外長壽命及大關節的動物也可用于自發性OA模型的建立,類似于靈長類動物,但飼養周期長,可復制性不高,造模成本大[23]。

2.2 誘發模型 是較為常用的OA造模方式,又稱為實驗性動物模型。指研究者使用物理的、化學的或生物的單一或復合性因素作用于動物,造成動物的組織、器官或全身損害,或動物機體在功能、代謝、形態方面的改變。該類造模方式具有重復性高、人工可控的優點,但存在自然疾病差異性、實驗局限性的不足。可分為手術誘發和非手術誘發:

2.2.1 手術誘發:OA模型的建立可通過手術干預造模動物關節的生理狀態,形成人為的OA關節模型。傳統的造模方法有Hulth法[24]及其改良法,傳統方法即切除模型動物膝關節前交叉韌帶、后交叉韌帶、內側副韌帶以及摘除內側半月板。鄧紫婷等[25]運用此方法研討體外沖擊波對兔膝骨關節炎軟骨組織中轉化生長因子β1和白介素1β表達的影響。

此后因實驗需要,人們對傳統的Hulth造模法進行改良建立OA關節模型,改良Hulth造模法相對傳統方法具有造模成功率高、相對術式簡單、造模周期短的優勢[26]。其改良方法多以簡化傳統Hulth造模法為主,如在犬早期骨關節炎模型研究中,通過前交叉韌帶的橫切造模,觀察早期骨關節炎模型;李騰[27]通過切斷SD大鼠踝關節外側副韌帶制造出SD大鼠踝關節骨性關節炎模型。關節軟骨劃傷也屬于手術造模中的一種[28],但多在術后采用被動運動等復合因素形成的骨關節炎模型。此外,亦有由外部強力引起關節損傷后誘發的OA模型有助于研究損傷型的骨關節炎[29,30],研究者總結為非侵入型,常用于犬類、鼠類、兔類關節損傷后誘發的OA模型[23]。

手術方法也有不直接作用于關節的:廖源[31]采用3月齡雌性大鼠去卵巢的方式造模;戴七一等[32]采用血流阻斷法導致造模關節血供不足形成OA模型,避免了關節手術創傷及術后的炎癥,其中一種方式以阻斷造模關節周圍靜脈為主,造成關節骨內高壓從而誘導形成類似骨關節炎的模型;但由于造模時間長,造模成功率不高[33],目前使用該種造模方式較少,但仍可用于研究骨關節炎的早期發病。

2.2.2 非手術誘發:非手術誘發的OA關節模型即采用其他方式,如關節固定、關節注射、關節強迫運動等物理化學方式建立模型。研究認為OA的關節損傷絕大部分都是由關節組織的機械損傷引起的,病理力學是引起臨床OA病情進展的關鍵因素[34]。因此傳統Videman造模法[35]是經典的誘導性體外關節制動造模法,該方法可較好地模擬人類膝骨關節炎但避免了手術創傷和關節內操作的影響。在之后的研究及動物造模中人們不斷改進,形成了改良的Videman法,史曉偉等[36]應用改良Videman法建立早期KOA兔模型,使用醫用膠帶及高分子固定繃帶進行制動4周;高分子繃帶固定與普通石膏固定造模相比去繁就簡,局部固定穩定性好,關節角度可控,并且固定裝置使膝關節完全暴露,局部透氣性較好[37]。易強等[38]利用非加壓固定的體外關節制動造模方式,構建無皮膚軟組織損傷的兔膝OA模型,其造模效果與傳統Videman造模法比較,效果一致,但對皮膚軟組織的保護強于后者。

通過向關節腔內注射損害關節的藥物造模稱為關節腔內注射模型,藥物有木瓜蛋白酶、透明質酸酶、膠原酶、菲律賓菌素、碘乙酸鹽、碘醋酸鹽等[22]。馮帥華等[39]采用木瓜蛋白酶膝關節腔注射于3月新西蘭兔關節方式造模。謝平金等[40]采用木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸混合溶液在大鼠左膝關節腔注射后,結合末次運動控制方式建立早期膝骨關節炎模型。也有利用富血小板血漿(Platelet-rich Plasma,PRP)等新的制劑關節腔注射造模的方式[41]。柳占彪等[42]用4%木瓜蛋白酶泊洛沙姆溶液膝關節注射0.05 ml,50℃作用2 h建立OA模型。

但筆者發現注射藥物差別及其具體濃度、計量對關節模型構建影響的相關研究較少。周康等[43]證實關節腔注射碘乙酸能較快建立大鼠OA模型,并且具有劑量效應,隨著劑量的加大,大鼠關節損傷越嚴重。王明建等[44]發現木瓜蛋白酶、碘乙酸鈉和Ⅱ型膠原蛋白酶注射均可構建大鼠KOA模型,且雌雄組別無顯著差異,碘乙酸鈉模型關節病理特征更為顯著。鮑哲明等[45]探討碘乙酸鈉大鼠骨關節炎模型在不同時段的病理及軟骨下骨微結構的變化特點,認為碘乙酸鈉造模2周時達到OA中期階段,造模4周時為OA晚期階段,會造成軟骨下骨密度減低和骨小梁稀疏等骨質疏松表現,并且隨病情進展逐漸加重。

此外,研究認為骨關節炎是一種進展性關節疾病,其特征是關節軟骨生物合成和降解失衡,歸因于炎癥和生物力學因素,異常的關節負荷增加了骨關節炎的風險[46]。曹紅等[47]利用高強度跑臺運動方式造成C57BL/6小鼠膝關節軟骨損傷,誘發膝骨關節炎。

還有研究表明,高脂飲食增加了骨關節炎中骨贅的形成[48],肥胖誘導的骨關節炎可能是由全身水平的促炎介質和關節局部生物力學因素介導的[49],高脂飲食可以增加OA模型構建的成功率。

2.3 轉基因模型 隨著生物基因領域的發展,利用轉基因技術建立動物模型為骨關節炎的研究提供了新的選擇,即利用基因編輯等技術將外源基因插入動物基因組,或對動物自身基因進行突變或敲除等改變導致OA發生的模型建立方式。

唐玉玲等[22]根據基因的不同改造策略及結果,將轉基因OA模型小鼠分為三類,即基因突變小鼠模型、全身性敲除小鼠模型及條件性敲除小鼠模型;并總結出轉基因OA模型多為全身性的突變或敲除小鼠,條件性基因敲除小鼠模型構建仍然不足,但轉基因模型相較于自發性模型具有培育周期短的優點,相較誘發性模型具有創傷小及模型穩定性高的優勢,但模型成本高。吳桐等[50]通過CRISPR/Cas9技術,建立了Cdkn2a-e定點敲入的雜合子小鼠模型,可在小鼠活體內追蹤衰老經典標記物Cdkn2a(p16,p16INK4a)的表達情況,結合影像學檢查,可以實時觀察衰老和OA發生、進展的關系,但轉基因造模動物的基因序列與人類存在差異,模型研究的結果普遍性不高。Yu等[51]利用C57黑鼠和TNF-α敲除小鼠,分別建立了KOA模型,并進行全身震動干預,發現了全身震動干預引起的軟骨退行性變的新機制。

3 病證結合OA模型

病證結合的OA模型均為復合型造模方式,多在OA關節常規造模方式的基礎上復合證型演變條件,最終形成病證結合的動物骨關節炎模型。周麗[52]通過Hulth+去勢法(摘除睪丸)、Hulth+腺嘌呤灌胃構建腎陽虛KOA病證結合復合模型,且后者更為適宜;此外該實驗證實腎陽虛可能加重KOA軟骨退變程度,且腎陽虛越重KOA軟骨退變越重。陳穎穎等[53]通過實驗證實腺嘌呤濃度100mg/kg是最適腎虛骨關節炎復合模型建立濃度;袁普衛等[54]運用類似方法建立豚鼠絕經后腎虛型原發性骨關節炎模型。郭蕾等[55]在石膏制動法基礎上利用薄荷油疊加氣候箱模擬出陽虛寒凝型骨關節炎模型。有研究表明骨關節炎的證候分型與患者年齡及病程均有相關性,可以將造模動物的年/月齡及造模時間的長短考慮為病證結合型動物模型的影響因素[56]。普遍認為骨關節炎的證型是由多種病因相互作用的結果,故常有多種證型兼夾或轉變,在實際造模時可以按需求和內在規律,組合建立復合的中醫證候模型;但構建過程中干預因素多,操作較困難,模型穩定及可靠性不高,此外動物的飲食及墊料、光照等周圍環境和飼養條件也極為重要[57]。研究不同表型骨關節炎的病理機制或其效用藥物的治療方法,需要依據表型的不同特點建立,積極構建合理、穩定的實驗動物模型。具體動物模型辯證方法可參照《大鼠、小鼠辯證論治實驗方法學》[58]。

4 小結

骨關節炎模型的建立不僅是研究藥物防治OA的基礎,還可以通過模型的建立研究骨關節炎形成各期的生理病理表現[59,60];然而完美的骨關節炎模型,即創建盡可能準確地模擬人類疾病的模型是基本不存在的[61],有研究者對不同造模方式進行對比研究,認為OA模型都以模型動物關節軟骨病理改變為主[62]。骨關節炎動物模型的建立可依據研究的必要性,或相關作用藥物的關鍵影響基點不同選擇具有針對性的造模動物及造模方式,選擇方法的重點在研究目標[63]。對于藥用靶點較為復雜或同時兼具由多種治療效應的藥物,在其實驗的造模階段也多可使用復合造模方式[64-66]。

目前構建OA模型的相關比較研究尚不足,例如不同種造模方式的比較或同種造模方式不同時長、不同計量比較的實驗研究相對較少;此外,構建OA模型成熟后的標準不統一,尚需實驗研究及權威規范。