circ_0003221/miR-330-3p在骨肉瘤組織中的表達及對U2-OS增殖遷移的影響

閆曉紅 方美花 王偉 張軍

骨肉瘤也稱為骨癌,在青少年中發病率最高,復發或轉移患者生存率低,靶向治療骨肉瘤藥物的研發及臨床應用已經取得一定療效,仍需從基因層面尋找精準的靶向治療藥物[1,2]。研究表明miRNA在骨肉瘤的診斷、治療和預后中起著重要作用[3]。有研究報道,miR-330-3p在骨肉瘤組織和細胞系中的表達降低,miR-330-3p過表達顯著抑制MG-63和U2OS骨肉瘤細胞的生長[4]。circ_0032463通過調節miR-330-3p/PNN軸促進骨肉瘤的進展[5]。生物學軟件預測發現circ_0003221與miR-330-3p有結合位點。有研究報道circ_0003221(circPTK2)促進膀胱癌細胞的增殖和遷移[6]。circPTK2在胃癌組織和細胞中上調表達,下調circPTK2抑制胃癌腫瘤的生長和轉移[7]。然而筆者發現circ_0003221對骨肉瘤細胞增殖和遷移的影響尚不清楚。本試驗旨在研究circ_0003221是否通過調控miR-330-3p影響骨肉瘤細胞增殖和遷移,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2021年1月我院收治的37例骨肉瘤患者,通過手術取其瘤組織、瘤旁組織,患者均知情且同意。

1.2 細胞與主要試劑 U2-OS細胞(美國ATCC);RPMI-1640培養基、MTT試劑盒(美國Sigma公司);Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物);Transwell小室(美國康寧公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國AAT Bioquest)。

1.3 細胞處理與分組 U2-OS細胞常規培養于RPMI-1640培養基中,取對數生長期細胞,將si-NC、si-circ_0003221、miR-NC、miR-330-3p mimic分別轉染至U2-OS細胞,記為si-NC組、si-circ_0003221組、miR-NC組、miR-330-3p mimic組;將si-circ_0003221分別與anti-miR-NC、miR-330-3p Inhibitor共轉染至U2-OS細胞,記為si-circ_0003221+anti-miR-NC組、si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor組。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circ_0003221和miR-330-3p的表達水平 轉染結束后提取組織及各組細胞的總RNA,合成cDNA后進行PCR檢測,相對表達量用2-ΔΔCt法計算。以β-actin和U6為內參。

1.5 雙熒光素酶報告實驗 將circ_0003221野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC和miR-330-3p共轉染至U2-OS細胞,并且按說明書檢測熒光素酶活性。

1.6 MTT檢測細胞增殖抑制率 各組細胞培養48 h,加入20 μl MTT溶液培養4 h,加入150 μl二甲基亞砜,反應15 min,酶標儀檢測490 nm處吸光度值(OD),計算增殖抑制率。

1.7 克隆形成實驗檢測集落形成數 各組細胞接種于6孔板,培養2周,經甲醇固定和結晶紫染色,低倍光學顯微鏡下計數>50個細胞的集落。

1.8 Transwell檢測細胞遷移數 將100 μl無血清培養基懸浮的細胞添加到Transwell上室,培養48 h,用棉簽除去膜頂表面上未遷移的細胞;甲醇固定30 min,結晶紫染色30 min,用PBS輕輕清洗2次,倒置顯微鏡拍攝并計數細胞。

1.9 劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率 將各組細胞接種在培養板中培養,細胞鋪滿板底后用槍頭直線劃痕,用PBS沖洗劃下的細胞,換液后繼續培養,在培養0 h和48 h后拍照觀察,用Image-Pro Plus6.0軟件計算劃痕愈合率。

2 結果

2.1 circ_0003221和miR-330-3p在骨肉瘤組織中的表達 骨肉瘤組織中circ_0003221表達水平高于瘤旁組織,而miR-330-3p表達水平低于瘤旁組織(P<0.05)。見表1,圖1。

表1 circ_0003221和miR-330-3p在骨肉瘤組織中的表達 n=37,

2.2 circ_0003221和miR-330-3p相關性分析 Pearson分析結果顯示,circ_0003221和miR-330-3p的表達水平呈負相關(r=-0.9271,P<0.05)。見圖2。

圖2 circ_0003221和miR-330-3p呈負相關

2.3 circ_0003221和miR-330-3p對U2-OS增殖的影響 與si-NC組相比,si-circ_0003221組circ_0003221表達水平降低(P<0.05),U2-OS細胞增殖抑制率升高,克隆形成數減少(P<0.05);與miR-NC組相比,miR-330-3p mimic組U2-OS細胞增殖抑制率升高,克隆形成數減少(P<0.05);與si-circ_0003221+anti-miR-NC組相比,si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor組U2-OS細胞增殖抑制率降低,克隆形成數增加(P<0.05)。見表2。

表2 circ_0003221和miR-330-3p對U2-OS增殖

2.4 circ_0003221靶向調控miR-330-3p Circular RNA Interactome預測顯示circ_0003221和miR-330-3p有結合位點;miR-330-3p與wt-circ_0003221共轉染后細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與si-NC組相比,si-circ_0003221組miR-330-3p表達水平升高(P<0.05)。見表3、4,圖3。

圖3 circ_0003221靶向調控miR-330-3p和miR-330-3p互補序列

表3 雙熒光素酶報告實驗結果 n=9,

表4 circ_0003221調控miR-330-3p的表達 n=9,

2.5 circ_0003221和miR-330-3p對U2-OS遷移的影響 與si-NC組相比,si-circ_0003221組U2-OS細胞遷移數減少,劃痕愈合率降低(P<0.05);與miR-NC組相比,miR-330-3p mimic組U2-OS細胞遷移數減少,劃痕愈合率降低(P<0.05);與si-circ_0003221+anti-miR-NC組相比,si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor組U2-OS細胞遷移數增加,劃痕愈合率升高(P<0.05)。見表5。

表5 circ_0003221和miR-330-3p對U2-OS遷移能力

3 討論

作為兒童和青少年中普遍存在的骨腫瘤,骨肉瘤的發病和轉移機制仍未完全明確。盡管骨肉瘤治療方法(如輔助化療和手術切除)取得了進展,但患者生存率仍不令人滿意；且尚缺乏骨肉瘤的特異性診斷和預后生物標志物。分子靶向治療是骨肉瘤的治療方式之一,其具有更強的精準性及特異性,已成為獲得更佳治療效果的新希望[8,9]。因此,本實驗通過研究骨肉瘤的分子機制以尋找可靠的分子靶點。

已發現circRNA表達異常與各種癌癥的發病機制相關,并對基因表達、細胞侵襲、細胞周期進程、遷移、凋亡和增殖產生重要的調節作用。此外,鑒于其結構穩定性、進化保守性、豐度和器官特異性,circRNA被認為具有很高的診斷和治療潛力。circ_0003221(也稱為circPTK2,chr8:141856358-141900868)是近年來新發現的一種circRNA,據報道circ_0003221在宮頸癌組織和細胞中上調;敲除circ_0003221可抑制宮頸癌細胞的細胞增殖、遷移、侵襲[10]。circPTK2通過調控miR-92a抑制肝癌細胞增殖和遷移[11]。敲低circPTK2可抑制胃癌細胞增殖,并促進凋亡[12]。以上研究表明circ_0003221(circPTK2)可參與多種腫瘤的發生發展過程,有望作為腫瘤的可靠分子靶點。但筆者未找到關于circ_0003221對骨肉瘤影響的相關研究結論。

本實驗檢測了骨肉瘤組織中circ_0003221的表達,結果顯示,骨肉瘤組織中circ_0003221表達水平升高,提示circ_0003221可能在骨肉瘤中起促癌作用。進一步干擾circ_0003221后,U2-OS細胞增殖抑制率升高,克隆形成數和遷移細胞數減少,劃痕愈合率降低;表明干擾circ_0003221可抑制骨肉瘤U2-OS細胞增殖和遷移。提示,circ_0003221或可成為骨肉瘤的分子治療靶點。

circRNA可以通過與miRNA反應元件競爭性結合,作為競爭性內源性RNA(ceRNA),也稱為miRNA海綿,調節下游靶基因的表達?；谶@種調控,circRNA可以作為miRNA海綿來調控靶基因的表達,形成調控circRNA-miRNA-mRNA網絡。miR-330-3p在多種癌癥中充當抑癌基因,研究報道miR-330-3p通過下調CELF1的表達抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移[13]。miR-330-3p通過靶向RIPK4抑制卵巢癌的進展[14]。在三陰性乳腺癌中,Circ-PGAP3可通過下調miR-330-3p表達促進三陰性乳腺癌的惡性進展[15]。此外,已有研究證實miR-330-3p過表達能抑制骨肉瘤細胞的生長[4]。

本實驗結果顯示,骨肉瘤組織中miR-330-3p表達水平降低,過表達miR-330-3p可抑制骨肉瘤U2-OS增殖和遷移;與前人研究結果相符,表明miR-330-3p在骨肉瘤中起抑癌作用。且本試驗發現circ_0003221與miR-330-3p的表達呈負相關;生物信息學預測顯示,circ_0003221與miR-330-3p存在互補的結合位點;雙熒光素酶證實,circ_0003221與miR-330-3p存在相互作用,且RT-qPCR結果顯示敲低circ_0003221可上調miR-330-3p表達,表明circ_0003221可靶向負調控miR-330-3p;推測miR-330-3p可能是circ_0003221參與骨肉瘤進展的下游靶基因。為了驗證此推測,本研究在干擾circ_0003221的基礎上采用miR-330-3p inhibitor轉染來下調miR-330-3p表達,結果發現抑制miR-330-3p表達可逆轉干擾circ_0003221對U2-OS細胞增殖和遷移的影響。提示干擾circ_0003221可能通過靶向上調miR-330-3p表達抑制骨肉瘤U2-OS細胞增殖和遷移。

綜上所述,circ_0003221在骨肉瘤組織中高表達,干擾circ_0003221可通過上調miR-330-3p抑制骨肉瘤細胞U2-OS增殖、遷移;circ_0003221、miR-330-3p均可能作為骨肉瘤分子治療的靶點。