甲基轉移酶SETDB1和SOX7甲基化在口腔癌中的相關性研究

郝妍 白相宇 霍峰 陳喜波

口腔癌是我國常見惡性腫瘤,發病率逐年遞增,其具有侵襲性,預后較差的特點,5年生存率僅45%左右[1,2]。基因序列改變是造成癌癥的發生發展的重要因素,但基因的表觀遺傳變化在腫瘤中也發揮著關鍵性作用[3]。研究發現,口腔癌中某些關鍵抑癌基因的甲基化修飾可影響基因表達,進而調控口腔癌的生物學功能,最終影響患者的預后[4,5]。SOX7在口腔鱗癌中可以發生甲基化修飾,且具有一定特異性,但其作為分子診斷的敏感度相對較低[6]。因此,探討口腔癌SOX7基因甲基化修飾上游分子至關重要。SETDBl是組蛋白甲基化轉移酶家族中重要一員,參與多種基因的甲基化修飾,并與多種腫瘤密切相關[7,8]。SETDBl可催化基因的甲基化,但其作為甲基化轉移酶對SOX7的甲基化修飾作用尚不明確。本研究中通過檢測口腔癌中SOX7基因的甲基化水平、SETDBl的表達,分析SETDBl表達與SOX7基因甲基化的相關性,探討口腔癌的發病機制。

1 材料與方法

1.1 組織標本與細胞 取口腔外科手術治療的口腔鱗癌患者癌組織及癌旁組織各52例。納入研究的患者均無其他腫瘤病史,手術前均無任何治療史。52例患者中,男39例,女13例;≥60歲35例,<60歲17例;TNM分期:I期17例,Ⅱ期22例,Ⅲ期13例;高分化11例,中分化32例,低分化9例;有淋巴結轉移12例,無淋巴結轉移40例?？谇话㎏B細胞購自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 甲基化試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司;DNA提取試劑購于深圳市益百順科技有限公司;SETDBl單克隆抗體購于中國Abeam公司;免疫組化SP試劑盒和濃縮型DAB試劑均購自廣州威佳科技有限公司;RNA引物由南京聚雄華生物科技有限公司設計合成。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸測序:對癌組織和癌旁組織提取DNA并進行亞硫酸鹽轉化,將DNA擴增產物進行焦磷酸測序,PyroQ-CpG軟件分析位點甲基化狀態,計算甲基化率。甲基化引物序列:F,5’-GTTTTGGACGTCGAGTTGTC-3’R,5’-AACCCAAACCATAAAAACGTT-3’。PCR反應條件:95℃,預變性10 min,1個循環;94℃,變性,45 s,退火45 s,72℃,延伸45 s,共35個循環;72℃再延伸10 min。

1.3.2 免疫組織化學法:組織切片脫蠟,高溫修復抗原。山羊血清封閉,加入一抗過夜(SETDB1抗體,1∶1 000;SOX7抗體,1∶1 000)。次日二抗孵育,DBA顯色,蘇木素復染。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR):提取RNA,應用RNA反轉錄試劑盒反轉錄。熒光定量試劑盒檢測目的基因mRNA。

1.3.4 細胞培養及轉染:細胞常規培養口腔癌KB細胞,以轉染siRNA SETDBl細胞為實驗組(si-SET),轉染無siRNA細胞為陰性對照組(si-N),正常細胞為空白對照組(NC)。細胞懸液計數,接種到6孔板。用30 μl 1×riboFECT CP Buffer(V1)稀釋1.25 μl 20 μmol/L siRNA儲存液(V2),輕輕混勻,室溫孵育;加入3 μl riboFECT CP Reagent(V3),混勻孵育;將riboFECT CP混合液加入到465.75 μl細胞培養基(V4)中,使總體積達到500 μl,混勻;繼續培養48 h后以熒光倒置顯微鏡觀察轉染效果。

1.3.5 Western Blot:提取總蛋白,測定濃度,制備電泳蛋白上樣液,行凝膠電泳。電泳后,轉膜。加一抗4℃過夜。次日孵育二抗,重復洗膜后顯影。

2 結果

2.1 口腔癌和癌旁組織中SOX7甲基化水平 口腔癌組織和癌旁組織中,SOX7基因甲基化率分別為(62.34±2.14)%和(11.41±1.87)%,二者差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 口腔癌和癌旁組織中SOX7甲基化率 %,

2.2 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1mRNA相對表達量 口腔癌組織中SOX7 mRNA相對表達量為低于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。癌組織中SETDB1 mRNA相對表達量高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1 mRNA相對表達量

2.3 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1蛋白表達量 癌組織SOX7蛋白陽性表達率低于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。癌組織SETDB1蛋白陽性表達率高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、2,表3。

圖1 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1蛋白表達(HE ×200);CT 癌組織,PT 癌旁組織

圖2 口腔癌和癌旁組織中SETDB1和SOX7蛋白表達量(Western Blot);CT 癌組織;PT 癌旁組織

表3 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1蛋白表達量 %,

2.4 口腔癌組織中SOX7甲基化和SETDB1的相關性 SOX7甲基化和SETDB1表達,呈正相關(r=0.324,P<0.05)。見表4。

表4 癌組織中SOX7甲基化與SETDB1表達的相關性 例

2.5 口腔癌組織中SOX7甲基化及SETDB1與臨床病理特征的相關性 SOX7甲基化與口腔癌TNM分期、組織分化及淋巴結轉移相關(P<0.05),與性別和年齡無關(P>0.05)。SETDB1陽性表達與TNM分期、分化程度及淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。見表5。

表5 口腔癌組織中SOX7甲基化、SETDB1與臨床病例特點的關系

2.6 RNA干擾下調SETDB1后KB細胞中SETDB1和SOX7的表達 Rt-qPCR和Wesrern Blot結果顯示,si-SET、si-N和NC組中,以si-SET組SETDB1 mRNA和蛋白表達最低,而si-N和NC組SETDB1 mRNA和蛋白表達無差異。SETDB1 si-RNA干擾在KB細胞中成功。si-SET組SOX7 mRNA和蛋白表達最高,明顯高于si-N和NC組,而si-N和NC組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3～5,表6,7。

明視野 熒光顯微鏡 明視野與熒光顯微鏡的疊加

圖4 RNA干擾SETDB1轉染KB細胞后SETDB1蛋白表達量;Si-SET SETDB1 si-RNA組,Si-N 陰性對照組,NC 空白對照組

圖5 RRNA干擾SETDB1轉染KB細胞后SOX7蛋白表達量;Si-SET SETDB1 si-RNA組;Si-N 陰性對照組;NC 空白對照組

表6 RNA干擾SETDB1轉染KB細胞后SETDB1 mRNA相對表達量 %,

表7 RNA干擾SETDB1轉染KB細胞后SOX7 mRNA相對表達量

2.7 Si-RNA干擾 SETDB1對口腔癌KB細胞SOX7甲基化的影響 焦磷酸測序檢測結果顯示,si-SET組SOX7甲基化水平最低(P<0.05),而si-N和NC組差異無統計學意義(P>0.05),提示抑制甲基轉移酶SETDB1的表達可以明顯降低KB細胞中SOX7甲基化水平。見表8。

表8 干擾SETDB1后3組細胞內SOX7甲基化率 %,

3 討論

口腔癌是是全世界范圍內高發癌癥,也是我國一種常見的頭頸部惡性腫瘤,其發病率和死亡率逐年增加,嚴重影響人民群眾的生命健康[9,10]。針對口腔癌的綜合治療使得患者整體生存期有所提高,但預后仍然較差[11]。因此,從基因分子水平探究口腔癌發病機制,為口腔癌的早期診斷和治療提供新的靶點成為本領域研究的首要任務。

現代分子生物學研究顯示,表觀遺傳學重點甲基化修飾幾乎存在于所有的腫瘤細胞內,該變化參與多種腫瘤的發生發展[12]。人體細胞內基因異常的甲基化修飾使多種腫瘤基因的轉錄、翻譯和表達異常,最終導致腫瘤的發生發展、轉移、惡化[13,14]。SOX7是編碼轉錄因子SOX基因家族中的重要一員,參與多種生命體活動。SOX7在多種惡性腫瘤中呈現低表達狀態,與前列腺癌和膀胱癌的增殖、侵襲和轉移相關[15,16]。進一步研究表明,SOX7基因在肝癌和肺癌中呈高甲基化狀態,且甲基化與腫瘤的增殖、侵襲和轉移密切相關[17,18]。

本研究通過檢測口腔癌組織中SOX7甲基化進行分析,結果表明SOX7基因在口腔癌組織中發生了甲基化,且其甲基化率明顯高于癌旁組織。口腔癌組織中SOX7的高甲基化狀態與腫瘤的TNM分期、分化以及淋巴結的轉移具有相關性;結果說明SOX7基因的高甲基化可能與口腔癌的增殖、侵襲和轉移密切相關。進一步檢測SOX7的表達水平發現,癌組織中SOX7 mRNA和蛋白的表達水平顯著下降,提示SOX7可能因其發生甲基化而抑制了基因的轉錄和蛋白的表達。筆者推測,SOX7可能在口腔癌組織中扮演了“抑癌因子”的角色,其高甲基化狀態使其基因表達抑制或缺失,進而促進了口腔癌的進展。

甲基轉移酶的參與癌基因的甲基化修飾,且其動態變化對腫瘤的發生和發展起了至關重要的作用[19]。有學者研究發現,多種甲基轉移酶家族中蛋白質在腫瘤中呈現高表達,與腫瘤關系密切[20,21]。研究顯示,甲基轉移酶的異常表達與其甲基化異常有關,參與了多種腫瘤的增殖、侵襲和轉移[22,23]。

SETDB1是一種重要的甲基化轉移酶,參與多種腫瘤的發生[24]。本研究結果顯示,口腔癌組織中SETDB1 mRNA和蛋白的表達均顯著明顯升高,且其陽性表達與口腔癌的分期、癌分化和淋巴結轉移相關。隨著腫瘤分期的增加、腫瘤分化的降低,SETDB1表達量上升;且SETDB1在有淋巴結轉移者中的表達明顯高于無淋巴結轉移組織。這提示SETDB1可能增強了口腔癌細胞的增殖侵襲能力,進而使口腔癌的惡性程度增強。

研究證實,聯合降低多種甲基化轉移酶可使腫瘤細胞的整體基因甲基化率明顯下降,并促進多種癌癥的發生[25]。目前國內外研究中,SETDB1作為一種甲基化酶是否參與SOX7甲基化的修飾尚未見相關研究。本研究統計分析結果顯示,口腔癌組織中SOX7高甲基化與SETDB1的陽性表達具有相關性,二者呈正相關。提示SETDB1作為甲基化轉移酶參與了SOX7基因的甲基化,可能促進了口腔癌的增殖、侵襲和轉移,SETDB1可能是促進SOX7基因發生甲基化的一個重要上游分子。體外實驗結果顯示,SETDB1表達下調后SOX7基因發生了去甲基化,且SOX7 mRNA和蛋白表達均顯著上升。這提示抑制甲基化轉移酶SETDB1的表達可以降低SOX7基因甲基化率,促進SOX7的表達,進而發揮其促癌作用。同時也說明,在口腔癌中SETDB1可以作為甲基化轉移酶催化SOX7發生甲基化修飾。

綜上所述,在口腔癌中甲基化轉移酶SETDB1與SOX7甲基化修飾密切相關,SETDB1的高表達促進了SOX7高甲基化狀態,二者可能是促進口腔癌發生發展的重要分子學生物事件。