潰瘍性結(jié)腸炎患者臨床特征及腸道菌群變化分析

周淑萍 盛曉曼 蔣燦燦

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)屬于多因素起源的慢性腸道炎癥,病變可浸潤(rùn)至黏膜層和黏膜下層,可由遠(yuǎn)向近侵及整個(gè)結(jié)腸[1,2]。UC在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率居高不下,在發(fā)展中國(guó)家也不斷攀升,UC發(fā)病率較克羅恩病高出很多[3,4]。UC病程從無癥狀、輕度到廣泛結(jié)腸病變不等,有20%～30%的UC患者可出現(xiàn)侵襲性病程,其中10年內(nèi)累積復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為70%～80%,近半數(shù)的患者需住院治療[5]。因此,早期分層和早期識(shí)別有疾病進(jìn)展和(或)重癥風(fēng)險(xiǎn)的患者是潰瘍性結(jié)腸炎治療的關(guān)鍵。盡管UC的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,當(dāng)前被廣泛接受的病因?qū)W框架涉及遺傳易感性、微生物與環(huán)境生態(tài)失調(diào)和免疫反應(yīng)異常等,人們普遍認(rèn)為腸道微生物生態(tài)失衡與UC的發(fā)病機(jī)制存在密切聯(lián)系,而腸道微生物群被認(rèn)為是反映UC自然史的“指紋”,因?yàn)槠渑cUC臨床嚴(yán)重程度、緩解和突發(fā)反應(yīng)等有關(guān)[6,7]。來自UC患者的腸道菌群通常以兼性厭氧菌的相對(duì)豐度增加,以及專性厭氧菌的消耗為特征[8]。短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)是厭氧菌對(duì)復(fù)雜且難消耗糖鏈進(jìn)行生化分解的最終產(chǎn)物,若產(chǎn)生SCFA的保護(hù)性細(xì)菌數(shù)量減少,可使黏膜通透性增加,相反,某些細(xì)菌濃度升高會(huì)增加有毒代謝物的產(chǎn)生,例如,H2S會(huì)增加黏膜通透性并阻斷丁酸鹽代謝[9]。丁酸鹽是SCFA的一種,除了改善上皮和黏膜屏障功能以外,還可為結(jié)腸細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖提供能量[10]。微生態(tài)學(xué)缺陷以及相關(guān)的代謝途徑和分子機(jī)制在UC腸黏膜的先天免疫中起著關(guān)鍵作用,鑒于世界范圍內(nèi)UC患病率的不斷增加,以及失調(diào)性腸道微生物與UC關(guān)系的研究熱度較高,本文聚焦于UC發(fā)病的宿主易感因素,觀察UC患者腸道菌群的特征性變化,以期為UC臨床靶點(diǎn)的尋找提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年4月至2021年12月就診淮南市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科的UC患者50例為UC組,男24例,女26例;平均年齡(49.84±14.19)歲;經(jīng)結(jié)腸鏡檢查及病理組織學(xué)確認(rèn),均符合2018年《中國(guó)炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。對(duì)照組為同時(shí)期就診的30例健康者,男14例,女16例;平均年齡(48.90±11.27)歲;經(jīng)檢查均無消化道疾病。取樣前4周所有納入人員均未給予抗生素等藥物干預(yù)。

1.2 樣本采集 留取上述納入人員新鮮糞便6 g,凍存于-80℃冷凍庫(kù)中。同時(shí)收集納入人員的基本情況(包括病程、年齡、性別、既往史等)及臨床特征等。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取:按說明書操作提取樣品的DNA,通過紫外微量分光光度計(jì)及凝膠電泳檢測(cè)對(duì)DNA濃度進(jìn)行定量,隨后評(píng)價(jià)DNA完整性(Agilent 2100),質(zhì)控合格的DNA納入文庫(kù)構(gòu)建。

1.3.2 文庫(kù)構(gòu)建:以不同樣本DNA為模板,選擇16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,并加上測(cè)序儀所需的接頭、測(cè)序引物和index序列,構(gòu)建文庫(kù)。

1.3.3 16S rRNA測(cè)序:使用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析:對(duì)測(cè)序結(jié)果予以質(zhì)控及過濾得到新的優(yōu)化后序列,繼而采用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類分析,并對(duì)這些優(yōu)化序列進(jìn)行可操作分類單位(operational taxonomic units,OTUs)分析。并通過宏基因組分析手段對(duì)不同樣本間的菌群進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 UC患者臨床主要特征表現(xiàn) 50例UC患者慢性復(fù)發(fā)型40例(80%),發(fā)病時(shí)處于活動(dòng)期42例(84%),且重度較多(19例),多累及全部結(jié)腸(25例)。見表1。

表1 入組患者的疾病特征

2.2 病變范圍與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系 不同病灶位置與疾病的嚴(yán)重程度存在相關(guān)性(P<0.05),即UC波及范圍越廣,其病情越重。見表2。

表2 病灶范圍與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系 例

2.3 腸道菌群構(gòu)成 使用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)UC組和對(duì)照組的腸道微生物群的構(gòu)成進(jìn)行了分析,2組樣本共檢出11個(gè)門。2組樣本均以擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,但菌群的比例結(jié)構(gòu)存在明顯差異,相較于正常對(duì)照組,UC患者腸道菌群構(gòu)成的多樣性顯著減少,且UC組變形菌門的相對(duì)豐度明顯更高(P<0.01)。見表3,圖1。

圖1 門水平上2組豐度比較

表3 UC患者組和健康對(duì)照組腸道菌群門水平物種相對(duì)豐度比較 %,中位數(shù)(范圍)

2.4 重度UC的腸道菌群變化 研究對(duì)比UC組和對(duì)照組中腸道微生物群的分布情況發(fā)現(xiàn),在屬水平上,與Hespellia菌屬、Faecalibacterium(普拉梭菌)、Enterococcus(腸球菌)、Atopobium(奇異菌屬)、Streptophyta(鏈形植物)相比,UC組大腸桿菌的比例升高最明顯(P=0.028)。見表4。

表4 UC患者組和健康對(duì)照組腸道菌群的特征菌屬比較 %,中位數(shù)(范圍)

3 討論

UC作為一種炎癥性腸道疾病,其臨床表現(xiàn)多為復(fù)發(fā)與緩解交替出現(xiàn),且以易反復(fù)、診療困難等為特點(diǎn)。長(zhǎng)期以來,UC的發(fā)病率持續(xù)走高,對(duì)全球數(shù)百萬人的正常生活造成困擾。臨床資料分析顯示,有4/5的UC患者處于慢性復(fù)發(fā)型,且絕大多數(shù)是活動(dòng)期(占比84%),同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn),病變范圍未超過左半結(jié)腸的多為輕度UC,而超出左半結(jié)腸的以重度為主,即病變范圍與疾病的嚴(yán)重度密切相關(guān)。

目前的研究報(bào)告了UC患者腸道微生物群平衡的變化,這是微生物菌群在UC發(fā)病機(jī)制中可能起作用的基礎(chǔ)。盡管尚不清楚生態(tài)失調(diào)是腸道炎癥的病因還是結(jié)局,但許多研究表明,腸道微生物群是宿主免疫系統(tǒng)、腸道相關(guān)淋巴組織的關(guān)鍵元素[12]。在健康條件下,寄居于腸道的微生物數(shù)量約是人體細(xì)胞數(shù)的10倍[13]。腸道微生物群主要定植于胃腸道,特別是在結(jié)腸中,后者可為其提供生長(zhǎng)所需的氧和營(yíng)養(yǎng)[14]。盡管腸道微生物群的組成存在相當(dāng)大的個(gè)體差異,但在較高的分類水平下,不同個(gè)體間微生物群是相似的。放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門是腸道微生物的四個(gè)主要門,其中擬桿菌門和厚壁菌門占比九成以上[15]。

眾所周知,腸道菌群不但可以維持胃腸道正常生理功能,還是阻止其他胃腸道病原體入侵的屏障。腸道微生物的穩(wěn)態(tài)是維護(hù)腸道正常功能的關(guān)鍵,而微生物群的生態(tài)失調(diào)可能是某些疾病的促成因素。腸道黏膜的完整性取決于它與腸道微生物群間的相互平衡,若兩者間出現(xiàn)不平衡狀態(tài),勢(shì)必會(huì)影響腸道防御功能及免疫調(diào)節(jié)功能。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組,UC組中微生物群的多樣性明顯減少,且以厚壁菌門表達(dá)顯著降低為主,這與其他研究者的結(jié)論相同[16-18]。此外,在許多腸道微生物組研究以及我們的分析中,已經(jīng)觀察到健康受試者以及UC患者中腸道菌群顯示出巨大的個(gè)體差異,進(jìn)一步驗(yàn)證表明,UC患者腸道中變形菌門所占比例明顯增加,且以大腸桿菌的增加為主,這與健康參與者的構(gòu)成比例顯著不同,該結(jié)果與Forbes等[19]的結(jié)論相似。有研究表明,大腸桿菌與炎癥相關(guān),因其可產(chǎn)生大量過氧化氫,這反過來又導(dǎo)致厭氧菌數(shù)量的減少,并且可以刺激免疫細(xì)胞釋放促炎因子[20]。UC患者和對(duì)照組之間的物種差異性在我們的研究中也通過分析得到證實(shí),該分析表明2組樣本中不同微生物門、屬間存在很大的差異性。UC和健康隊(duì)列之間的差異性可能是由于疾病引起的腸道微生物群環(huán)境的變化而引起的。

研究發(fā)現(xiàn)UC患者與健康者的腸道菌群存在著明確的菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)以及菌群結(jié)構(gòu)改變,但作為初步探索性研究,仍存在一定的缺陷性。首先,盡管16S rRNA分析提供了腸道中存在的微生物分類組成,但其未對(duì)微生物群在UC中發(fā)揮的作用作出分析。其次,未明確區(qū)分不同時(shí)期UC患者腸道微生物群落的差異,難以為后期治療提供依據(jù)。最后,可能需要更大的樣本量來證實(shí)我們的數(shù)據(jù),且需進(jìn)一步的研究來更好地表征腸道微生物群的代謝產(chǎn)物在UC患者中的作用。

本研究對(duì)UC的疾病特征進(jìn)行了總結(jié),并闡明腸道微生物群在UC發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。健康的微生物群具有與宿主保持體內(nèi)平衡狀態(tài)的能力,而腸道菌群穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)可有助于UC患者的轉(zhuǎn)歸。