缺氧環境下外源性雌激素對子宮內膜癌細胞上皮間充質轉化的影響及其機制

高英華，孫雯雯，靳凱宇，翟曉茜，謝浩，張毅芳，安霞，張亞，田偉，劉蕾，柳雅玲

1 山東第一醫科大學第二附屬醫院病理科，山東泰安271000；2 福建省立醫院南院病理科；3 山東醫藥技術學院生物工程系；4 山東第一醫科大學第二附屬醫院婦科；5 山東第一醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科；6 山東第一醫科大學附屬省立醫院婦科；7 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）臨床與基礎醫學院

子宮內膜癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率逐年升高并且發病人群呈年輕化趨勢。子宮內膜癌通常可分為雌激素依賴型和非雌激素依賴型兩種。其中，雌激素依賴型約占所有子宮內膜癌的85%［1］。雌激素與腫瘤細胞表面的雌激素受體（ER）結合可激活多種信號通路，在子宮內膜癌形成及浸潤、轉移中發揮重要作用［2］。缺氧是腫瘤微環境的一個顯著特征，可誘導腫瘤細胞增強侵襲和遷移能力［3］。缺氧微環境能夠上調缺氧誘導因子1（HIF-1）表達，而HIF-1α是HIF-1的活性亞基，其調控的靶基因可參與腫瘤細胞的浸潤、侵襲和遷移等生物學過程［4-6］。上皮間充質轉化（EMT）是觸發腫瘤細胞侵襲和遷移的關鍵事件［7］。而缺氧和雌激素均能通過多種信號通路激活EMT，如轉化生長因子β1（TGF-β1）、Wnt/β-catenin信號通路。2019年9月—2022年3月，本研究探討了缺氧環境下外源性雌激素對子宮內膜癌細胞EMT的影響及其機制。現報告如下。

1.料與方法

1.1.料 ER陽性的子宮內膜癌細胞Ishikawa，購自上海復祥生物科技有限公司。β-雌二醇，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。HIF-1α過表達載體（HA-HIF-1α-pcDNA3），購自北京中源合聚生物科技有限公司。所有引物由上海桑尼生物科技有限公司設計合成。siRNA-HIF-1α（5'-CAAAGUUCACCUGAGCCUAdTdT-3'）、siRNA-NC（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'），由上海希格瑪生物科技有限公司設計合成。Roche LightCycler?96 Real-time PCR系統，購自羅氏診斷產品（上海）有限公司；Spectra Max Plus 384全波長酶標儀，購自美國Molecular Devices公司；ChemiDoc XRS + 凝膠成像系統，購自美國Bio-Rad公司。超純RNA提取試劑盒、HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit、UltraSYBR Mixture，購自北京康為世紀生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；Lipofectamine 2000，購自上海希格瑪生物科技有限公司。HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、β-catenin、GAPDH一抗及山羊抗兔IgG H&L二抗，購自上海優寧維生物科技股份有限公司。

1.2.胞培養 取凍存的Ishikawa細胞，置于37 ℃恒溫水浴鍋中迅速解凍復蘇，然后接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。每2～3天更換一次培養基。待細胞生長融合90%以上時，胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。取傳3代、對數生長期、生長狀態良好的Ishikawa細胞進行后續實驗。

1.3.胞分組與干預 取Ishikawa細胞接種于6孔板，每孔2.5 × 105個，常規培養24 h。取部分Ishikawa細胞，于0.5% O2、5% CO2、94.5% N2環境中缺氧預處理2 h，隨機分為siRNA-HIF-1α組與siRNA-NC組、HIF-1α過表達組與Control組，按Lipofectamine 2000說明，siRNA-HIF-1α組、siRNA-NC組、HIF-1α過表達組分別轉染siRNA-HIF-1α、siRNA-NC、HA-HIF-1α-pcDNA3，Control組不予轉染，轉染24 h收集細胞。另取部分Ishikawa細胞，于0.5% O2、5% CO2、94.5% N2環境中缺氧預處理2 h后加入0.01 μmol/L β-雌二醇，隨機分為Estrogen組、Estrogen + siRNA-NC組、Estrogen + siRNA-HIF-1α組以及Estrogen組、Control組、Estrogen + HIF-1α過表達組，按Lipofectamine 2000說明，Estrogen + siRNA-NC組、Estrogen + siRNA-HIF-1α組、Estrogen + HIF-1α過表達組分別轉染siRNA-NC、siRNA-HIF-1α、HA-HIF-1α-pcDNA3，Estrogen組不予轉染，轉染24 h收集細胞。

1.4.IF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集上述各組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格。按HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。采用Roche LightCycler?96 Real-time PCR系統，以cDNA為模板，按UltraSYBR Mixture說明進行PCR擴增。引物序列：HIF-1α上游引物5'-AGTGTACCCTAACTAGCCG-3'、下游引物5'-CGAACCACGACTAAACAC-3'，E-cadherin上游引物5'-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3'、下游引物5'-TCCCAGGCGTAGAGGCTT-3'，N-cadherin上游引物5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'、下游引物5'-ATGCACATTCCTTCGATAAGACTG-3'，β-catenin上游引物5'-AGCTTCCAGACACGCTTCAT-3'、下游引物5'-CGGTACAACGCTGTTTCTA-3'，TGF-β1上游引物5'-GTGGAGGATGAGGATGAGGA-3'、下游引物5'-CTCGGCATTTCTCTCTCTGC-3'，GAPDH上游引物5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'、下游引物5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3'。PCR反應體系共50 μL：2 × UltraSYBR Mixture（Low ROX） 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 21 μL；反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、58 ℃30 s共40個循環。PCR反應結束，繪制熔解曲線，獲取循環閾值（CT）數。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.5.IF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集上述各組細胞，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取細胞總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。將蛋白樣品與SDS及巰基乙醇混合后加熱，使蛋白充分變性。取變性蛋白20 μg，SDS-PAGE分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別滴加HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h。ECL發光，避光保存并轉移至凝膠成像分析系統，在化學光敏模式下曝光、顯影。采用ChemiDoc XRS + 凝膠成像系統分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6.計學方法 采用GraphPad Prism 7.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Student'st檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.果

2.1.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α基因沉默或過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表達變化 見表1～4。

表1.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達量變化（±s）

表1.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達量變化（±s）

注：與siRNA-NC組比較，*P＜0.05。

組別siRNA-HIF-1α組siRNA-NC組HIF-1α 0.48 ± 0.02*8.50 ± 0.19 E-cadherin 4.56 ± 0.15*0.24 ± 0.02 N-cadherin 0.65 ± 0.03*9.27 ± 0.42 β-catenin 0.24 ± 0.01*2.39 ± 0.10 TGF-β1 0.28 ± 0.01*10.18 ± 0.32

表2.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達量變化（±s）

表2.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達量變化（±s）

注：與siRNA-NC組比較，*P＜0.05。

組別siRNA-HIF-1α組siRNA-NC組TGF-β1 0.25 ± 0.02*0.72 ± 0.01 HIF-1α 0.41 ± 0.01*0.91 ± 0.01 E-cadherin 0.52 ± 0.01*0.41 ± 0.01 N-cadherin 0.49 ± 0.04*1.58 ± 0.02 β-catenin 0.23 ± 0.01*0.39 ± 0.01

表3.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達量變化（±s）

表3.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達量變化（±s）

注：與Control組比較，*P＜0.05。

組別HIF-1αE-cadherin N-cadherin β-catenin TGF-β1 HIF-1α過表達組Control組12.22 ± 0.29*1.00 ± 0.01 0.40 ± 0.01*1.00 ± 0.02 14.73 ± 0.36*1.00 ± 0.01 6.52 ± 0.27*1.00 ± 0.03 6.64 ± 0.18*1.00 ± 0.02

表4.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白相對表達量變化（±s）

表4.氧環境下子宮內膜癌細胞HIF-1α過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1蛋白相對表達量變化（±s）

注：與Control組比較，*P＜0.05。

組別HIF-1α過表達組Control組1.38 ± 0.03*0.86 ± 0.03 0.31 ± 0.01*0.36 ± 0.01 2.31 ± 0.03*1.81 ± 0.04 0.51 ± 0.01*0.41 ± 0.02 1.35 ± 0.03*0.82 ± 0.04 HIF-1αE-cadherinN-cadherinβ-cateninTGF-β1

2.2.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默或過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表達變化 見表5～8。

表5.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達量變化（±s）

表5.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達量變化（±s）

注：與Estrogen組比較，*P＜0.05；與Estrogen + siRNA-NC組比較，#P＜0.05。

組別Estrogen組Estrogen + siRNA-NC組Estrogen + siRNA-HIF-1α組HIF-1α 11.37 ± 0.45 24.32 ± 0.56*0.37 ± 0.02*#E-cadherin 0.52 ± 0.03 0.37 ± 0.02*8.28 ± 0.20*#N-cadherin 7.45 ± 0.38 10.74 ± 0.42*0.55 ± 0.04*#β-catenin 7.90 ± 0.15 8.18 ± 0.38*0.17 ± 0.01*#TGF-β1 13.85 ± 0.45 11.21 ± 0.58*0.28 ± 0.02*#

表6.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達量變化（±s）

表6.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α基因沉默后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達量變化（±s）

注：與Estrogen組比較，*P＜0.05；與Estrogen + siRNA-NC組比較，#P＜0.05。

組別Estrogen組Estrogen + siRNA-NC組Estrogen + siRNA-HIF-1α組HIF-1α 1.13 ± 0.06 1.19 ± 0.04*0.87 ± 0.04*#E-cadherin 0.27 ± 0.01 0.53 ± 0.02*0.63 ± 0.01*#N-cadherin 1.26 ± 0.06 1.47 ± 0.03*1.06 ± 0.05*#β-catenin 0.39 ± 0.01 0.48 ± 0.01*0.33 ± 0.01*#TGF-β1 0.98 ± 0.03 0.82 ± 0.03*0.43 ± 0.02*#

表7.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達量變化（±s）

表7.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1 mRNA相對表達量變化（±s）

注：與Estrogen組比較，*P＜0.05；與Control組比較，#P＜0.05。

組別Estrogen組Control組Estrogen + HIF-1α過表達組HIF-1α 11.37 ± 0.45 1.00 ± 0.02*28.61 ± 0.71*#E-cadherin 0.52 ± 0.03 1.00 ± 0.01*0.12 ± 0.01*#N-cadherin 7.45 ± 0.38 1.00 ± 0.03*14.83 ± 0.38*#β-catenin 7.90 ± 0.15 1.00 ± 0.01*15.36 ± 0.41*#TGF-β1 13.85 ± 0.45 1.00 ± 0.01*18.43 ± 0.36*#

表8.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達量變化（±s）

表8.氧環境下子宮內膜癌細胞加入雌激素同時HIF-1α過表達后HIF-1α、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和TGF-β1蛋白相對表達量變化（±s）

注：與Estrogen組比較，*P＜0.05；與Control組比較，#P＜0.05。

組別Estrogen組Control組Estrogen + HIF-1α過表達組HIF-1α 1.13 ± 0.06 0.81 ± 0.03*1.38 ± 0.03*#E-cadherin 0.27 ± 0.01 0.45 ± 0.02*0.21 ± 0.01*#N-cadherin 1.26 ± 0.06 1.12 ± 0.02*1.85 ± 0.03*#β-catenin 0.39 ± 0.01 0.24 ± 0.01*0.51 ± 0.01*#TGF-β1 0.98 ± 0.03 0.71 ± 0.01*1.14 ± 0.08*#

3.論

子宮內膜癌是起源于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，好發于圍絕經期及絕經后婦女，近年來其發病率逐年升高并且發病人群呈年輕化趨勢。但目前子宮內膜癌的病因和發病機制尚不完全清楚。

缺氧是腫瘤微環境的一個顯著特征，在不同類型惡性腫瘤中均能檢測到HIF-1α表達顯著升高。在缺氧環境下，HIF-1α過表達能夠引起腫瘤細胞發生EMT，進而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移［8-9］。在雌激素依賴型子宮內膜癌中，雌激素與其受體結合，從而發揮一系列生物學作用，如促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡以及促進腫瘤血管生成等。有研究報道，雌激素誘導的EMT可能在子宮內膜癌細胞的侵襲和遷移中發揮重要作用［10］。但缺氧環境下雌激素在子宮內膜癌細胞EMT中的作用尚不明確。本研究結果顯示，siRNA-HIF-1α組HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量均低于siRNA-NC組；HIF-1α過表達組HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量均高于Control組。結果表明，HIF-1α能夠參與子宮內膜癌細胞對缺氧的適應性調節。而HIF-1α過表達可激活惡性腫瘤的許多重要特征，如腫瘤血管生成以及腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等，在惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。

EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，是觸發腫瘤細胞侵襲和遷移的關鍵事件［7］。E-cadherin表達下調或缺失、N-cadherin表達上調是EMT的典型特征。EMT可導致上皮性腫瘤細胞侵襲和遷移能力增強［11-12］。缺氧和雌激素均能通過多種信號通路激活EMT，如TGF-β1、Wnt/β-catenin信號通路。因此，TGF-β1、β-catenin等信號通路中的關鍵因子異常表達亦可導致惡性腫瘤的發生、發展［13］。本研究結果顯示，siRNA-HIF-1α組N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相對表達量均低于siRNA-NC組，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達量均高于siRNA-NC組；HIF-1α過表達組N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相對表達量均高于Control組，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達量均低于Control組。結果提示，在缺氧環境下HIF-1α能夠負向調節E-cadherin表達，正向調節N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表達。

本研究結果還顯示，Estrogen + siRNA-HIF-1α組HIF-1αmRNA和蛋白相對表達量均低于Estrogen +siRNA-NC組和Estrogen組；Estrogen + HIF-1α過表達組HIF-1α mRNA和蛋白相對表達量均高于Estrogen +siRNA-NC組和Estrogen組，表明雌激素能夠參與缺氧過程并上調HIF-1α表達。進一步研究發現，Estrogen + siRNA-HIF-1α組N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相對表達量均低于Estrogen +siRNA-NC組和Estrogen組，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達量均高于Estrogen + siRNA-NC組和Estrogen組；Estrogen + HIF-1α過表達組N-cadherin、β-catenin、TGF-β1mRNA和蛋白相對表達量均高于Estrogen組和Control組，E-cadherin mRNA和蛋白相對表達量均低于Estrogen組和Control組。結果提示，在缺氧環境下雌激素下調E-cadherin表達以及上調N-cadherin、β-catenin、TGF-β1表達可能是通過HIF-1α來實現的。

綜上所述，缺氧環境下雌激素可能通過激活HIF-1α來促進子宮內膜癌細胞EMT。但在缺氧環境下雌激素參與子宮內膜癌細胞EMT的具體機制尚需進一步研究。