lncRNA NKILA對鼻咽癌細胞放射抵抗和上皮間質轉化的影響及其機制

張永濤，唐雪娣，徐楓鈔

自貢市第一人民醫院放射科，四川自貢643000

鼻咽癌是我國高發的頭頸部惡性腫瘤之一，近年來其發病率不斷上升，已成為嚴重危害居民身心健康和生活質量的重大疾病之一。目前，放療仍然是鼻咽癌最重要的治療手段，但部分患者存在原發性或繼發性放療不敏感，同時放療還可介導細胞上皮間質轉化（EMT），使得放療效果不佳［1］。研究發現，放療可誘導下咽癌細胞產生放射抵抗，并且放射抵抗細胞易發生EMT，導致其侵襲和遷移能力增強［2］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，可通過調控基因的表達參與惡性腫瘤的生物學行為［3-4］。NKILA為lncRNA家族成員之一。有研究發現，lncRNA NKILA可通過調控NF-κB表達促進喉癌細胞的增殖和侵襲；lncRNA NKILA還可通過下調miR-889-3p表達抑制肝癌的發生、發展。這些研究表明，lncRNA NKILA能夠通過調控miRNA表達對腫瘤產生一定影響。微小RNA-21（miR-21）是人類常見的原癌基因，與多種腫瘤的關系密切。miR-21在肺癌、胰腺癌、大腸癌等細胞中高表達，其高表達可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲并抑制其凋亡［5-7］。生物信息學分析顯示，miR-21與lncRNA NKILA可能存在靶向調控關系，為lncRNA NKILA潛在的靶基因。但二者在鼻咽癌中的靶向調控關系尚不清楚。2022年2月—12月，本研究探討了lncRNA NKILA對鼻咽癌細胞放射抵抗和EMT的影響及其機制。現報告如下。

1.料與方法

1.1.料 人鼻咽癌細胞CNE2，購自北京伊塔生物科技有限公司。SPF級SD裸鼠10只，雌雄各半，鼠齡5～6周，體質量18～22 g，購自上海科順生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK（滬）20190241。ProFlexTMPCR儀，購自上海土森視覺科技有限公司。lncRNA NKILA、miR-21引物序列由廣州威佳科技有限公司設計合成；NKILA-mimic、NKILA-NC質粒，購自上海數譜生物科技有限公司。MTT，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。E-cadherin、N-cadherin一抗，購自北京義翹神州科技股份有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，購自南京全隆生物技術有限公司。本研究經自貢市第一人民醫院醫學倫理委員會批準（倫理批號：Y2021-05-102）。

1.2.射抵抗細胞模型構建 將CNE2細胞接種于含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱常規培養。待細胞生長至80%～90%融合時，胰蛋白酶消化并計數，按1∶3傳代。取傳4代、對數生長期、生長狀態良好的CNE2細胞，接種于培養皿，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱常規培養。培養12 h，收集細胞，經胰蛋白酶消化后調整細胞密度至1 × 103/mL，分別予2、4、6、8、10 Gy X射線照射，每劑量照射2次，總劑量60 Gy。每次照射后，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱常規培養，待細胞生長至50%以上融合時，胰蛋白酶消化并傳代。穩定傳代2次后，進行下一次X射線照射。總劑量達到60 Gy后，檢測放射線抵抗能力，篩選放射抵抗的CNE2細胞（其SF2值為CNE2細胞的2倍）。1.3 分組轉染 收集上述細胞，接種于6孔板，隨機分為空白組、NC組、轉染組，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱常規培養。待細胞生長至75%融合時，參照文獻［8］按LipofectamineTM2000說明，轉染組和NC組分別轉染NKILA-mimic、NKILA-NC質粒。空白組不予轉染。轉染12 h，更換為無血清的培養基，繼續培養48 h。

1.4.ncRNA NKILA、miR-21表達檢測 采用RT-qPCR法。取上述各組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，然后將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：lncRNA NKILA上游引物5'-GGTAGGGCGATTGGCGAGAC-3'、下游引物5'-TTGCGAGGGCTGAAAATGGGGA-3'，miR-21上游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'、下游引物5'-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3'；U6上游引物5'-TTGAGGGATGCCCGATTGAG-3'、下游引物5'-TTGGAGGGCTGGAGGCGGGA-3'。按PCR擴增試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s共30個循環，最后72 ℃ 8 min。以U6為內參，采用2-ΔΔCT法計算lncRNA NKILA、miR-21相對表達量。

1.5.胞增殖能力檢測 采用MTT法。取上述各組細胞，接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱常規培養。分別于培養1、2、3、4、5天，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續培養4 h，然后加入DMSO 150 μL，輕輕振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值。以OD570值代表細胞增殖能力。

1.6.胞侵襲和遷移能力檢測 采用Transwell小室實驗。①細胞侵襲能力：用Matrigel基質膠包被Transwell小室上室，靜置1 h；取上述各組細胞制備細胞懸液，Transwell小室上室加入細胞懸液，下室加入完全培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養；培養2天，甲醇固定20 min，結晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照并計數侵襲細胞數目。②細胞遷移能力：取上述各組細胞饑餓處理12 h，以無血清的培養基將細胞密度調整至5 × 105/mL，Transwell小室上室加入細胞懸液，下室加入完全培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養；培養16 h，甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數遷移細胞數目。

1.7.-cadherin、N-cadherin表達檢測 采用Western blotting法。取上述各組細胞，提取細胞總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。加入5 ×上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白，SDS-PAGE分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入E-cadherin、N-cadherin一抗，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育45 min。ECL發光，暗室內顯影、曝光，凝膠成像儀拍照，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8.向調控關系驗證 通過TargetScan預測lncRNA NKILA與miR-21的靶向調控關系。取上述各組細胞，接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。待細胞生長至80%以上融合時，按LipofectamineTM2000說明將miR-21-3'-UTR-WT、miR-21-3'-UTR-MUT質粒分別與NKILA-mimic質粒或NKILA-NC質粒共轉染CNE2細胞。轉染2天，收集細胞，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.9.鼠移植瘤體積測量 取SD裸鼠10只，隨機分為觀察組和對照組各5只。觀察組與對照組分別于右前肢腋下注射轉染lncRNA NKILA的放射抵抗CNE2細胞、單純放射抵抗CNE2細胞各1 × 106個。常規飼養4周，處死裸鼠，分離移植瘤組織，測量瘤體短徑（W）和長徑（L），按公式計算腫瘤體積（V）。V=L × W2/2。

1.10.計學方法 采用SPSS21.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.果

2.1.組lncRNA NKILA、miR-21表達比較 見表1。

表1.組lncRNA NKILA、miR-21相對表達量比較（±s）

表1.組lncRNA NKILA、miR-21相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組NC組轉染組F P lncRNA NKILA 1.00 ± 0.00 1.02 ± 0.03 1.62 ± 0.17*#74.980＜0.01 miR-21 1.00 ± 0.00 0.95 ± 0.04 0.49 ± 0.02*#711.300＜0.01

2.2.組細胞增殖能力比較 見表2。

表2.組不同時間細胞增殖能力比較（±s）

表2.組不同時間細胞增殖能力比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組NC組轉染組F P細胞增殖能力培養1天0.32 ± 0.03 0.31 ± 0.04 0.29 ± 0.02 1.448＞0.05培養2天0.52 ± 0.06 0.51 ± 0.05 0.38 ± 0.03*#15.690＜0.01培養3天0.74 ± 0.04 0.73 ± 0.06 0.51 ± 0.04*#44.740＜0.01培養4天1.25 ± 0.11 1.23 ± 0.14 0.64 ± 0.05*#63.210＜0.01培養5天1.70 ± 0.14 1.68 ± 0.17 1.02 ± 0.13*#41.210＜0.01

2.3 三組細胞侵襲和遷移能力比較 見表3。

表3.組細胞侵襲和遷移能力比較（個，±s）

表3.組細胞侵襲和遷移能力比較（個，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組NC組轉染組F P細胞侵襲數118.22 ± 8.31 115.27 ± 10.24 54.23 ± 4.52*#120.900＜0.01細胞遷移數246.21 ± 20.32 241.35 ± 23.41 72.48 ± 6.25*#76.200＜0.01

2.4.組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達比較 見表4。

表4.組E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量比較（±s）

表4.組E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組NC組轉染組F P E-cadherin 1.05 ± 0.08 1.07 ± 0.05 3.45 ± 0.37*#235.100＜0.01 N-cadherin 1.02 ± 0.07 1.04 ± 0.05 0.24 ± 0.03*#451.400＜0.01

2.5.ncRNA NKILA與miR-21的靶向調控關系TargetScan預測結果顯示，lncRNA NKILA與miR-21存在靶向結合位點，見圖1。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，共轉染NKILA-mimic質粒與miR-21-3'-UTR-WT、共轉染NKILA-NC質粒與miR-21-3'-UTR-WT的CNE2細胞熒光素酶活性分別為0.84 ± 0.07、1.08 ± 0.07，共轉染NKILA-mimic質粒與miR-21-3'-UTR-MUT、共轉染NKILA-NC質粒與miR-21-3'-UTR-MUT的CNE2細胞熒光素酶活性分別為1.11 ± 0.12、1.14 ± 0.09。共轉染NKILA-mimic質粒與miR-21-3'-UTR-WT的CNE2細胞熒光素酶活性低于共轉染NKILA-NC質粒與miR-21-3'-UTR-WT的CNE2細胞（t=5.938，P＜0.05），而共轉染NKILA-mimic質粒與miR-21-3'-UTR-MUT、共轉染NKILA-NC質粒與miR-21-3'-UTR-MUT的CNE2細胞熒光素酶活性比較差異無統計學意義（t=0.745，P＞0.05）。

圖1.ncRNA NKILA與miR-21的靶向結合位點示意圖

2.6.組移植瘤體積比較 觀察組與對照組移植瘤體積分別為（0.70 ± 0.05）、（2.41 ± 0.08）cm3。觀察組移植瘤體積低于對照組（t=40.530，P＜0.05）。

3.論

目前，放療仍然是鼻咽癌最重要的治療手段，但部分患者存在原發性或繼發性放療不敏感，使得放療效果不佳，預后較差。但鼻咽癌細胞放射抵抗的具體機制尚不清楚。

lncRNA、miRNA均屬于非編碼RNA，作為重要的調控分子參與生命活動過程。普遍認為，miRNA、lncRNA與腫瘤細胞放射抵抗有關，可能是改善放療敏感性的潛在靶標。lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。越來越多證據表明，lncRNA在細胞增殖、分化、凋亡等生命活動中發揮重要作用。lncRNA NKILA是lncRNA家族成員之一。有研究證實，lncRNA NKILA可通過靶向調控miR-1236-3p表達改善脂多糖誘導的支氣管上皮細胞損傷［9］，提示lncRNA NKILA能夠靶向調控miRNA。miRNA是一類內源性非編碼小分子RNA，也能參與細胞的增殖、分化、凋亡等生命活動。miR-21是人類常見的原癌基因，與多種腫瘤關系密切。有研究報道，miR-21不僅能促進食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移，還能參與調控食管癌細胞的放療敏感性［10］。羅軼等［11］研究報道，沉默miR-21可降低鼻咽癌細胞活性并抑制其放射抵抗。生物信息學分析顯示，miR-21與lncRNA NKILA可能存在靶向調控關系，為lncRNA NKILA潛在的靶基因。但二者在鼻咽癌中的靶向調控關系尚不清楚。

為了探究lncRNA NKILA對鼻咽癌細胞放射抵抗的影響及其機制，本研究構建了鼻咽癌放射抵抗細胞模型并轉染NKILA-mimic質粒，結果顯示，轉染NKILA-mimic質粒后放射抵抗的CNE2細胞增殖能力顯著降低。進一步研究發現，在放射抵抗的CNE2細胞中，轉染NKILA-mimic質粒后miR-21表達降低，而轉染NKILA-NC質粒后miR-21表達變化不明顯，提示miR-21可能是lncRNA NKILA的靶基因，lncRNA NKILA可能通過靶向抑制miR-21表達而抑制鼻咽癌細胞的放射抵抗。此外，本研究觀察組移植瘤體積顯著低于對照組，進一步證實了上述結論。

放療敏感性與EMT密切相關，抑制腫瘤細胞EMT可能是增強放療敏感性的一種策略。在EMT過程中，細胞發生形態改變，呈梭形轉變，細胞極性喪失、黏附性降低，并獲得間質細胞的表型特征，從而使腫瘤細胞獲得更強的侵襲和遷移能力。作為EMT的標志性蛋白，E-cadherin低表達是EMT最顯著的特征，也是多種腫瘤發生轉移和預后不良的重要標志物；N-cadherin表達增加，可促進腫瘤細胞脫離原位并粘附基質成分，細胞運動能力增強，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。有研究證實，鼻咽癌細胞發生EMT時N-cadherin表達上調、E-cadherin表達下調，腫瘤細胞的侵襲和遷移能力顯著增強［12］。有研究報道，miR-21可上調腫瘤細胞中E-cadherin表達，抑制EMT發生，從而降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力［13］。本研究結果發現，轉染組E-cadherin表達顯著高于空白組和NC組，N-cadherin表達及細胞侵襲和遷移能力顯著低于空白組和NC組，提示lncRNA NKILA能夠阻滯鼻咽癌細胞發生EMT，進而抑制其侵襲和遷移。李歡慶等［14］研究發現，轉染miR-21能夠上調E-cadherin表達、下調Vimentin表達，阻滯鼻咽癌細胞發生EMT，抑制其侵襲和遷移。張印松等［15］研究報道，lncRNA NKILA通過靶向抑制NF-κB表達，抑制喉癌細胞的侵襲能力。LIU等［16］研究發現，lncRNA NKILA可通過調控IL-11/STAT3信號通路，抑制肺癌細胞的增殖和遷移。本研究經TargetScan預測和雙熒光素酶報告基因實驗證實，lncRNA NKILA能夠靶向抑制miR-21表達，抑制鼻咽癌細胞發生EMT，從而抑制其侵襲和遷移。

綜上所述，lncRNA NKILA可能通過靶向抑制miR-21表達而抑制鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和遷移，繼而抑制鼻咽癌細胞的放射抵抗和EMT。