淫羊藿素對人舌鱗癌細胞CAL-27增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響

曹華嬌, 傅玲玲, 馮紅超,

(1. 貴州醫科大學 口腔醫學院, 貴州 貴陽, 550001;2. 貴州省貴陽市口腔醫院 口腔頜面外科, 貴州 貴陽, 550002)

舌鱗狀細胞癌(TSCC)簡稱舌鱗癌,是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一,其發生率占口腔鱗癌的50%～60%[1]。舌體淋巴引流豐富且舌運動頻繁,舌鱗癌頸淋巴結轉移率較高,患者的5年存活率較低[2-4]。舌鱗癌的主要治療方法是多模式治療,目前中草藥治療的相關研究仍在持續進行中。淫羊藿抗腫瘤作用較為廣泛[5-6], 研究[7-9]表明,其主要成分淫羊藿素、脫水淫羊藿素也具有抗舌鱗癌作用。作者查閱文獻過程中發現,淫羊藿素與脫水淫羊藿素的分子式及分子名稱存在一定爭議,有研究[10-11]認為淫羊藿素對應分子式為C21H22O7, 水解脫去一分子H2O后變為脫水淫羊藿素,對應分子式為C21H20O6; 也有研究[12]認為,淫羊藿素分子式為C21H20O6; 還有研究[13]認為,脫水淫羊藿素分子式為C21H20O6。本研究基于查閱文獻及分子對接結果選取分子式為C21H22O7的淫羊藿素進行實驗,擬通過分子對接揭示淫羊藿素抗舌鱗癌的藥效及可能的作用機制,以期為治療人舌鱗癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

人口腔鱗癌細胞系CAL-27來自貴州醫科大學頭頸鱗癌生物學實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

淫羊藿素(C21H22O7, CAS: 521-45-9; CAT. NO. II0330, 北京索萊寶科技有限公司); 胎牛血清、雙抗(青霉素10 000 U/mL, 鏈霉素10 mg/mL, 以色列BI); 基質膠(貨號0827045, 上海諾娃醫藥科技有限公司); Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(CAT. No: KGA107, Lot. No. 20220407, 南京凱基生物科技有限公司); Navios流式細胞儀購(美國Beckman); 超微量分光光度計(型號NanoDrop 2000, 美國Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養: 將人口腔鱗癌細胞系CAL-27培養于高糖DMEM培養基中,在培養基中添加10%胎牛血清, 100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素,放入37 ℃恒溫和CO2濃度為5%的細胞培養箱內培養。每2～3 d換1次液,每5 d傳1次代,細胞生長匯合度為80%～90%時,用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕漂洗2次, 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化5 min, 鏡下觀察細胞變圓后,用含10%胎牛血清的完全培養基終止消化,將細胞輕輕吹打成單細胞懸液,轉移至15 mL離心管中,以1 000轉/min離心5 min, 去掉上清液后重懸計數,根據后續實驗調整成需要的細胞密度。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力: 將對數生長期人舌鱗癌細胞CAL-27以每孔3 000個細胞的密度接種于96孔板中,設置實驗組、對照組和空白組,每組5個復孔。待24 h后細胞貼壁、細胞狀態良好,加入淫羊藿素,淫羊藿素的終濃度分別為 0(對照組)、10、20、40 μmol/L(實驗組),繼續培養24、48 h后,每孔加入10 μL CCK8溶液,酶標儀測試450 nm波長處的吸光度值,并計算細胞的抑制率,抑制率(%)=(對照孔吸光度-實驗孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.3.3 光鏡下細胞形態學觀察: 取對數生長期的CAL-27單細胞懸液,以每孔50 000個細胞的密度接種至6孔板中,加入培養液, 24 h后加入淫羊藿素,終濃度分別為0、10、20、40 μmol/L, 繼續培養48 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.4 平板克隆形成實驗: 取對數生長期的CAL-27單細胞懸液,以每孔500個細胞的密度接種至65 mm培養皿中,加入完全培養基至3 mL, “十”字輕輕晃動使細胞分散均勻。將培養皿放入37 ℃、5% CO2培養箱中培養1周,每3 d更換1次培養基,至單個細胞集落細胞數量≥50個時終止培養。PBS輕柔清洗2次后,使用4%多聚甲醛固定15 min, 0.4%結晶紫染色15 min, 雙蒸水清洗2次后干燥,拍照,計數。

1.3.5 劃痕實驗: 將生長狀態良好的CAL-27細胞以每孔3×106個細胞的密度接種至6孔板中,每組設3個復孔,待細胞匯合度達100%, 用100 μL移液槍槍頭垂直底部橫線劃直線,形成一段寬度約3 mm的無細胞空白區域, PBS洗去劃落的細胞,分別加入淫羊藿素終濃度為0、10、20、40 μmol/L的不含血清的DMEM培養基。選取劃痕區域均勻一致的位置做好標記并拍照,繼續培養12、24、36 h后選取同一區段進行觀察及拍照,最后用Image J軟件分析藥物作用后劃痕愈合情況。

1.3.6 Transwell遷移及侵襲實驗: 8～11 mg/mL基質膠解凍分裝后用冷的不含胎牛血清完全培養基以1∶8比例稀釋。侵襲實驗需提前取100 μL稀釋好的基質膠置于24孔板Transwell上室內,置于培養箱中孵育2 h。將密度為每孔1×104個細胞的CAL-27接種于上室,在下室內放入含10%胎牛血清的完全培養基600 μL, 培養24 h后加入淫羊藿素,繼續48 h后取出培養板,用棉簽輕輕擦去小室內的基質膠, PBS漂洗3次后,將小室依次置于多聚甲醛及結晶紫中15 min, PBS漂洗3次,干燥后于顯微鏡下隨機選取3個視野進行拍照及計數。

1.3.7 流式細胞術檢測CAL-27細胞凋亡情況: 取對數生長期的CAL-27單細胞懸液,以每孔3×105個細胞的密度接種至6孔板中,藥物干預48 h, 消化完成后,將上清液、PBS漂洗液和細胞懸液收集至同一個離心管中,以1 000轉/min離心5 min,計數,取5×105個細胞, PBS洗滌2遍,棄上清液,加入500 μL結合緩沖液混勻,再依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI混合,避光孵育15 min后,采用流式細胞儀上樣檢測,用FlowJo 10.6.2軟件分析計算CAL-27細胞凋亡率。

1.3.8 分子對接預測藥物作用效果: 根據課題組淫羊藿抗舌鱗癌的網絡藥理學分析,淫羊藿抗舌鱗癌可能主要與AR、ESR1、PRKACA、PTGS2共4個靶基因相關。因此,本實驗在RSCB PDB數據庫查詢并下載AR、ESR1、PRKACA、PTGS2的3D結構; TCMSP數據庫中下載淫羊藿素分子結構MOL文件; 在Discovery Studio (2019) 軟件中對淫羊藿素與4個靶基因大分子進行化學結合能的計算及半柔性對接。

1.3.9 逆轉錄-實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測: 以GAPDH作為內參,相對表達量采用2-△△Ct法計算。提取細胞樣本總RNA, 逆轉錄cDNA, 利用qPCR法檢測各組細胞中ESR1、PTGS2、PRKACA、AR基因表達情況。為了減少誤差,所有檢測樣本均做3個平行復孔,檢測完成后,取3個平行復孔的平均值作為該樣本的最終檢測數值。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 檢測所用引物序列

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 CCK-8檢測不同濃度淫羊藿素對CAL-27細胞增殖的抑制作用

處理24、48 h的細胞存活率均隨淫羊藿素劑量增加而降低(P< 0.001), 見圖1A; 在同一時點,與0 μmol/L 淫羊藿素相比, 10、20、40 μmol/L淫羊藿素細胞存活率降低,差異有統計學意義(P<0.001); 同一濃度下,與處理24 h比較, 48 h的細胞存活率降低,差異有統計學意義(P<0.001)。淫羊藿素對CAL-27細胞作用24 h的半數抑制濃度(IC50)為33.37 μmol/L, 48 h IC50為15.57 μmol/L, 見圖1B。

A: CAL-27細胞存活率隨淫羊藿素濃度變化柱形圖; B: CAL-27抑制率隨淫羊藿素濃度變化折線圖。與0 μmol/L濃度比較, ***P<0.001; 兩者比較, ###P<0.001。圖1 淫羊藿素作用于CAL-27 24、48 h后的變化

2.2 光鏡下細胞形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察細胞形態發現,不同濃度淫羊藿素干預48 h后, CAL-27細胞生長受到抑制,且對形態學影響較為明顯,見圖2。

A: 放大倍數為100倍,比例尺為100 μm; B: 放大倍數為200倍,比例尺為50 μm。圖2 CAL-27細胞經淫羊藿素干預48 h后形態學變化

0 μmol/L濃度的細胞貼壁伸展,稍呈梭形,偽足較長; 經淫羊藿素影響后,細胞逐漸皺縮,偽足變短,形態不規則,隨著藥物濃度的升高,形態變化越來越明顯,在40 μmol/L濃度時最為明顯,細胞稍呈圓形。

2.3 克隆形成實驗檢測細胞增殖情況

不同濃度淫羊藿素處理CAL-27后,細胞增殖受到顯著抑制,形成的單克隆集落大小呈逐漸變小趨勢,見圖3A。與0 μmol/L組比較,淫羊藿素濃度為20 μmol/L時細胞集落減少,當淫羊藿素濃度為40 μmol/L時幾乎不存在細胞集落,見圖3B。克隆形成實驗顯示, 10 μmol/L濃度的克隆形成率為(79.20±5.74)%, 低于0 μmol/L組的(101.00±2.26)%, 差異有統計學意義(P<0.05); 與0 μmol/L組克隆形成率比較, 20 μmol/L濃度的克隆形成率(64.73±5.98)%和40 μmol/L濃度的克隆形成率(27.33±7.69)%均降低,差異有統計學意義(P<0.001), 見圖3C。

A: 淫羊藿素處理48 h后, CAL-27單克隆集落形態觀察,比例尺為100 μm; B: 淫羊藿素處理48 h后, CAL-27的克隆形成。C: 淫羊藿素處理48 h后,各組克隆形成率。兩者比較, *P<0.05, ***P<0.001。圖3 CAL-27的克隆形成實驗

2.4 劃痕實驗

CAL-27經過不同濃度的淫羊藿素分別作用12、24、36 h后,細胞水平向內遷移,見圖4A。隨著時間的推移,遷移愈合面積越來越大, 36 h時0 μmol/L濃度和10 μmol/L濃度的劃痕恢復接近100%, 而20 μmol/L濃度和40 μmol/L濃度劃痕未能完全愈合。在0、12、24、36 h時,與0 μmol/L濃度比較, 10、20、40 μmol/L濃度的劃痕區域遷移率呈下降趨勢,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖4B。

A: 淫羊藿素干預CAL-27細胞12、24、36 h后劃痕鏡下表現,比例尺為100 μm; B: 淫羊藿素干預CAL-27細胞12、24、36 h后細胞遷移率柱形圖。12 h時,與0 μmol/L濃度比較, *P<0.05, **P<0.01; 24 h時,與0 μmol/L濃度比較, #P<0.05, ##P<0.01; 36 h時,與0 μmol/L濃度比較, △P<0.05, △△P<0.01。圖4 淫羊藿素干預CAL-27細胞的劃痕實驗

2.5 Transwell遷移及侵襲實驗

CAL-27細胞經過不同濃度的淫羊藿素作用48 h后,隨著藥物濃度的增加,遷移和侵襲穿過小室的細胞逐漸減少,見圖5A、5B。CAL-27遷移穿過小室的細胞數目呈淫羊藿素劑量依賴性減少(P<0.001); CAL-27侵襲穿過小室的細胞數目呈淫羊藿素劑量依賴性減少(P<0.05或P<0.001), 見圖5C、5D。

A: CAL-27細胞各組遷移圖,比例尺為100 μm; B: CAL-27細胞各組侵襲圖,比例尺為100 μm; C: 各濃度淫羊藿素干預細胞遷移數目統計分析; D: 各濃度淫羊藿素干預細胞侵襲數目統計分析。兩者比較, *P<0.05, ***P<0.001。圖5 淫羊藿素干預CAL-27細胞48 h后的遷移和侵襲結果

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

淫羊藿素干預人舌鱗癌細胞CAL-27 48 h后,隨著藥物濃度的增加,凋亡細胞比例增加,見圖6A。0 μmol/L濃度細胞凋亡率為(4.96±1.92)%, 10 μmol/L濃度細胞凋亡率為(10.15±2.16)%, 20 μmol/L濃度細胞凋亡率為(28.96±4.65)%, 40 μmol/L濃度細胞凋亡率為(45.20±6.80)%。CAL-27細胞凋亡率呈淫羊藿素劑量依賴性增加,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.001)。

A: 流式凋亡圖; B: 細胞凋亡率柱形圖。兩者比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。 流式圖中4個象限: 左下象限代表正常細胞群; 左上象限代表機械損傷細胞群; 右上象限代表晚期凋亡細胞; 右下象限代表早期凋亡細胞; 細胞凋亡率為右上和右下細胞占比之和。圖6 淫羊藿素干預CAL-27細胞48 h后的凋亡結果

2.7 淫羊藿素與AR、ESR1、PRKACA、PTGS2進行分子對接

淫羊藿素與AR(1XOW)、ESR1(7BAA)、PRKACA(5N1F)、PTGS2(5F19)進行分子對接的結合能依次為: -69.457 9、0、-48.798 2、0 kcal/mol。結合能數值越低,氫鍵結合數目越多,則舌鱗癌受體與淫羊藿素之間的結合活性越高,結合構象越穩定,潛在效果就越好。其中,AR、ESR1、PRKACA與淫羊藿素對接有2個氫鍵,而PTGS2與淫羊藿素的對接沒有氫鍵的結合,見圖7。

綠色節點及虛線表示經典氫鍵結合。圖7 淫羊藿素與人舌鱗癌靶點分子對接二級結構圖

2.8 RT-qPCR實驗

分別采用0、10、20、40 μmol/L 濃度的淫羊藿素處理CAL-27 48 h后,檢測AR、ESR1、PRKACA、PTGS2的表達情況。與0 μmol/L濃度比較,AR、ESR1、PRKACA、PTGS2的相對表達量呈淫羊藿素濃度依賴性降低; 但0 μmol/L濃度和10 μmol/L濃度的PTGS2的相對表達量比較,差異無統計學意義(P>0.05), 見圖8。

A: 干預48 h后PRKACA的相對表達量; B: 干預48 h后AR的相對表達量; C: 干預48 h后ESR1的相對表達量; D: 干預48 h后PTGS2的相對表達量。兩者比較, **P<0.01, ***P<0.001。圖8 淫羊藿素干預CAL-27細胞48 h后AR、ESR1、PRKACA、PTGS2的相對表達量

3 討 論

舌鱗癌預后較差,淋巴結陽性、腫瘤浸潤深度和淋巴結比率升高是影響存活率的重要預后因素[14]。目前,舌鱗癌治療方式以手術為主,輔助放化療、生物治療和康復治療等進行綜合序列治療[15]。研究[16-17]表明,天然化合物如淫羊藿素、白皮杉醇、姜黃素、醋酸棉酚等在舌鱗癌的治療中起著越來越重要的作用。淫羊藿素又名阿可拉定,有研究[18]表明,其可抑制多條腫瘤增殖信號通路,提高免疫系統對腫瘤的殺傷。目前已完成晚期肝癌治療的ⅡB期臨床試驗,與其他藥物的聯合應用對晚期或三陰性乳腺癌的臨床實驗一致,均顯示出明確的臨床療效和良好的安全性[19-21]。

本研究采用不同濃度的淫羊藿素干預人舌鱗癌細胞CAL-27, 通過CCK-8測試、克隆形成實驗、細胞形態學觀察、流式細胞術、Transwell遷移和侵襲實驗檢測淫羊藿素對舌鱗癌增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學性能的影響。本研究結果表明,隨著藥物濃度的增加, CAL-27生長受到的抑制越來越顯著,且呈時間和劑量依賴性。結合劃痕實驗及Transwell遷移、侵襲實驗發現,細胞向四周移動的能力逐漸降低,且流式細胞術檢測和RT-qPCR實驗表明隨著淫羊藿素濃度的增加,細胞凋亡率越來越高。

結合本課題組對淫羊藿抗舌鱗癌作用的網絡藥理學和分子對接分析中發現,AR、ESR1、PRKACA、PTGS2可能為淫羊藿素作用于舌鱗癌的4個最佳靶點。4個靶點抗腫瘤作用為:AR被認為在癌癥發生中有促進作用,可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,并被認為是一種潛在的頭頸鱗狀細胞癌預后標記物[22-24]; 研究[25]表明,AR陽性的口腔鱗癌患者可能具有低生存率、高復發率的風險。ESR1在轉錄上調節參與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和轉移。研究[26-28]表明,ESR1參與了乳腺癌、前列腺癌等癌癥的病理過程,在頭頸鱗癌中被報道為潛在的預后化學標志物。PRKACA被報道[29]與心血管疾病、腎上腺皮質腫瘤以及乳腺癌、纖維板層狀肝細胞癌等多種癌癥相關。研究[30]表明,DNAJB1-PRKACA基因融合能與β-連環蛋白相互作用,顯著促進腫瘤的發生; 研究[31]表明,PRKACA可以通過其下游底物的磷酸化來調節細胞活動,從而減少細胞內的自噬,并誘導細胞增殖。PTGS2在腫瘤發病過程中也起著至關重要的作用,其與結腸癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌等多種癌癥相關[32-35]。生物信息學分析[36]表明,PTGS2作為頭頸癌免疫調節網絡的關鍵節點之一,在不久的將來可能成為新的治療靶點。

為進一步探究淫羊藿對舌鱗癌的作用機制,本實驗通過qPCR實驗檢測AR、ESR1、PRKACA、PTGS2mRNA的相對表達量,發現隨著藥物濃度的增加,其相對表達量均呈現不同程度的降低,且下降程度以AR最為顯著,其次為PRKACA, 變化幅度最小的為PTGS2, 變化趨勢與分子對接結合能絕對值大小依次排序:AR(1XOW)>PRKACA(5N1F)>ESR1(7BAA)= PTGS2(5F19)。

綜上所述,淫羊藿素可促進人舌鱗癌細胞凋亡,并抑制舌鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,具體機制可能與淫羊藿素和人舌鱗癌細胞內AR、ESR1、PRKACA的特異性結合,進而影響目的基因的表達量有關,但其具體調控作用機制尚不明確,還需進一步探討。