骨髓分化因子88通過核因子-κB/活化蛋白-1信號通路調控結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

秦 蕾, 秦 鑫

(1. 北京老年醫院 普外科, 北京, 100095; 2. 山西醫科大學, 山西 太原, 030001)

結直腸癌(CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其中晚期結直腸癌患者的預后仍然不佳[1-2]。研究[3]顯示包括病毒和細菌感染、酒精、煙草煙霧、衰老、潰瘍性結腸炎、久坐的生活方式以及基因突變等因素均可能與結直腸癌有關。CRC的發病與3種類型的遺傳畸變有關,即染色體不穩定(CIN)、微衛星不穩定(MSI)和CpG島甲基化表型(CIMP)[4]。髓樣分化因子88(MyD88)是白細胞介素-1(IL-1)和Toll樣受體(TLR)信號傳導的必要適配分子[5]。TLRs是一個模式識別受體家族,可識別各種病原體相關分子模式(PAMPs), 并激活宿主對病原體入侵的先天免疫防御。MyD88信號通路在激活的CD4+T細胞存活過程中介導全身和心臟細胞因子反應,促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移,并與肝細胞癌(HCC)患者介導的炎癥通路損傷和神經退行性組織損傷的預后密切相關[6-9]。

研究[10-11]證明MyD88表達是卵巢癌的不良預后因素,且在腺病毒角膜炎中發揮作用。另有研究[12-13]表明,MyD88是炎癥性肺部疾病的治療靶點,且在眼表穩態維持中發揮重要作用。既往研究[14]顯示MyD88在結直腸癌患者癌組織及癌旁正常結直腸組織中表達,且癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織;MyD88表達水平與結直腸癌患者的臨床分期、T分期、M分期及淋巴結轉移密切相關,MyD88高表達的結直腸癌患者的生存率明顯低于MyD88低表達的患者。本研究探討MyD88在結直腸癌患者中的作用,通過敲除結直腸癌細胞中MyD88基因以了解其在細胞中的功能作用,并分析MyD88敲低導致相關信號通路改變的機制,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

SW460細胞(上海中科院細胞庫);MyD88-siRNA重組腺病毒載體及陰性對照質粒購自上海吉瑪生物有限公司; DMEM培養基(TOYOBO); Trizol試劑盒(TaKaRa); Hoechst 33258 染色試劑; Western印跡試劑盒(美國Sigma公司); 全蛋白抽提試劑盒; Lipofectamine3000轉染試劑(Invitrogen, 美國); 磷酸鹽緩沖液(PBS, 美國Amresco公司); BCA 蛋白定量試劑盒 (Thermo Fisher Scientific); CCK-8 (Dojindo); Matrigel(BD Bioscience),細胞裂解抽提試劑(碧云天), PMSF(Amresco)。

1.2 主要實驗器材

蘇凈 Airtech超凈工作臺(北京六一儀器廠); SANYO MCO-15AC細胞培養箱(美國強生公司); Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司); 5810R型高速離心機(日本島津公司); 微量移液槍(美國 Promega公司); 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, 美國Corning公司); E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Beckma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 慢病毒感染和穩定細胞系篩選: SW480細胞株培養于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中,置于生化培養箱中培養,條件為37 ℃、5%CO2濃度。在HEK293T細胞中將MyD88敲除質粒和空載體與psPAX2和pMD2.G共轉染,培養2 d后將上清液過濾。采用上清感染SW480細胞,嘌呤霉素篩選2周后提取蛋白和mRNA進行驗證。將轉染空載體和MyD88敲除質粒的SW480細胞分別作為對照組和MyD88-siRNA組。

1.3.2 細胞總RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測: 利用TRIZOL提取2組細胞中總RNA, 具體實驗步驟參照試劑盒說明書。采用Nanodrop測定的260 nm與280 nm下吸光度比值(OD260/280 nm比值)計算總RNA的純度,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取2 μL RNA按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄以構建cDNA文庫,以cDNA為模板進行實時定量反應,以GAPDH基因作為內參基因。PCR反應條件: 95 ℃下2 min預變性; 95 ℃下15 s, 60 ℃下30 s, 設置40個循環; 以2-△△CT方法計算基因的相對表達水平。

1.3.3 細胞總蛋白提取和蛋白質印跡法(Western blot): 將細胞采用含1%PMSF的細胞裂解緩沖液進行冰上裂解30 min, 隨后將裂解液在4 ℃、12 000 g離心10 min, 提取上清液,使用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量,并加入5×SDS煮沸10 min。將50 μg蛋白采用12% SDS-PAGE凝膠進行電泳分離,將凝膠轉移至0.45 μm PVDF膜中。采用1%的牛血清白蛋白對PVDF膜進行常溫封閉1 h, 隨后采用稀釋后的抗體在4 ℃搖床上過夜孵育。采用TBST(0.1% Tween-20)將PVDF膜洗滌3次,每次10 min; 采用山羊抗兔IgG H&L (HRP)二抗常溫孵育1 h, 隨后采用TBST(0.1% Tween-20)將PVDF膜洗滌3次。最后采用增強的化學發光底物檢測液對蛋白條帶進行檢測。

本研究所用抗體及稀釋濃度為: MyD88(1∶1 000, AF5195; Affinity)、GAPDH(1∶1 000, ab181602; Abcam)、NF-κB p65(1∶1 000, AF5006; Affinity)、p-NF-κB p65(1∶1 000,#3033; Cell Signaling)、c-jun(1∶1 000,bs-0670R; Bioss)、p-c-jun(1∶1 000, bs-3172R; Bioss)、goat anti-rabbit IgG H&L (HRP) (1∶2 000, ab7090; Abcam)。

1.3.4 細胞增殖檢測: 調整各組細胞濃度至1.0×104個/孔并接種于96孔板中,每組分別設置6個復孔,置于生化培養箱中培養,條件為37 ℃、5%CO2濃度。在培養24、48、72、96 h后,棄掉上層培養基,添加100 μL的10% CCK-8無血清培養基,孵育1 h后使用微生物板閱讀器(Bio-Tek)計算細胞增殖。

1.3.5 細胞遷移的愈合實驗: 將各組細胞接種于6孔板中,每組分別設置6個復孔,待細胞生長至100%時,用20 μL移液管尖劃傷細胞層,將含10%FBS的培養基替換為無血清培養基。拍攝細胞在培養0、48 h后的圖像,計算細胞的遷移能力。

1.3.6 細胞侵襲實驗: 在培養基上室涂上Matrigel, 調整各組細胞濃度至9.0×104個/孔接種于上室,下室為含20% FBS的DMEM培養基。在37 ℃、5% CO2條件下孵育48 h后,取出Transwell室,將培養基丟棄并用無鈣PBS清洗,而后用甲醇固定細胞30 min, 用0.1%結晶紫染色20 min, 再用棉簽輕輕拭去上面未遷移的細胞,并在顯微鏡下計數。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 siRNA干擾后MyD88蛋白及mRNA表達水平

在轉染siRNA 48 h后,檢測2組細胞內MyD88的蛋白及mRNA表達水平。RT-qPCR和Western blot檢測結果顯示,轉染MyD88-siRNA后, MyD88的mRNA和蛋白表達水平均降低,差異有統計學意義(P<0.000 1), 見圖1。

A: MyD88蛋白水平; B: MyD88 mRNA水平(2組比較, ****P<0.000 1)。圖1 MyD88敲除后2組細胞蛋白和mRNA表達水平比較

2.2 MyD88-siRNA干擾后抑制SW480細胞的增殖

CCK-8實驗結果顯示,與對照組相比,MyD88-siRNA組細胞增殖率、細胞存活率均降低,差異有統計學意義(P<0.05), 說明MyD88沉默能夠顯著抑制結直腸癌的細胞增殖。見圖2。

圖2 2組細胞的增殖率和存活率的比較

2.3 MyD88-siRNA干擾后抑制SW480細胞的遷移

劃痕實驗結果顯示,MyD88-siRNA組的劃痕愈合速度低于對照組,差異有統計學意義(P<0.000 1), 見圖3。

圖3 2組細胞劃痕試驗后細胞愈合情況比較

2.4 MyD88-siRNA干擾后抑制SW480細胞的侵襲

Transwell實驗結果顯示,MyD88-siRNA組結直腸細胞通過基底膜遷移的細胞數量低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 說明MyD88敲除可以顯著抑制SW480細胞的侵襲。見圖4。

圖4 2組細胞的侵襲能力比較(放大200倍)

2.5 MyD88對NF-κB和AP-1信號通路的影響

Western blot結果顯示, NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、AP-1(c-jun)和p-AP-1(p-c-Jun)蛋白在MyD88-siRNA組的表達水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 說明MyD88沉默可以抑制NF-κB和AP-1信號通路的蛋白表達水平。見圖5。

圖5 2組細胞中NF-κB和AP-1信號通路相關蛋白的Western blot結果

3 討 論

MyD88在先天免疫反應中發揮核心作用,其參與調節NF-κB信號通路活性[15]和MAPKs-c-jun(AP-1)信號通路[16]。MyD88和MyD88相關信號通路已被證明參與內源性和外源性炎癥反應,以及癌癥相關細胞的進展和癌變過程。此外,MyD88異常表達的檢測可用于預測各種人類癌癥(如淋巴癌、肝癌)的預后[17]。因此,MyD88可作為潛在的致癌標志物進行相關研究,對結直腸癌的治療有積極的影響。

本研究成功敲除了MyD88,并通過RT-qPCR和Western blot對敲除效率進行了驗證分析,并進一步驗證MyD88敲除是否會影響結直腸癌細胞的生物學特征,結果表明敲除MyD88可抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移,證實MyD88在結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移中發揮重要的作用。臨床研究[18]發現MyD88的SNP位點與結直腸癌患者的生存率較差密切相關。此外,MyD88沉默可以降低胰腺癌細胞的侵襲性和遷移能力[19]。MyD88的高表達與結直腸癌患者肝轉移及不良預后相關[20]。

然而,MyD88誘導結直腸癌生物學行為的具體機制尚不清楚。有研究[16]通過比較IL-18-/-、IL-18R1-/-和MyD88-/-結直腸癌相關小鼠模型以及野生小鼠發現,MyD88可以通過IL-18/MyD88通路保護腸道免受腫瘤發生的影響。相反的,在LPS處理后的MyD88敲除小鼠中,MyD88可通過TLR/MyD88通路促進結腸炎向結直腸癌的惡性轉化[21]。目前,MyD88在結直腸癌進展過程中的雙重功能尚不清楚,其內在機制需要進一步研究。

MyD88信號在調節腸道正常上皮細胞和癌細胞的生長中發揮作用。NF-κB的上調與很多腫瘤進展過程相關,參與腫瘤細胞的增殖和侵襲; AP-1, 特別是c-Jun同樣影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[22-23]。多項研究表明,絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子κB(NF-κB)信號通路是導致脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷(ALI)[24]、破骨細胞生成[25]、神經炎癥[26]、動脈粥樣硬化[27]、前列腺癌和膠質母細胞瘤的發生[28]以及人類樹突狀細胞激活[29]的關鍵因素。MyD88敲除可影響結直腸癌細胞的生物學特征,包括細胞的增殖、侵襲和遷移; 在MyD88敲除的細胞系中,p65、磷酸化p65、c-jun和磷酸化c-jun蛋白表達均有不同程度的下降。敲低MyD88基因可以影響MyD88介導的NF-κB (p65)和NF-κB的激活AP-1(MAPKs-c-jun)通路,從而有效延緩腫瘤的侵襲性轉化。

綜上所述,MyD88可作為結腸癌發病機制的獨立因子,并可作為潛在的診斷和預后生物標志物。敲除MyD88基因可以影響結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移,并降低NF-κB和AP-1通路的活性。