直腸癌患者治療前后循環(huán)腫瘤DNA、癌胚抗原、糖類抗原199水平變化及其相關(guān)性

蔡麗彬, 胡 蒙

(江蘇省人民醫(yī)院溧陽(yáng)分院/江蘇省溧陽(yáng)市人民醫(yī)院, 1. 放射治療科, 2. 腫瘤內(nèi)科, 江蘇 溧陽(yáng), 213300)

直腸癌(CRC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì),僅次于胃癌和食管癌[1-3]。CRC早期臨床癥狀不明顯, 20%以上的患者在首次發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。因此,早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防已經(jīng)成為CRC治療的關(guān)鍵[5-6]。目前, CRC患者首選治療方式是手術(shù),但多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期,術(shù)后存活率較低?？ㄅ嗨麨I具有較強(qiáng)靶向性[7], 給藥后能迅速被腸黏膜吸收,高效抑制腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)和RNA合成,進(jìn)而更好地殺滅腫瘤細(xì)胞,降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率及局部復(fù)發(fā)率,改善患者預(yù)后。CRC的診斷依賴于多種炎癥因子和腫瘤標(biāo)志物,其濃度變化對(duì)病情的發(fā)展、術(shù)后預(yù)后具有較高的輔助判斷價(jià)值。本研究采用放療聯(lián)合卡培他濱化療治療CRC患者,觀察其循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、血清癌胚抗原 (CEA)及糖類抗原199(CA199)水平變化,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2021年1月—2022年9月江蘇省溧陽(yáng)市人民醫(yī)院腫瘤科收治的經(jīng)病理檢查確診為CRC的患者38例為研究對(duì)象。38例CRC患者病理分期為Ⅱ期17例,Ⅲ～Ⅳ期21例; 男24例,女14例; 年齡40～82歲。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者及家屬均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)病理學(xué)檢查確診為CRC者; ② 均無(wú)其他惡性病變者; ③ 自愿入組,積極配合治療及隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 結(jié)腸炎、直腸炎及新冠肺炎等病史者; ② 嚴(yán)重感染性疾病患者; ③ 無(wú)法完成隨訪者。

1.2 方法

給予38例CRC患者放療(使用ELEKTA infinity直線加速器, PHILIPS大孔徑模擬CT機(jī)購(gòu)自Royal Philips of the Netherlands)聯(lián)合口服卡培他濱片治療(商品名: 卓侖; 生產(chǎn)廠家: 齊魯制藥有限公司; 國(guó)藥準(zhǔn)字: H20133361; 批號(hào): 1E0783DE3、1D0703DE3、1D0523DE3、1C0413DE3), 每日2.5 g/m2, 連續(xù)治療5周。

血液標(biāo)本采集: 分別收集38例CRC患者治療前和治療1、2、3、4、5周的外周靜脈血5 mL, 做好標(biāo)記。采集2 h內(nèi), 4 ℃ 3 000×g離心10 min, 提取上清液,對(duì)其上清液中細(xì)胞碎片進(jìn)行清除,具體為上清液4 ℃ 16 000×g離心10 min, 所得上清液分裝在1.5 mL EP管中,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo),其余血清液氮凍存,以備檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

ctDNA的定量: 嚴(yán)格照按QIAamp Circulating DNA Kit說(shuō)明書(shū)提取血清中ctDNA, 取ctDNA 2 μL作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量模板,以LINE1為靶基因,進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性 5 min; 95 ℃變性 5 s, 60 ℃ 退火20 s, 72 ℃延伸 20 s, 循環(huán)45次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

CRC患者血清CEA、CA199的測(cè)定: 采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定儀(美國(guó)羅氏公司ModularE170)檢測(cè)血清CEA、CA199, 具體步驟按照儀器說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。所需試劑均購(gòu)自羅氏公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,首先行正態(tài)性檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用[M(P25,P75)]表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRC患者臨床資料與治療前ctDNA水平的相關(guān)性分析

38例CRC患者ctDNA含量為810(650, 1 005) ng/mL。治療前, CRC患者血漿ctDNA含量與其病理分期、性別、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05), 見(jiàn)表1。

表1 CRC患者臨床資料與治療前ctDNA的相關(guān)性分析[M(P25, P75)]

2.2 CRC患者臨床資料與治療前CEA、CA199水平的相關(guān)性分析

38例CRC患者CEA、CA199含量分別為4.30(4.00, 4.90)、16.75(14.00, 18.63) U/mL。CRC患者治療前腫瘤標(biāo)志物CEA水平與患者病理分期、性別、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。CA199水平與患者性別、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05); CA199水平與腫瘤的病理分期具有相關(guān)性(P<0.05), 見(jiàn)表2。

表2 CRC患者臨床資料與治療前CEA、CA199水平的相關(guān)性分析[M(P25, P75)] U/mL

2.3 CRC患者治療前后ctDNA、CEA及CA199水平變化

治療后CRC患者血清中ctDNA、CEA、CA199水平低于治療前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖1。

A: 治療前后ctDNA水平; B: 治療前后CEA水平; C: 治療前后CA199水平。圖1 CRC患者治療前后ctDNA、CEA以及CA199水平變化

2.4 CRC患者治療后ctDNA、CEA、CA199水平變化趨勢(shì)

ctDNA含量在治療開(kāi)始時(shí)明顯增加, 1周后逐漸下降,放療4周后含量趨于穩(wěn)定; CEA、CA199含量一直下降,在放療3周后趨于穩(wěn)定,見(jiàn)圖2。

A: ctDNA水平變化趨勢(shì); B: CEA水平變化趨勢(shì); C: CA199水平變化趨勢(shì)。圖2 CRC患者治療前后ctDNA、CEA、CA199水平變化趨勢(shì)

2.5 治療前CRC患者ctDNA、CEA及CA199含量的相關(guān)性

治療前, CRC患者的ctDNA含量與CEA含量無(wú)相關(guān)性(r=0.005,P=0.323); CRC患者治療前ctDNA含量與CA199水平呈正相關(guān)(r=0.365,P=0.021), 見(jiàn)圖3。

A: 治療前CRC患者ctDNA含量與CEA含量相關(guān)性散點(diǎn)圖; B: 治療前CRC患者ctDNA含量與CA199含量相關(guān)性散點(diǎn)圖。圖3 治療前CRC患者ctDNA含量與CEA、CA199含量的相關(guān)性

2.6 治療后CRC患者ctDNA含量與CEA、CA199含量的相關(guān)性

治療5周, CRC患者ctDNA含量與CEA含量無(wú)相關(guān)性(r=-0.013,P=0.354); CRC患者ctDNA含量與CA199水平呈正相關(guān)(r=0.318,P=0.013), 見(jiàn)圖4。

A: 治療后CRC患者ctDNA含量與CEA含量相關(guān)性散點(diǎn)圖; B: 治療后CRC患者ctDNA含量與CA199含量相關(guān)性散點(diǎn)圖。圖4 治療后CRC患者ctDNA含量與CEA、CA199含量的相關(guān)性

3 討 論

CRC發(fā)病率呈上升趨勢(shì)和年輕化趨勢(shì)[8-10]。大多數(shù)CRC患者早期癥狀不明顯,易出現(xiàn)漏診,且部分患者術(shù)后依從性差,導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重威脅其生命健康。對(duì)CRC進(jìn)行早期診斷是提高治療效果的關(guān)鍵因素[11]。隨著分子技術(shù)發(fā)展,尋找特異度及靈敏度高的CRC相關(guān)分子探針,有利于快速診斷CRC[12]。

癌癥患者的ctDNA主要來(lái)自于癌細(xì)胞,與健康者相比,惡性腫瘤患者血漿ctDNA水平明顯增高, ctDNA含量和其特殊性質(zhì)的改變能夠反映出原發(fā)性腫瘤的特點(diǎn)[13-16]。此外, ctDNA檢測(cè)具有多種優(yōu)點(diǎn),可隨時(shí)監(jiān)測(cè),準(zhǔn)確、快速地反映腫瘤基因突變,對(duì)腫瘤患者早期診斷具有重要意義[17]。研究[18]顯示, ctDNA水平變化可以較好預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性CRC的預(yù)后。在接受三線放療的轉(zhuǎn)移性CRC患者血漿中, ctDNA水平與總生存具有相關(guān)性[19-20]。此外, ctDNA水平可以反映各種生理、病理過(guò)程,其對(duì)患者腫瘤特異性基因突變具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值[21]。癌細(xì)胞的基因突變?yōu)閯?dòng)態(tài)變化的,非相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài), ctDNA具有實(shí)時(shí)反映癌細(xì)胞基因變異狀態(tài)的優(yōu)勢(shì)[22-23]; 研究[24-25]發(fā)現(xiàn), ctDNA具有腫瘤原發(fā)灶、腫瘤侵襲灶和轉(zhuǎn)移灶的全部遺傳信息,且不會(huì)受腫瘤異質(zhì)性的影響。

CEA濃度與CRC密切相關(guān), CRC患者中CEA顯著增加。CA199是一種常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物,其水平變化與多種消化道腫瘤相關(guān)。研究[26]發(fā)現(xiàn), CEA、CA199濃度變化與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。本研究旨在追蹤治療后CRC患者血清 CEA、CA199水平以及ctDNA水平變化,以評(píng)價(jià)ctDNA作為CRC放療效果及預(yù)后判斷的生物學(xué)指標(biāo)的可行性。本研究發(fā)現(xiàn),患者在接受治療1周后,血清中ctDNA含量較治療前出現(xiàn)一過(guò)性增加,這可能是由于腫瘤組織在放化療過(guò)程中受到刺激,導(dǎo)致腫瘤組織釋放出更多的ctDNA。此后,患者ctDNA水平開(kāi)始下降并逐漸趨于平穩(wěn),這與放化療后腫瘤組織開(kāi)始縮小,產(chǎn)生ctDNA的來(lái)源減少, ctDNA進(jìn)一步減少釋放,并逐漸降低趨于平穩(wěn)?；颊呓邮苤委熀? CA199、CEA水平持續(xù)下降,在治療3周后, CA199、CEA含量降至正常水平,其原因或與腫瘤組織縮小或消失有關(guān),以及血清中CA199、CEA逐漸降解導(dǎo)致。

本研究結(jié)果顯示,治療前CRC患者ctDNA、CEA水平與年齡、性別、病理分期不存在相關(guān)性; 與CRC Ⅱ期患者相比, Ⅲ～Ⅳ期患者CA199濃度顯著上升,證明CA199水平與該疾病的病理分期具有相關(guān)性,患者CA199濃度越高其分期越晚。本研究發(fā)現(xiàn), CRC患者治療前血漿中ctDNA和CEA濃度間無(wú)相關(guān)性(r=0.005,P=0.323); ctDNA含量與CA199水平呈正相關(guān)(r=0.365,P=0.021), 證明CEA和CA199含量的變化對(duì)CRC患者診斷、療效和預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要意義。放療5周, CRC患者ctDNA含量與CEA含量間無(wú)相關(guān)性(r=-0.013,P=0.354); ctDNA含量與CA199水平呈正相關(guān)(r=0.318,P=0.013)。上述結(jié)果提示, ctDNA、CA199水平變化對(duì)臨床療效的判斷更具有參考價(jià)值。

綜上所述, ctDNA在CRC中具有良好的診斷價(jià)值,同時(shí)其與腫瘤標(biāo)志物CA199關(guān)系密切,可能可用于聯(lián)合評(píng)估CRC患者預(yù)后效果,但該結(jié)論還需進(jìn)一步證實(shí)。