結直腸癌組織中吻素-1、周期蛋白E 的表達及其臨床意義

陳文倩，丁曉璐

（1.常熟市第一人民醫院腫瘤科；2.常州市第一人民醫院病理科，江蘇 蘇州 215500）

結直腸癌是嚴重危害人類生命健康的常見消化系統惡性腫瘤，雖然各種綜合治療手段不斷發展，但總體生存率依舊欠佳，其原因主要是遠處轉移高發生率及腫瘤局部高復發率，因此抑制和治療結直腸癌遠處轉移是影響患者預后重要因素。結直腸癌的發生和進展呈多因素、多階段性，與多個癌基因的激活和過度表達、抑癌基因及脫氧核糖核酸（DNA）修復基因突變或功能缺失密切相關。目前，腫瘤細胞形成的分子機制及其與癌基因和抑癌基因的關系已成為研究熱點。吻素-1（Kiss-1）是從黑色素瘤細胞株中發現的一種腫瘤轉移抑制基因，具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，正常情況下Kiss-1 在正常組織中表達較多，但在腫瘤組織，特別是消化系統腫瘤，如在胃癌、食管癌中等表達常常缺失，表明Kiss-1 參與了腫瘤的發生、發展過程[1-2]，但其具體作用尚不明確。Cyclin E 屬于細胞周期蛋白家族，在正常組織中該蛋白表達較低或不表達，有報道稱，Cyclin E 與惡性腫瘤有關，如乳腺癌中Cyclin E 過量表達與腫瘤發生及其惡性表型和不良預后密切相關[3]。本研究旨在探究Kiss-1、Cyclin E 在結直腸癌組織中的表達情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析常熟市第一人民醫院2016 年1 月至2020 年3 月收治的85 例結直腸癌患者的臨床資料，取其結直腸癌組織標本與結直腸癌癌旁正常組織標本，分別作為結直腸癌組、癌旁組。診斷標準：參照《結直腸癌診療規范（2015 年版）》[4]中的相關診斷標準。納入標準：符合上述診斷標準，并經電子結腸鏡檢查取活檢病理、影像學檢查及術后標本送病理檢查等確診者；年齡≥ 18 歲；術前無放化療、免疫治療、靶向治療、中醫治療等治療史者；臨床資料完整者等。排除標準：多源性腫瘤或多發癌者；存在炎癥性腸病、家族性腺瘤性息肉病者；合并血液系統、免疫系統疾病者等。院內醫學倫理委員會已批準此研究實施。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 所有手術切除標本包括腫瘤組織和癌旁正常組織。癌旁正常組織為距癌組織邊緣5 cm 以上的正常組織，常規進行石蠟阻滯連續切片，切片厚度為4 μm。

1.2.2 免疫組化檢測 采用檸檬酸高溫高壓對切片進行抗原修復，加入封閉血清，室溫孵育30 min，隨后棄去血清，加入抗Kiss-1 或抗Cyclin E 一抗進行4 ℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3 次，5 min/次，加入二抗室溫孵育1 h，PBS 漂洗3 次，5 min/次，最后采用3, 3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色，鏡下控制反應時間。獲得滿意染色效果后，切片自然晾干，采用酒精、二甲苯梯度脫水透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察Kiss-1、Cyclin E 的陽性表達情況。免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。以PBS 代替一抗作陰性對照。

1.2.3 結果判定標準 Kiss-1 表達定位于細胞質和細胞膜，呈淺黃色、黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。Cyclin E 主要表達于細胞核內，均表現為棕黃色或黃色顆粒。以染色強度作半定量評分，Kiss-1 免疫陽性反應物主要著色于胞漿，Cyclin E 主要著色于胞核，根據染色強度分為：無染色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分。根據陽性細胞所占比例進行評分：陽性細胞所占比例小于5%計為0分，5%≤陽性細胞所占比例＜25%計為1 分；25% ≤陽性細胞所占比例＜50%計為2 分；50% ≤陽性細胞所占比例＜75%為3 分；陽性細胞所占比例≥ 75%計為4 分。結合染色強度分數和陽性細胞所占比例分數，兩者相加，＞3 分為陽性表達，≤ 3 分為陰性表達[5]。

1.3 觀察指標①觀察結直腸癌組織與結直腸癌癌旁組織Kiss-1、 Cyclin E 表達情況。②分析結直腸癌組織Kiss-1、Cyclin E 陽性表達與患者臨床病理特征的關系。其中臨床病理特征包括年齡、性別、腫瘤直徑（＜3 cm 或≥ 3 cm）、分化程度[6]（高分化：75%以上癌細胞分化良好，呈低度惡性；中分化：25%~75%的癌細胞分化良好，呈中度惡性；低分化：分化良好的癌細胞小于25%，呈高度惡性）、浸潤深度、神經侵犯（有或無）、脈管侵犯（有或無）、淋巴結轉移（有或無）、遠處轉移（有或無）、臨床分期[6][根據T、N、M 分期綜合評估，T 分期（T1、T2、T3、T4a）、N 分期（N0、N1、N2）、M 分期（M0、M1），包括Ⅰ期（T1~2、N0、M0）、Ⅱ期（T3~4b、N0、M0）、Ⅲ期（T1~4b、N1~2、M0）、Ⅳ期（任何T、任何N、M1a~1b）]

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0 統計學軟件分析數據，計量資料經K-S 法檢驗均符合正態分布，以(±s)表示，行t檢驗；計數資料以[ 例(%)]表示，兩組間比較行χ2檢驗，多組間比較行χ2趨勢分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌與癌旁正常組織中Kiss-1、Cyclin E 蛋白陽性表達情況比較結直腸癌組中Kiss-1 陽性表達患者占比顯著低于癌旁組，Cyclin E 陽性表達患者占比顯著高于癌旁組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。免疫組化染色顯示，Kiss-1 陽性免疫反應物主要表達在細胞胞漿，呈現深棕色反應，陽性反應細胞比例約35%，見圖1-A；Cyclin E 的陽性免疫反應物主要表達在細胞核，呈現深棕色反應，細胞核染色較深，陽性反應細胞比例約60%，見圖1-B。

圖1 結直腸癌組織Kiss-1、Cyclin E 免疫組織化學染色陽性圖片（×400）

表1 結直腸癌與癌旁正常組織中Kiss-1、Cyclin E 蛋白陽性表達情況比較[例(%)]

2.2 結直癌組織Kiss-1、Cyclin E 表達與患者臨床病理特征的關系Kiss-l 蛋白陽性表達中低分化、有淋巴結轉移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均顯著低于Kiss-l 蛋白陰性表達；Cyclin E 蛋白陽性表達中有淋巴結轉移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均顯著高于Cyclin E 蛋白陰性表達，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 結直腸癌組織Kiss-1、Cyclin E 表達與患者臨床病理特征的關系[例(%)]

3 討論

結直腸癌的發病機制眾多，臨床治療靶點有限，探究新興研究靶點與已知治療靶點的相關性，有利于結直腸癌的精準靶向治療，因此，在結直腸癌發病早期制定特異性的診療方案和找出能預測患者預后的特異性標志物已成為癌癥治療的研究熱點。

Kiss-1 作為人類腫瘤轉移抑制基因，編碼145 個氨基酸的蛋白質和19 個氨基酸的信號肽，定位于1 號染色體短臂3 區2 帶。Kiss-1 可大量表達于正常組織中，包括中樞神經系統、消化系統等部位，其中以胎盤組織中的表達水平最高，而表達缺失主要在多種存在轉移的腫瘤組織中，臨床研究已經表明，Kiss-l 與黑色素瘤、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、胃癌等的轉移密切相關[7]。Kiss-1 基因首先在黑色素瘤細胞株中發現，其基因表達產物可顯著抑制腫瘤細胞的增殖，同時誘導腫瘤細胞的分化和凋亡[8]。當結直腸癌組織Kiss-1 表達降低時，其編碼產物多肽與配體GPR54 的結合減少，導致腫瘤細胞的基質金屬蛋白酶活性增強，腫瘤細胞增殖、集落形成能力提高，腫瘤進一步發生侵襲、轉移，導致患者預后較差[9]。本研究中，結直腸癌組中Kiss-1 陽性表達患者占比顯著低于癌旁組；Kiss-l蛋白陽性表達中低分化、有淋巴結轉移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均顯著低于Kiss-l 蛋白陰性表達，提示Kiss-1 蛋白在結直腸癌組織中呈低表達，且Kiss-1 的表達水平與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、臨床分期有關。因此，監測Kiss-1蛋白表達有希望成為評估結腸癌高危因素和惡性生物學行為的標志物。

Cyclin E 主要表達于細胞核，是細胞周期G1期的正向調節因子，其調控細胞增殖主要是通過縮短G1期，引起中心體過增殖，干擾有絲分裂，形成不穩定的染色體，從而誘發腫瘤形成[10]。本研究中，結直腸癌組中Cyclin E 陽性表達患者占比顯著高于癌旁組；Cyclin E 蛋白陽性表達中有淋巴結轉移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均顯著高于Cyclin E蛋白陰性表達，提示Cyclin E 蛋白在結直腸癌組織中呈高表達，且Cyclin E 的表達水平與淋巴結轉移、臨床分期有關。相關研究中，Cyclin E 的高表達對細胞的凋亡產生抑制作用，不僅提高結直腸癌細胞的生存能力，還參與結直腸癌的侵襲和轉移，其表達水平可能成為判斷結直腸癌預后的潛在指標[11]。張庚等[12]研究結果顯示，在結腸鏡所取結直腸癌組織中Cyclin E 陽性率為66.3%，而鄰近正常黏膜組織中Cyclin E 陽性率僅為23.7%，并且結直腸癌組織中其表達與原發腫組織分化、臨床分期呈顯著正相關，說明Cyclin E 過度表達可能與結直腸癌的發生及進展有關。

綜上，Kiss-1 蛋白在結直腸癌組織中呈低表達，Cyclin E 蛋白在結直腸癌組織中呈高表達，且Kiss-1、Cyclin E 的表達水平與患者臨床病理特征有關，早期可通過檢測上述指標對患者的病情進行判斷，為臨床后續治療提供一定的參考依據。