不同采收期對‘野釀2 號’毛葡萄酒理化特性及香氣成分的影響

黃 竟，黃 羽，曹慕明，陳國品，黃秋鳳，李 瑋，謝蜀豫，管敬喜

（廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧 530007）

香氣是評價葡萄酒的重要感官品質指標之一，葡萄酒中的香氣成分種類、含量、性質及相互之間的平衡，決定了葡萄酒的風格和典型性[1]。葡萄酒中的香氣成分不僅與發酵有關，還與葡萄的成熟度有關。果實成熟度是影響次生代謝物積累和決定品種特征的主要因素之一[2-3]。一般來說，葡萄收獲時間僅由果汁糖含量和糖酸比決定。然而在溫暖或氣候炎熱的地區，影響葡萄采收時間的因素可能更多，通常會造成早采或僅達到糖成熟而采摘，因此香氣和風味的潛力不能得到充分的體現和表達。

在恰當的時間采摘葡萄，則葡萄酒具有優雅平衡的香氣，早采可能會導致葡萄酒生青味過重，晚采可能會造成葡萄酒香氣損失[4]。翟婉麗等[5]以楊凌地區‘媚麗’葡萄為材料，研究其采收期對葡萄酒質量的影響，結果顯示相比8 月19 日和8 月28 日葡萄釀造的葡萄酒，8 月24 日葡萄酒香氣總含量高，香氣種類更豐富。段雪榮等[6]對昌黎地區成熟度17.0～22.0°Brix 的赤霞珠所釀的葡萄酒香氣進行了分析，發現當糖度為20.6°Brix 時酒中香氣成分總量最高且隨著原料成熟逐漸增加，所釀酒中萜烯醇和去甲類異戊二烯化合物含量增加，果香和花香特征更為明顯。Gambuti 等[7]的研究表明，未成熟艾格尼科（Aglianico）葡萄釀造的葡萄酒具有紅色水果、草本、黑胡椒、蘆筍和煙草的香味，葡萄成熟后的葡萄酒中含有大量的櫻桃、草莓和煙草香氣，過熟葡萄釀造的葡萄酒則具有洋薊、黑胡椒、櫻桃、藍莓、李子、紫羅蘭和茶等香氣特征。

毛葡萄（Vitis quinquangularisRehd.）屬真葡萄亞屬（Euvitis）東亞種群，原產于我國，廣泛分布于黃河以南的各省區。在廣西毛葡萄較集中地分布在桂中、桂北、桂西的巖溶地貌地區。‘野釀2 號’是由廣西農業科學院選育的兩性花野生毛葡萄優良品種，該品種耐旱耐瘠抗病力強，同時對南方高溫高濕氣候適應性較好，現已在廣西大面積種植，并成為釀造毛葡萄酒的主要原料[8]。然而受傳統觀念及氣候因素影響，毛葡萄通常在著色完成或部分完成時就進行采摘，遠未達到充分成熟的狀態，導致毛葡萄酒偏酸且香氣特征以生青味、泥土味、肥皂味等不良氣味為主[9-10]，影響了毛葡萄酒應有的品質。為此本研究以廣西羅城‘野釀2 號’毛葡萄為研究對象，在監測常規指標的基礎上，采用氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）進行毛葡萄酒揮發性組分的檢測，并采用內標標準曲線法對檢出組分進行準確定量，結合香氣活性值（odor activity values，OAV）分析的方法，探究不同采收期‘野釀2 號’毛葡萄酒香氣變化情況，以期為釀制優質毛葡萄酒提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘野釀2 號’毛葡萄樣品 采自廣西羅城縣金秋農業有限公司毛葡萄基地；硫酸銅 分析純，天津市申泰化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉、氯化鉀 分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀分析純，天津市福晨化學試劑廠；氫氧化鈉 分析純，天津市化學試劑公司；磷酸 分析純，無錫市亞泰聯合化工有限公司；鹽酸 分析純，無錫市亞盛化工有限公司；葡萄糖、磷鉬酸、鎢酸鈉、沒食子酸、單寧酸、乙酸 分析純，天津市大茂化學試劑廠；三水和乙酸鈉 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；檸檬酸鈉 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；蘆丁、酒石酸、L-蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和乳酸色譜純標準品，美國Sigma 公司；揮發性化合物標準品、C6～C24正構烷烴 美國Sigma-Aldrich 公司；K1 活性干酵母 法國萊蒙特公司。

1260A 高效液相色譜儀、6890 GC 氣相色譜與5975C MS 質譜聯用設備 美國Agilent 公司；DVB/CAR/PDMS 頂空固相微萃取纖維頭 美國Supelco 公司；HP-INNOwax 氣相色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm） 美國J&W Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 采樣 2021 年，根據廣西羅城歷年的采收時間及氣候條件選取8 月15 日作為常規采收時間進行采樣，然后分別于20 和40 d 后進行采樣，后兩次因天氣等原因采收時間實際為9 月10 日（延遲26 d）、9 月23 日（延遲39 d）。

1.2.2 葡萄酒釀造 毛葡萄酒釀造參考小容器發酵法[11]，發酵容器為30 L 不銹鋼罐，發酵酵母為K1 活性干酵母，添加量為200 mg/L，發酵溫度20～25 ℃，SO2濃度為60 mg/L。發酵結束后進行倒灌并于15～20 ℃密閉貯藏3 個月，取澄清汁測定葡萄酒的理化指標和香氣成分。

1.2.3 葡萄與葡萄酒理化指標的測定 總糖：斐林試劑滴定法（葡萄糖計）；酒精度：酒精計法；總酸：NaOH 滴定法（酒石酸計）；揮發酸：水蒸汽蒸餾法（醋酸計）；總酚：福林-肖卡試劑法（以沒食子酸計）；單寧：福林-丹尼斯試劑法（以單寧酸計）；有機酸：液相色譜法，以上理化指標檢測方法參考自《葡萄酒分析檢驗》[12]。總花色苷檢測采用pH 示差法[13]；總類黃酮檢測采用蘆丁法[14]。

1.2.4 毛葡萄酒香氣成分檢測方法 采用頂空固相微萃取（head space solid-phase micro extraction，HSSPME） 與氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）相結合進行揮發性組分分析，具體方法參考文獻[15-17]。

頂空-固相微萃取條件：在20 mL 樣品瓶中準確加入1.00 g NaCl、5 mL 樣品、10 μL 4-甲基-2-戊醇水溶液（內標，1.0088 g/L）和轉子，在40 ℃條件下加熱30 min，同時以500 r/min 轉速進行攪拌；將已活化的萃取纖維頭插入樣品瓶的頂空，40 ℃條件下加熱30 min。每個樣品三次重復。

GC-MS 條件：氣相色譜與質譜聯用設備載氣為氦氣（He），流速為1 mL/min；進樣口溫度為250 ℃，解吸時間8 min，采用不分流模式進樣；程序升溫設定為初始溫度50 ℃，保持1 min；以3 ℃/min 升至220 ℃，保持5 min。離子源為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量為70 eV，質量掃描范圍為30～350 m/z。輔助加熱區溫度、離子源溫度和四極桿溫度分別為250、230 和150 ℃。

揮發性成分的定性定量：定性分析，采用自動質譜退卷積定性系統（auto mass spectral deconvolution& identification system，AMDIS）解譜，利用峰質譜圖、保留時間或保留指數，與標準品、美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）2011 標準譜庫以及文獻收錄化合物的質譜信息進行匹配，進行化合物的定性分析。定量分析采用內標標準曲線法，對于已有標準品的揮發性組分利用其相應的標準曲線來進行定量，沒有標準品的物質利用化學結構相似、碳原子數相近、官能團相似的香氣標準品的標準曲線進行半定量。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0 軟件進行數據處理，采用Origin 2017 軟件進行制圖。圖、表中數據格式為：±SE，X 代表平均值，SE 為標準誤差；同一行數據后不同字母表示同一指標不同采收期差異顯著Duncan 多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同采收期對毛葡萄果實總糖和總酸的影響

由圖1 可知，不同采收時期‘野釀2 號’毛葡萄果實中糖、酸相互間均存在顯著差異（P＜0.05），隨著采收時間的后移，果實中總糖含量逐漸升高，而總酸含量則逐漸下降，含量由8 月15 日的20.37 g/L 下降到9 月10 日的11.3 g/L 和9 月23 日的10.74 g/L，分別降低了44.5%和47.3%，可以看出適當的延遲采收可以降低毛葡萄果實的含酸量，有利于釀造質量較好的毛葡萄酒。

圖1 不同采收時期毛葡萄糖、酸指標Fig.1 Sugar and acid of grapes collected at different harvest times

2.2 不同采收期對毛葡萄酒理化指標的影響

將不同時期采收的‘野釀2 號’毛葡萄釀造成干紅毛葡萄酒并對其理化指標進行分析。由表1 可知隨著采收時間的后移，毛葡萄所釀葡萄酒酒精度逐漸升高，總酸含量逐漸降低，相互間均存在顯著性差異（P＜0.05），酒精度由3.65%vol 增加至6.89%vol；總酸從20.69 g/L 降低至10.59 g/L。毛葡萄酒中殘糖含量逐漸下降，但相對所釀干紅葡萄酒而言，殘糖含量偏高，8 月15 日和9 月10 日采收的毛葡萄酒，殘糖含量分別為8.25 和6.27 g/L，高于國標GB 15037 中≤4 g/L 的要求，這有可能是釀酒酵母在發酵過程中受到高有機酸、乙醇、pH、滲透壓等脅迫而影響了其發酵性能[18-19]，造成糖發酵不徹底。葡萄果實中的酚類物質在發酵過程中通過皮渣浸漬作用進入到葡萄酒中，其中如花色苷、類黃酮、單寧等物質會對葡萄酒的色澤、口感、氣味及陳釀潛力等產生重要影響[20]。毛葡萄酒中除花色苷含量呈現出先升高后略有下降的趨勢外，總酚、單寧和總類黃酮含量則隨著時間的推移，含量逐漸升高，相互間均存在差異顯著（P＜0.05），總酚由807.65 mg/L 增加至1466.21 mg/L；單寧由985.68 mg/L 增加至1410.98 mg/L；類黃酮由116.13 mg/L 增加至202 mg/L。葡萄果實中的酚類物質組成和含量與成熟度有極大的相關性，且決定葡萄酒潛在的質量[21-22]，因此延遲采收有利于提高毛葡萄酒的酒體結構和品質。

表1 不同采收時間毛葡萄酒理化指標Table 1 Physiochemical indices of wines made from grapes collected at different harvest times

由表2 可知，‘野釀2 號’毛葡萄酒中有機酸主要是酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和乳酸，其中酒石酸和蘋果酸是占比較高的有機酸，二者在3 個不同采收期毛葡萄酒有機酸含量的占比分別是97.39%、91.39%和73.95%。酒石酸是葡萄的特征酸，大部分以酒石酸鹽的形式存在，隨著酒精度的提高，酒石酸的溶解度逐漸下降。蘋果酸也是主體酸，但易被同化降解[23]。在本研究中，隨著采摘時間的后移，‘野釀2 號’毛葡萄酒中酒石酸逐漸減少，而蘋果酸先大幅下降后略有上升，相互間均有顯著性差異（P＜0.05），其中酒石酸由6731.89 mg/L 降至2866.45 mg/L，降幅達57.42%；蘋果酸則由9707.29 mg/L 降至2778.74 mg/L 后又增至3247.28 mg/L；在不同采收期的毛葡萄酒中，乳酸增幅較大，由311.8 mg/L 增加至1919.75 mg/L，這有可能是酵母發酵代謝產生部分乳酸所致[24]；檸檬酸與琥珀酸在3 種毛葡萄酒中的含量均較低。酒石酸酸味生硬尖銳，很難被酵母代謝。蘋果酸賦予酒體酸澀感，需要乳酸菌進一步將其轉化，從而使葡萄酒口感更細膩柔和。乳酸口感柔和，酸味較低，對葡萄酒口感有正向作用[25]。因此，從毛葡萄酒有機酸總量及組成上來看，9 月23 日采摘的毛葡萄更有利于釀造酒體柔和的葡萄酒。

表2 不同采收時間毛葡萄酒有機酸含量Table 2 Concentrations of organic acids in wines at different harvest times

2.3 不同采收期對毛葡萄酒香氣成分的影響

由表3 可知，不同時期采收的毛葡萄酒中共檢測出香氣物質89 種，包括22 種醇類、37 種酯類、7 種酸類、5 種醛類、5 種萜烯類及其他物質13 種，其中8 月15 日采摘組為80 種，香氣總量為490325.7 μg/L；9 月10 日采摘組為87 種，香氣總量為648676.07 μg/L；9 月23 日采摘組為87 種，香氣總量為852370.83 μg/L。3 組樣品在香氣成分上的差異不明顯，但在化合物的含量上存在顯著差異（P＜0.05），并且隨著采摘時間的推遲，相應的毛葡萄酒中香氣物質的總含量逐漸升高。

表3 不同采收期毛葡萄酒香氣成分（μg/L）Table 3 Aroma components of wines at different harvest times (μg/L)

2.3.1 高級醇類 高級醇（又稱雜醇）一般指具有兩個以上的碳原子的一元醇[26]，葡萄酒中的高級醇主要來源于酵母在酒精發酵過程中氨基酸或糖代謝的產物，如異丁醇、戊醇、異戊醇、己醇、辛醇、壬醇和苯乙醇等[27-28]。如表3 所示，3 個酒樣中共檢測出22 種高級醇類香氣成分，其含量分別占各自酒樣的73.11%、71.24%、68.93%，是所有香氣物質中含量最高的一類香氣物質，然而絕大多數醇類物質的濃度遠低于其閾值，僅有異丁醇、異戊醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇的濃度高于其閾值。異丁醇和異戊醇具有酒精味，3-甲硫基丙醇具有烤土豆和蒜香味，苯乙醇帶有玫瑰、蜂蜜香氣[15]。隨著采摘時間的延遲，‘野釀2 號’毛葡萄酒中醇類物質的總量明顯升高，但幾種主要醇類物質的變化各異，異戊醇呈升高趨勢，異丁醇、3-甲硫基丙醇呈先升高后下降的趨勢，苯乙醇呈先降低后升高趨勢。（E）-3-己烯-1-醇、葉醇、1-辛烯-3-醇、正庚醇、辛醇等物質香氣活性值較低（0.1＜OAV＜1），對毛葡萄酒香氣的影響較小。當高級醇濃度低于300 mg/L 時會對葡萄酒的香氣起到積極作用，而高于400 mg/L 時，會使葡萄酒香氣失去平衡，產生負面影響[29-31]。本研究中3 個采摘時期的毛葡萄酒中高級醇含量均超過300 mg/L，延遲采收的毛葡萄酒高級醇含量更是超過400 mg/L，這可能是造成毛葡萄酒生青味、肥皂味等不良氣味相對歐亞種葡萄酒過重的原因之一。

2.3.2 酯類 酯類物質是葡萄酒中最主要的一類揮發性芳香物質，是酵母發酵的副產物，可賦予酒體果香和花香[28]。由表3 可知，‘野釀2 號’毛葡萄酒中共檢測到37 種酯類化合物，其中乙酯類21 種，且隨著采摘時間越往后，酯類的含量越高，且不同采收期毛葡萄酒中酯類物質的含量存在顯著差異（P＜0.05），分別是124173.83、175188.78、257812.27 μg/L。乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、3-羥基丁酸乙酯和乙酸異戊酯是其中含量比較高的酯類物質。本研究中，己酸乙酯、丁酸乙酯、肉桂酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸乙酯由于其較高的OAV 值，是‘野釀2 號’毛葡萄酒主要的香氣成分，主要呈花香與果香風味。不同采收期的‘野釀2 號’毛葡萄酒中含量較高的酯類物質差異明顯，8 月15 日中肉桂酸乙酯和3-苯丙酸乙酯的含量最高，9 月10 日中是乙酸乙酯和乙酸異戊酯，9 月23 日中是丁酸乙酯和己酸乙酯，這種含量和成分上的差異賦予毛葡萄酒不同的花、果香香氣特征。

2.3.3 酸類 酸類物質是葡萄酒發酵過程中酵母代謝的副產物，其濃度主要取決于酒的初始成分和發酵條件[28]。由表3 可知，‘野釀2 號’毛葡萄酒中共檢測出7 種脂肪酸，9 月10 日中的脂肪酸含量最高，為10041.42 μg/L，最低的是9 月23 日的5523.44 μg/L，8 月15 日的為6403.69 μg/L。丁酸、異戊酸、己酸、辛酸等脂肪酸的含量均超過其閾值，是影響毛葡萄酒風味的主要酸類物質。C6～C10脂肪酸對葡萄酒香氣的平衡協調有很重要的作用[33]，當脂肪酸的含量超過20 mg/L 時，會給葡萄酒帶來不愉快的脂肪味，含量在4～10 mg/L 時，會給予葡萄酒奶酪與奶油的香味[30]。本研究中除9 月10 日中脂肪酸含量略大于10 mg/L，8 月15 日和9 月23 日中的脂肪酸都在適量的范圍內。異戊酸、己酸、辛酸由于較高的OAV值，是毛葡萄酒中重要的特征香氣物質。

2.3.4 醛類 醛類物質通常是由酵母催化丙酮酸鹽脫羧生成[34]。在不同采摘時期的‘野釀2 號’毛葡萄酒中共檢測到5 種醛類化合物，且各毛葡萄酒中醛類化合物含量差異不明顯（P＜0.05）均在1200 μg/L至1300 μg/L 之間。醛類物質在香氣總含量種所占比例較低，但其中的苯甲醛和香草醛含量高于其閾值，二者能夠賦予葡萄酒玫瑰花香和奶香等香氣。

2.3.5 萜烯類 萜烯類化合物通常有花香、甜水果和檸檬味等氣味，嗅覺閾值在0.05～0.09 μg/L，具有很高的香氣活性[35]。由表3 可知，本研究中共檢測到4 種萜烯類和1 種降異戊二烯類成分，分別是香茅醇、芳樟醇、α-松油醇、1,1,6 三甲基-1,2 二氫萘（TDN）和β-大馬酮。葡萄酒中萜烯類化合物含量通常很低，但由于較低的閾值，它們可能會直接影響葡萄酒的香氣特征[36]。在毛葡萄酒的檢測中，具有較高香氣活性值的萜烯類物質主要是β-大馬酮、TDN、芳樟醇，它們分別具有烤蘋果、煤油、玫瑰花等香氣，在不同采摘時期的毛葡萄酒中含量差異顯著（P＜0.05）。

2.3.6 其它 除上述物質外，本研究中還檢測到多種酚類物質、苯乙烯、4-異丙基甲苯、4-羥基苯乙烯和（E）-玫瑰醚等成分。揮發性酚類物質在葡萄酒中的含量通常高于自身的感官閾值，從而極易影響和修飾葡萄酒的風味[15]。在毛葡萄酒中共檢測到愈創木酚、苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、間甲酚、丁香酚、4-乙基苯酚、3-乙基苯酚和異丁香酚8 種酚類物質，其中OAV＞1 僅有丁香酚，該物質有肉桂、丁香等氣味。

2.4 香氣活度值和毛葡萄酒香氣輪廓

香氣活性值（OVA）是表征葡萄酒中各香氣成分對實際香氣貢獻大小的一種普遍方法，通常認定香氣活度值大于1 的香氣物質為活性香氣物質[29-30]，但0.1≤OAV≤1 的物質對酒樣總體香氣也具有一定貢獻[31]。根據OAV 值，共確定35 種關鍵呈香香氣成分，詳見表4。

表4 不同采收期毛葡萄酒關鍵香氣成分香氣活性值Table 4 Main aroma components of wines at different harvest times

參考Cai 等[32]的做法，依據相似的氣味描述，將葡萄酒中的香氣化合物分為9 個香氣類型，并計算出每個類型的香氣活性值總和。如圖2 所示，通過對香氣類型的分析表明，本研究中‘野釀2 號’毛葡萄酒的香氣特征主要表現為果香味、花香味、焦糖味、化學味和脂肪味（∑OAV＞30），植物味對毛葡萄酒香氣也具有一定貢獻（13＞∑OAV＞6），而泥土味和燒烤味對毛葡萄酒整體香氣的貢獻相對較低（∑OAV＜1）。

圖2 不同采收期毛葡萄酒各香氣類型香氣活性值Fig.2 Total OAVs (∑OAV) of aroma series in wines from different harvest times

由表4 可知，在構成‘野釀2 號’毛葡萄酒主要香氣特征的成分中，異丁醇、異戊醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、肉桂酸乙酯、異戊酸、己酸、辛酸、苯乙醛、香蘭素、β-大馬酮、TDN 和丁香酚等香氣成分其香氣活性值（OAV）均超過了1，因而是‘野釀2 號’毛葡萄酒典型香氣的主要貢獻者。隨著采摘時間的延遲，‘野釀2 號’毛葡萄酒除果香味逐漸增加，脂肪味逐漸降低外，花香味、植物味、焦糖味、化學味和泥土味則呈現先增加后下降的趨勢，但燒烤味變化不明顯。相比8 月15 日和9 月23 日，9 月10 日的毛葡萄酒具有更濃的花香味和焦糖味。8 月15 日的毛葡萄酒則由于異戊酸、辛酸等脂肪酸含量高而具有較濃的脂肪味；9 月23 日的毛葡萄酒除植物味、泥土味、燒烤味外，其余各類香氣的活性值較為均衡。

3 結論

通過對廣西羅城不同采收期‘野釀2 號’毛葡萄及其葡萄酒的比較研究表明隨著采收期的延遲，毛葡萄果實的糖分逐步提高，而滴定酸大幅度降低。對于釀造的葡萄酒來說，隨著采收期的后移，毛葡萄酒中的酒石酸、蘋果酸、殘糖等指標大幅下降，酒度、單寧、多酚和總類黃酮等物質呈增加趨勢。在毛葡萄酒香氣方面，采用HS-SPME-GC-MS 檢測技術和香氣活性值分析得出，延遲采收有助于增加毛葡萄酒香氣物質的含量，9 月23 日采摘組的葡萄酒中香氣物質含量最高，為852370.83 μg/L。醇類是毛葡萄酒最主要的香氣成分，酯類次之，二者在3 種酒樣中占比分別為98.43 %、98.25 % 、99.17 %；毛葡萄酒的主要香氣類型以果香味、花香味、焦糖味、化學味和脂肪味為主，且不同采收期的毛葡萄酒香氣特征差異明顯，其中9 月10 日的毛葡萄酒具有更濃的花香味和焦糖味。因此適當延遲采收有利于釀造出酸度適宜、酒體結構感強且更多花果香味的毛葡萄酒。