基于離體模型研究推測荸薺蒸制中LPC（18:1）和LPE（18:1）形成壬醛和癸醛的機制

羅秀娟，羅楊合, ，李官麗，黎小椿，張奕濤，聶 輝，伍淑婕,

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州 545006；2.廣西康養食品科學與技術重點實驗室，賀州學院，廣西賀州 542899）

荸薺（Eleocharis dulcis（Burm. f.） Trin.）可鮮食也可熟食，其蒸煮后產生一種特有的香味，主要成分是壬醛和癸醛[1]。脂質氧化是生成醛類風味物質的主要反應[2-4]。鮮荸薺中含0.1%脂肪[5]。前期研究發現，油酸酰溶血磷脂酰膽堿18:1（LPC（18:1））和油酸酰溶血磷脂酰乙醇胺18:1（LPE（18:1））分別占鮮荸薺中溶血磷脂類物質的8%和4%，而蒸制30 min后LPC（18:1）和LPE（18:1）分別降為0.1953%和0.0001%，顯然LPC（18:1）和LPE（18:1）發生了反應。溶血磷脂具有磷脂一般的化學性質，可發生脂質水解和脂質氧化反應[6-7]。目前，脂質氧化主要發生在腌制和熱加工的水產品和肉類[8-10]，而未見果蔬類食品加工過程發生脂質氧化的文獻報道。

脂質氧化機理遵循自由基鏈式反應，包括引發、傳遞和終止三個階段。在蒸制過程中，脂質氧化的引發因子主要是高溫。引發階段是脂質分子中不飽和酰基鏈上緊靠雙鍵的亞甲基上的H 被自由基提取形成烷基自由基（R·），R·再與O2反應生成過氧基（ROO·），ROO·可從其他脂質分子的不飽和?；溕系碾p鍵α-位奪取氫原子形成氫過氧化物（ROOH）和新的R·[11-13]。在熱氧化過程中，高溫下生成的ROOH非常不穩定，-O-O-鍵容易斷裂生成烷氧自由基（RO·）[14]。RO·中的-C-C-鍵和-C-O-鍵容易發生β-均裂生成具有低閾值的揮發性風味化合物[11]。ROOH的分解能夠促進自由基鏈式反應的傳播[15-16]。最后自由基發生雙分子反應生成非自由基產物或者通過過氧化劑的干預來終止自由基鏈式反應。脂質氧化反應形成醛類風味物質機制研究主要有兩種方法：一種是在原位模型中分析反應底物、中間產物、最終產物的相關性，并通過離體模型進行驗證，推測揮發性風味物質可能形成的路徑[17-18]；另一種是采用同位素示蹤技術定向示蹤解析同位素標記物的離子片段演變的分子路徑，研究反應底物向最終產物轉變的分子路徑[19-20]。與同位素示蹤技術相比，離體模型在研究風味物質形成機制中具有成本低和操作簡便的優點。

目前，溶血磷脂氧化反應主要基于脂氧合酶的催化下發生[21-23]，而在蒸制中的氧化反應未見文獻報道。荸薺蒸制中風味物質形成機制研究鮮見報道。本研究模擬荸薺的pH、LPC（18:1）和LPE（18:1）含量及蒸制條件，構建了LPC（18:1）、LPE（18:1）和油酸離體模型，以過氧化值（POV）和油酸含量作為蒸制過程中溶血磷脂發生氧化、水解反應的重要指標[24]，探討荸薺蒸制中壬醛和癸醛的形成機制，以期為果蔬風味物質形成機制研究和風味品質調控提供科學參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

荸薺 新鮮，大小均勻，購于廣西賀州市市場；LPC（18:1）、油酸 色譜純，Sigma Aldrich（上海）貿易有限公司；LPE（18:1） 色譜純，上海阿拉丁生化技術有限公司；碘酸鉀 分析純，天津市光復精細化工研究所；濃鹽酸、三氯甲烷 分析純，四川西隴科學有限公司；碘化鉀 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；冰醋酸 色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇 色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；2,4,6-三甲基吡啶（98.0%）上海甄準生物科技有限公司。

UV-9000 紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；LC-2030-C3D 液相色譜 島津企業管理（中國）有限公司；蒸發光檢測器（ELSD） 上海通微分析技術有限公司；TRACE1300-ISQQD 氣相色譜-質譜聯用儀、ZORBAXRX-SIL 色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm） 美國Agilent 公司；TG-5MS 型色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，廣州德祥科技有限公司；50/30 mm DVB/CAR/PDMS Gray 固相微萃取針Supelco 股份有限公司；MR Hei-Tec（CN）磁力攪拌器 海道爾夫儀器設備（上海）有限公司；PTX-FA110S電子天平 美國康州HZ 電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 離體模型構建 采用pH 計檢測新鮮荸薺的pH 為5.36。采用HPLC/ELSD 檢測新鮮荸薺中LPC（18:1）和LPE（18:1）的濃度分別為0.05 和0.18 mg/mL，檢測的色譜條件：正相色譜柱，柱溫25 ℃；流動相為甲醇:水:冰醋酸（100:10:0.1，V/V/V），然后用三乙胺調節pH 為6.00，流速1.0 mL·min-1；ELSD 漂移管溫度35 ℃；空氣流速3.00 L·min-1；進樣量15 μL。以上述檢測結果和荸薺蒸制條件作為構建離體模型的模擬條件。

LPC（18:1）離體模型的構建：稱取一定量的LPC（18:1），用pH5.36 的磷酸緩沖液溶解為0.05 mg/mL溶液，量取2 mL LPC 溶液（1.9×10-7mol）置于20 mL的頂空瓶中，加入1 μL 的0.2 μL/mL 2,4,6-三甲基吡啶作內標，使用蒸鍋和電磁爐進行蒸制，功率為1000 W，蒸制時間為5～40 min，蒸鍋內的水沸騰后加入頂空瓶并計時，蒸制完即得實驗樣品。

LPE（18:1）離體模型的構建：稱取一定量的LPE（18:1），用pH5.36 的磷酸緩沖液溶解為0.18 mg/mL溶液，量取2 mL LPE 溶液（7.5×10-7mol）置于20 mL的頂空瓶中，其它條件與LPC（18:1）離體模型相同。

油酸離體模型的構建：稱取一定量的油酸，用pH5.36 的磷酸緩沖液溶解為0.18 mg/mL，量取2 mL油酸溶液（1.27×10-6mol）置于20 mL 的頂空瓶中，其它條件與LPC（18:1）離體模型相同。

1.2.2 離體模型中醛類物質的檢測 參考李官麗等[1]的方法，采用SPME-GC-MS 檢測離體模型生成的醛類物質。

SPME 條件：取1.2.1 的樣品2 mL，置于恒溫加熱磁力攪拌器水浴加熱，用老化好的固相微萃取針在80 ℃下萃取40 min 后進入GC 解析1 min，每個樣品做3 次平行實驗。

GC 條件：TG-5MS 型色譜柱，進樣口溫度250 ℃；載氣為高純度氦氣，載氣流速1.00 mL/min，分流方式采用不分流；程序升溫為初始溫度45 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 上升到250 ℃，保持3 min。

MS 條件：電離方式為電子轟擊（elector ionization，EI）模式，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描方式為全掃描監測模式，質量掃描范圍30～500 m/z。

定性分析：采用Xcalibar 軟件分析所檢測到的揮發物，并與Library-Mainlib 的標準譜庫相匹配，匹配度大于800 作為鑒定依據。

定量分析：參考程華峰等[25]方法，以2,4,6-三甲基吡啶為內標物，按式（1）計算各揮發物的含量。

式中：V1：揮發物的峰面積；V2：內標物的峰面積；0.184：內標物含量，μg；離體模型的樣品量為2 mL。

1.2.3 離體模型中POV 的檢測 參考張唯等[26]方法，采用紫外分光光度計檢測離體模型的POV。

標準曲線：分別取氯仿:冰醋酸（2:3，V/V）7 mL、飽和碘化鉀溶液0.2 mL、蒸餾水5 mL 加入干燥好的25 mL 具塞的比色管中，再分別加入濃度為100 μg·mL-1的碘標準溶液：0、0.04、0.2、0.36、0.44、0.52 mL，此量相當于每管含有I2：0、4、20、36、44、52 μg，然后加水至刻度，加塞搖勻，靜置5～10 min，待分層后取上層清液2 mL，在4.5 cm 的玻璃比色皿中，以含I2量為0 μg 的樣品作參比，于353 nm 波長處測其吸光度。以吸光度A 為縱坐標，對應的I2含量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線。

樣品測定：取1.2.1 的樣品2 mL 至25 mL 干燥的具塞的比色管，加入5 mL 氯仿-冰醋酸溶液、0.2 mL飽和碘化鉀溶液，輕搖30 s 混勻，置暗處3 min，然后加水至刻度，加塞，混勻，靜置5 min，取上層清液2 mL，在4.5 cm 的玻璃比色皿中以未加樣品作空白，于353 nm 波長處測定吸光度，每個樣品做3 次平行實驗。以標準曲線計算出各個樣品中I2的含量X1，而后按式（2）計算樣品的過氧化值。

式中：X1：樣品中I2含量，μg；樣品量為2 mL。

1.2.4 離體模型中油酸的檢測 參考董建軍等[27]方法，采用SPME-GC-MS 檢測離體模型生成的油酸。

樣品甲酯化和SPME 條件：取1.2.1 制備樣品2.5 mL，加入0.8 g NaCl、30 μL 濃鹽酸、0.6 mL 甲醇，蓋上瓶蓋，輕輕搖晃后置于恒溫加熱磁力攪拌器水浴加熱，用老化好的固相微萃取針在80 ℃下萃取60 min 后進入GC 解析5 min，每個樣品做3 次平行實驗。GC-MS 檢測方法參照1.2.2，其中GC 條件的程序升溫改為：初始溫度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 上升到250 ℃，保持9 min。定性方法參照1.2.2，定量方法采用面積歸一化法計算。

1.3 數據處理

采用SPSS26.0 軟件中的單因素方差分析法（One-Way ANOVA）對試驗數據進行處理與分析，采用Origin 2021、ChemDraw 20.0 軟件繪圖，每個樣品平行試驗3 次。

2 結果和分析

2.1 離體模型中的醛類物質

由表1 可知，LPC（18:1）和LPE（18:1）離體模型生成的醛類物質總含量均隨著蒸制時間的增加而增加，LPC（18:1）離體模型在25 min 時達到最大值，LPE（18:1）離體模型在35 min 時達到最大值，壬醛和癸醛的含量遠遠高于其他醛類物質，相同蒸制時間生成壬醛的量大于癸醛，這與荸薺蒸煮加工產生的醛類風味物質及其變化規律、最佳蒸制時間[28]一致，說明本研究構建的兩個離體模型是科學合理的，LPC（18:1）和LPE（18:1）均是醛類物質的反應底物。

表1 離體模型主要醛類物質含量（ng/mL）Table 1 Contents of main aldehydes in vitro model (ng/mL)

由表1 還可以看出，油酸離體模型在相同的蒸制條件下也可生成壬醛和癸醛等醛類物質，這與LEA[29]、ESTéVEZ 等[30]研究結果一致。壬醛和癸醛均為三個離體模型生成的主要醛類物質，因此本研究以壬醛和癸醛為代表探討LPC（18:1）和LPE（18:1）生成醛類物質的機理。

同一蒸制條件下，LPE（18:1）離體模型生成的醛類物質總量均大于LPC（18:1）離體模型，這是因為LPE（18:1）的濃度大于LPC（18:1）。蒸制5～25 min LPC（18:1）離體模型生成癸醛的含量大于LPE（18:1）離體模型，而蒸制30～40 min LPE（18:1）離體模型生成癸醛的量大于LPC（18:1）離體模型，這可能是兩個離體模型在不同時間生成癸醛的主要機制不同。未開始蒸制時，已有壬醛和癸醛生成，而且LPE（18:1）生成壬醛和癸醛的量大于LPC（18:1），說明LPC（18:1）和LPE（18:1）離體模型在80 ℃固相微萃取時均已發生反應，由于LPE（18:1）的濃度大于LPC（18:1），故LPE（18:1）離體模型的反應速率大于LPC（18:1）離體模型。LPC（18:1）離體模型蒸制25 min 壬醛和癸醛達到最大值，LPE（18:1）離體模型蒸制30 min壬醛達到最大值、35 min 癸醛達到最大值，說明25～35 min 生成壬醛和癸醛的反應速率最大。隨后壬醛和癸醛的含量緩慢下降，這可能是頂空瓶內的壓強隨著蒸制時間的增加而增加，導致頂空瓶內的揮發性物質少量損失。

2.2 離體模型的過氧化值

脂質發生氧化反應生成醛類物質，過氧化值（POV）可衡量脂質發生氧化反應的程度。如圖1 所示，兩個離體模型在蒸制過程中POV 總體呈上升趨勢，在20～35 min 時達到最大值，說明LPC（18:1）和LPE（18:1）離體模型均發生了氧化反應。LPE（18:1）離體模型的POV 大于LPC（18:1）離體模型，這是由于LPE（18:1）的濃度大于LPC（18:1），使LPE（18:1）離體模型氧化反應速率大于LPC（18:1）離體模型，故LPE（18:1）離體模型生成的醛類物質總量大于LPC（18:1）離體模型。未開始蒸制時，兩個離體模型的POV 都大于0，說明LPE（18:1）和LPC（18:1）離體模型在常溫時均已發生了氧化反應生成醛類物質。蒸制20～35 min 時，兩個離體模型的POV 分別達到最大值，說明此時LPC（18:1）離體模型和LPE（18:1）離體模型的氧化反應速率達到最大，生成醛類物質的量最大。隨后兩個離體模型的POV 緩慢下降，說明LPC（18:1）和LPE（18:1）離體模型生成醛類物質的量減少。上述分析結果與2.1 一致。

2.3 離體模型中的油酸

溶血磷脂是磷脂的單?；问?，在水和熱存在的情況下，均可發生水解反應，水解產物為脂肪酸，脂肪酸類型取決于溶血磷脂側鏈所連接的脂肪酸。本研究中所用的LPC（18:1）和LPE（18:1）的不飽和酰基鏈均是油酸，故其水解產物為油酸，而油酸可發生脂質氧化反應生成壬醛和癸醛等醛類風味物質[27]。由圖2 可知，未開始蒸制時兩個離體模型均檢測到油酸，而且LPE（18:1）離體模型中的油酸含量大于LPC（18:1）離體模型，說明兩個離體模型在80 ℃固相微萃取時即發生了水解反應，由于LPE（18:1）的濃度大于LPC（18:1），LPE（18:1）的水解反應速率大于LPC（18:1），故LPE（18:1）離體模型生成的油酸含量大于LPC（18:1）離體模型。LPE（18:1）離體模型中，油酸含量從未開始蒸制時的1.26%上升到40 min時的7.20%，說明LPE（18:1）水解生成油酸的速率大于油酸氧化生成醛類物質的速率。LPC（18:1）離體模型中，油酸含量從未開始蒸制時的0.22%上升到25 min 時的2.45%，隨后開始下降，直至40 min 時的0.48%，說明0～25 min LPC（18:1）水解生成油酸的速率大于油酸氧化生成醛類物質的速率，25～40 min 油酸氧化生成醛類物質的速率大于LPC（18:1）水解生成油酸的速率。

圖2 LPE（18:1）和LPC（18:1）離體模型中油酸含量的變化Fig.2 Changes of oleic acid content in LPE (18:1) and LPC(18:1) in vitro model

2.4 脂質氧化和水解與生成壬醛和癸醛的相關性分析

由表2 可知，壬醛和癸醛與POV 呈正相關（LPC（18:1）離體模型）或顯著正相關（LPE（18:1）離體模型）（P＜0.05），說明氧化反應對壬醛和癸醛生成有影響或顯著影響；壬醛和癸醛與油酸呈顯著正相關（P＜0.05），說明油酸對壬醛和癸醛生成有顯著影響；油酸與POV 呈顯著正相關（P＜0.05），說明油酸發生了氧化反應，對POV 有顯著貢獻。

表2 脂質氧化和水解與生成壬醛和癸醛的相關性分析結果Table 2 Correlation analysis results of lipid oxidation and hydrolysis with nonal and decanal formation

從上述分析可知，壬醛和癸醛可能由LPC（18:1）、LPE（18:1）發生氧化反應生成，也可能由LPC（18:1）、LPE（18:1）發生水解反應生成的油酸再發生氧化反應生成。

2.5 壬醛和癸醛主要形成途徑分析

比較相同物質的量的LPC（18:1）、LPE（18:1）和油酸離體模型系產生壬醛和癸醛的量，可以推測LPC（18:1）和LPE（18:1）離體模型產生壬醛和癸醛的主要途徑。離體模型中，LPC（18:1）和LPE（18:1）的物質的量分別為：1.9×10-7和7.5×10-7mol。假設LPC（18:1）和LPE（18:1）全部水解生成油酸，則兩個離體模型中油酸的物質的量應分別為：1.9×10-7和7.5×10-7mol。根據表1 油酸（1.27×10-6mol）離體模型生成壬醛和癸醛的情況，1.9×10-7和7.5×10-7mol油酸在蒸制過程生成壬醛和癸醛的情況見表3。

表3 與LPC（18:1）和LPE（18:1）相同物質的量的油酸蒸制過程生成壬醛和癸醛的含量（ng/mL）Table 3 Content of nonaldehyde and decanal generated during oleic acid evaporation with the same amount of substances as LPC (18:1) and LPE (18:1) (ng/mL)

比較表1 和表3 可知，LPC（18:1）和LPE（18:1）氧化生成壬醛和癸醛的含量，遠遠高于相同物質的量的油酸氧化生成壬醛和癸醛的含量，其差值結果如表4 所示。實際上，蒸制過程中LPC（18:1）和LPE（18:1）并沒有完全水解生成油酸，LPC（18:1）和LPE（18:1）水解生成的油酸也沒有全部氧化生成壬醛和癸醛，故由LPC（18:1）和LPE（18:1）水解生成的油酸再氧化生成的壬醛和癸醛的含量很少。由此可推測，LPC（18:1）和LPE（18:1）模擬體系中生成壬醛和癸醛的主要途徑是LPC（18:1）和LPE（18:1）的氧化反應。

表4 相同物質的量的LPC(18:1)、LPE(18:1)和油酸模擬體系生成壬醛和癸醛的差值（ng/mL）Table 4 Difference between nonanal and decanal generated by LPC(18:1), LPE (18:1) and oleic acid simulation system with the same amount of substance (ng/mL)

2.6 壬醛和癸醛的可能形成機制分析

基于磷脂自由基鏈式反應原理[31-32]，可推測出溶血磷脂（C18:1）生成壬醛和癸醛的可能氧化機制（圖3）。酯中的多不飽和脂肪酸（PUFA）可以與游離的多不飽和脂肪酸（PUFA）以幾乎相同的方式被氧化[31,33-34]，故溶血磷脂（C18:1）的主要氧化修飾目標為側鏈的油酸鏈。氧化初始步驟是，溶血磷脂中的不飽和?；溕暇o靠雙鍵的C8 和C11 在高溫下表現出低鍵能，極易失去H，形成烷基自由基（R·）。R·會與O2快速反應形成過氧自由基（ROO·），后者從模擬體系中的另一個溶血磷脂分子的不飽和酰基鏈上奪取H 形成溶血磷脂氫過氧化物（ROOH）。ROOH的形成和裂解可分為如下兩種情況：

圖3 溶血磷脂氧化形成醛類物質的機制Fig.3 Mechanism of aldehyde formation by oxidation of lysophospholipids

第1 種情況是R·未經電子重排，直接與O2和其它溶血磷脂分子的H 反應形成8-ROOH 和11-ROOH，如圖3ⅠAB 所示。C 途徑中11-ROOH 生成的醛類物質是辛醛，而兩個模擬體系和荸薺蒸制過程均未檢出辛醛，故可排除此途徑。第二種情況是R·經電子重排，再與O2和其它溶血磷脂分子的H 反應形成9-ROOH 和10-ROOH，如圖3ⅠBD 所示。8-ROOH、9-ROOH 和10-ROOH 等在高溫下均不穩定，其-O-O-易斷裂生成RO·[14]，RO·中的-C-C-鍵可發生β-裂解生成揮發性化合物[11]。如圖3 所示，8-RO·的C8-C9 鍵斷裂生成癸醛，C7-C8 鍵斷裂生成2-十一烯醛（圖3，Ⅱ）；9-RO·的C8-C9 鍵斷裂生成2-癸烯醛，C9-C10 鍵斷裂生成壬醛（圖3，Ⅲ）；10-RO·的C9-C10 鍵斷裂生成壬醛（圖3，Ⅳ）。

從上述分析可知，在蒸制過程（0～40 min）中LPC和LPE 模擬體系中壬醛＞癸醛（表1）的原因是，壬醛的形成途徑有2 條：9-ROOH、10-ROOH 的形成及它們的C9-C10 鍵斷裂（圖3，ⅠBD），而癸醛的形成途徑只有1 條：8-ROOH 的形成及其C8-C9 鍵斷裂（圖3，ⅠA）。蒸制25～35 min 生成壬醛和癸醛的量達到最大值，說明增加蒸制時間可以促進8-ROOH、9-ROOH、10-ROOH 的形成和β-裂解。

3 結論

LPC（18:1）、LPE（18:1）和油酸三個離體模型實驗結果表明，溶血磷脂氧化反應可以在蒸制條件下發生。LPC（18:1）和LPE（18:1）在蒸制中發生氧化反應生成壬醛和癸醛，其形成機制為：首先是不飽和?；溨芯o靠雙鍵的C8 和C11 失去H 形成R·；其次是R·直接與O2和其它分子的H 反應形成8-ROOH，或者發生電子重排形成新的雙鍵生成新的R·后再與O2和其它分子的H 反應形成9-ROOH、10-ROOH；最后氫過氧化物在高溫下裂解生成醛類物質，其中8-ROOH 裂解生成癸醛，9-ROOH 和10-ROOH 裂解均生成壬醛。增加蒸制時間可以促進8-ROOH、9-ROOH、10-ROOH 的形成和裂解，故生成壬醛和癸醛的量隨著蒸制時間的增加而增加。壬醛的生成途徑有2 條，而癸醛的生成途徑只有1 條，故壬醛的含量大于癸醛。以上結論是由模擬荸薺的pH、LPC（18:1）和LPE（18:1）含量及荸薺蒸制加工條件構建的離體模型得到的，可用于解釋荸薺蒸制過程LPC（18:1）和LPE（18:1）形成壬醛和癸醛的機制，調控荸薺蒸制過程的風味品質，為果蔬風味物質形成機制研究和風味品質調控提供科學參考。