海洋細菌Sphingomonas sp. Q2 產瓊膠酶發酵條件優化、酶學性質及降解產物研究

錢洗謙，喬樂克，張洪鋒，江曉路，王 鵬，張京良,,

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.青島海洋生物醫藥研究院，山東青島 266100；3.青島海萊美生物科技有限公司，山東青島 266400；4.中國海洋大學醫藥學院，山東青島 266003）

瓊膠酶是一類可以催化瓊膠降解形成瓊膠寡糖的糖苷水解酶，分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶兩類[1]，α-瓊膠酶作用于瓊脂糖的α-1,3 糖苷鍵，產生以3,6-內醚-α-L-半乳糖為還原端的瓊寡糖（Agarooligosaccharides，AOS）；β-瓊膠酶作用于β-1,4 糖苷鍵，產生以β-D-半乳糖為還原端的新瓊寡糖（Neoagarooligosaccharides，NAOS）[2]。在食品醫藥化工領域瓊膠酶可高效降解瓊膠制備具有抑制淀粉老化[3]、防腐[4]、抗氧化[5]、保濕[6]、美白[7]、抗炎[8]、益生元[9]多種生理活性的瓊膠寡糖。此外，瓊膠酶還可用于分離海藻單細胞和制備海藻原生質體，以及從瓊膠糖中回收DNA 和RNA[10]等。

瓊膠酶產生菌主要來源于海洋環境，目前報道的瓊膠酶產生菌主要包括：假單胞菌屬（Pseudomonas）[11]、弧菌屬（Vibrio）[12]、鏈霉菌屬（Streptomyces）[13]、交替單胞菌屬（Alteromonas）[14]、不動桿菌屬（Acinetobacter）[15]等。由于海洋環境的特殊性，菌株在產瓊膠酶時存在酶活力不高且產酶條件不穩定等問題[10]，限制瓊膠酶開發應用。因此，篩選獲得新型產酶菌株并通過發酵優化改良其產酶能力，對于瓊膠酶研究應用具有重要意義。由于瓊膠降解菌大多是海洋菌，所產瓊膠酶的最適pH 多偏弱堿性且耐熱性較差，不利于高溫下酶促反應的進行。目前對產瓊膠酶菌株的研究多集中在假單胞菌、弧菌等菌株上，而對鞘氨醇桿菌的研究較少且缺乏對其酶學性質及降解產物的研究，限制了鞘氨醇桿菌在產瓊膠酶研究中的進一步應用。

隨著人們對健康生活需求的提升，酶法水解瓊脂得到的瓊膠寡糖需求量不斷增長，其廣泛應用于食品、藥品、保健品中，因此，開發一種產酶能力強且穩定性高的新型瓊膠酶尤為重要。本文從江蘺中篩選獲得一株新型產瓊膠酶鞘氨醇菌株Sphingomonassp. Q2，對Sphingomonassp. Q2 菌株發酵產瓊膠酶的培養基組成進行優化，提高其產酶能力。通過硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠層析技術對Sphingomonassp. Q2 瓊膠酶進行純化，并對其酶學性質及降解產物進行研究，為瓊膠寡糖的高效制備提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鞘氨醇桿菌Sphingomonassp. Q2 本實驗室分離保存；種子培養基（w/v） 瓊脂2 g，氯化銨1 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.0；發酵基礎培養基同種子培養基；瓊脂、NaCl、K2HPO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、十二烷基硫酸鈉等分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

ZWY-2102C 型全溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；CF1524R 型臺式高速冷凍離心機美國賽洛捷克公司；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；UV-6000PC 紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 瓊膠酶活力測定 采用3,5-二硝基水楊酸法測定酶活力[16]。操作步驟如下：用0.05 mol/L、pH7.0的檸檬酸緩沖液配制濃度為0.2%的瓊膠溶液，向1.9 mL 瓊膠溶液中加入0.1 mL 酶液，40 ℃反應30 min，加入2 mL DNS，沸水浴中加熱5 min 顯色，迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL 并搖勻，于520 nm處測定吸光值，用滅活酶液作空白對照。以D-半乳糖繪制標準曲線計算酶活力。

酶活力單位（U）定義為在實驗條件下，每分鐘催化底物產生1 μg 還原糖所需的酶量。發酵液酶活力單位定義為每毫升發酵液含酶活單位（U/mL）。

以Bradford 法[17]測定蛋白含量，采用牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.2.2 發酵培養優化 前期Plackett-Burman 試驗與最陡爬坡實驗結果表明瓊脂、磷酸氫二鉀、氯化鈉對酶活力影響較大（另文發表），因此通過Box-Behnken實驗設計三因素三水平實驗（表1），以瓊脂、磷酸氫二鉀、氯化鈉為影響因素，瓊膠酶活力為響應值，建立響應面回歸模型，確定最優培養基及各組分的交互作用。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平Table 1 Experimental design factors and level of Box-Behnken

1.2.3 瓊膠酶的分離純化

1.2.3.1 硫酸銨分級沉淀 發酵上清液加入硫酸銨至0%～90%飽和度，4 ℃靜置過夜，8000 r/min 冷凍離心20 min，收集沉淀及上清液，測定不同飽和度下的瓊膠酶活力和蛋白質含量，由此確定硫酸銨沉淀的最佳飽和度。

1.2.3.2 QFF 陰離子交換層析 將所得粗酶液進行透析脫鹽并經0.22 μm 濾膜過濾后上樣于QFF 陰離子交換柱，用0～1 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，洗脫液經紫外吸收檢測并進行收集（2 mL/管）。檢測波長為280 nm，測定有紫外吸收峰試管中的洗脫液酶活力。

1.2.3.3 Sephdex G75 凝膠柱層析 將1.2.3.2 中得到的酶液上樣于Sephdex G75 凝膠柱，用pH7.0 Tris-HCl 緩沖液進行洗脫，流速控制為0.2 mL/min，洗脫液經紫外吸收檢測并進行收集（2 mL/管），測定有紫外吸收峰試管中的洗脫液酶活力。

1.2.3.4 SDS-PAGE SDS-PAGE 凝膠電泳由12%的分離膠和8%的濃縮膠組成，蛋白質的染色與脫色均采用常規考馬斯亮藍染色法和脫色技術[18]。

1.2.4 酶學性質

1.2.4.1 酶的最適溫度及溫度穩定性 分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃溫度下測定酶活力，以最高酶活力為100%，考察酶的最適反應溫度。將酶液分別在不同溫度下保溫8 h，測定其對應的剩余酶活力，以未處理的酶活力為100%，考察酶的溫度穩定性。

1.2.4.2 酶的最適pH 及pH 穩定性 分別用50 mmol/L pH 為3.0～5.0 的檸檬酸鹽緩沖液，50 mmol/L pH 為6.0～8.0 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液和50 mmol/L pH 為9.0～10.0 的甘氨酸-NaOH 緩沖液，將酶液分別置于以上不同pH 的底物緩沖液中測定瓊膠酶的活力，以最高酶活為100%，研究酶的最適pH。將酶液在最適pH 下40 ℃放置6 h，測定酶的剩余活力，以未處理的酶活力為100%，研究酶的pH 穩定性。

1.2.4.3 不同金屬離子對酶活力的影響 向酶液中分別加入終濃度為50 mmol/L 的不同金屬離子，室溫下放置1 h，測定剩余酶活力，以未添加金屬離子的酶活力為100%，考察金屬離子對酶活力的影響。

1.2.4.4 動力學參數測定 將酶液與不同濃度的瓊脂作用，測定酶反應的初速度，用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法求出以瓊脂為底物的酶的Km值。

1.2.5 降解產物分析 將純化后的酶液添加到含0.2%瓊脂糖的50 mmol/L 酸鹽緩沖液（pH7），在40 ℃下，反應2 h，沸水浴10 min 終止反應，8000 r/min冷凍離心10 min，收集上清液在安捷倫6460 三重四極質譜儀上進行負離子電噴霧電離質譜（ESI-MS）分析，進樣量10 μL，流動相為乙腈:水（1:1）。用重水處理降解樣品并反復冷凍干燥三次，樣品最終用重水溶解，利用安捷倫DD2-500 光譜儀記錄13C-NMR光譜。

1.3 數據處理

每個實驗設置3 組重復，且實驗數據為3 次平行試驗的平均值。使用Origin 2021 及Expert 8.0.6軟件對實驗數據及圖片進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 發酵培養條件優化

采用Box-Behnken 試驗設計響應面試驗，以瓊膠酶活力為響應值，結果見表2。用Design Expert 8.0.6 軟件對表2 中數據進行多元回歸擬合，得到的回歸方程為Y=1078.94-7.91A+107.85B-68.13C+91.58AB-11.03AC+50.57BC-61.44A2-138.12B2-35.51C2，并對回歸模型進行方差分析，結果見表3。由表3 可知，回歸模型的P＜0.0001，極顯著；失擬項P＞0.05，不顯著，說明模型可靠，決定系數R2=0.9988，校正決定系數R2adj=0.9973，CV%=0.72%。通過方程可以看出瓊膠酶活性與3 個因素呈線性關系，該模型擬合性較好，可以用該模型來分析和預測瓊脂粉、磷酸氫二鉀、氯化鈉對菌株產瓊膠酶活力的影響。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用軟件Design Expert 8.0.6 根據二次回歸方程作出響應面及等高線如圖1 所示。圖中響應面坡度越陡峭表示該因素對菌株產酶活力影響越大。等高線形狀可以直觀反映交互作用的強弱，橢圓形為交互作用顯著，圓形則為不顯著，由圖1 和表3 分析可知，瓊脂和磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀和氯化鈉對酶活力影響的P＜0.0001，說明交互作用極顯著，瓊脂與氯化鈉的P＜0.05，交互作用較顯著。當瓊脂濃度為4 g/L 時，瓊膠酶活力隨著磷酸氫二鉀濃度的增加而升高，當磷酸氫二鉀濃度達到1.30 g/L 時，瓊膠酶活力升高至最優值，隨著兩個變量增加，酶活力呈先上升后下降趨勢，而瓊脂對菌株產酶活力影響較小。

圖1 不同因素交互作用的響應面曲線圖Fig.1 Response surface plots for the cross-interaction of different factors

通過上述二次多項回歸模型，利用軟件Design-Expert 8.0.6 優化培養基組成，獲得最優發酵培養基：瓊脂4.42 g/L、氯化鈉10.51 g/L、磷酸氫二鉀1.30 g/L。此最優發酵培養基中的酶活力預測值為1107.40 U/mL，對上述條件進行驗證實驗，最終得到的瓊膠酶活力為1085.71 U/mL，與預測值接近，說明優化后的回歸方程對預測菌株的產酶活力具有可靠性。與目前已報道的產瓊膠酶海洋細菌多食鞘氨醇桿菌（酶活力18.40 U/mL）[19]和弧菌（酶活力51.60 U/mL）[12]相比，本研究菌株Sphingomonassp.Q2 產瓊膠酶活力較高。

2.2 瓊膠酶的分離純化

2.2.1 硫酸銨沉淀結果 硫酸銨沉淀法可從粗酶液中濃縮和純化蛋白質，且不易使蛋白質變性[1]。不同硫酸銨飽和度下沉淀物及上清液中的相對酶活如圖2 所示。結果顯示，隨著硫酸銨飽和度的增加，沉淀物的酶活逐漸增加。當硫酸銨飽和度為60%時沉淀中的酶活力接近最大值，且上清液中幾乎檢測不到酶活力，故在后續步驟中，選擇飽和度為60%的硫酸銨進行瓊膠酶粗分離。

圖2 不同硫酸銨飽和度對瓊膠酶活力的影響Fig.2 Effects of different ammonium sulfate saturation on agarase activity

2.2.2 柱層析純化 洗脫液紫外吸收及酶活力測定結果如圖3 所示，洗脫梯度為：0～14 min，0% B；14～34 min，0～100% B；34～45 min，100% B。對兩個洗脫峰的酶活力進行測定，結果顯示主要酶活力集中在第二個峰中，因此，收集第二個峰的洗脫液進行透析除鹽并進一步用凝膠層析柱進行純化，結果如圖4所示，在280 nm 條件下檢測到一個峰，經酶活檢測結果表明該峰為活性集中部分，因此，收集洗脫液進行純度和分子量檢測。

圖3 QFF 陰離子交換層析圖Fig.3 Elution profile of agarase on QFF column

圖4 Sephdex G75 凝膠過濾層析圖Fig.4 Elution profile of agarase on Sephadex G75 colmun

2.2.3 瓊膠酶純化結果分析 瓊膠酶的分離純化結果如表4 所示，經硫酸銨沉淀、QFF 陰離子交換層析、Sephdex G75 凝膠柱層析后，瓊膠酶的比活為112048.82 U/mg，純化倍數為7 倍，回收率為48.04%，較李馳等[20]的純化倍數與回收率明顯提高。這是由于在離子交換層析時，蛋白質的分配系數對離子強度非常敏感，本研究在純化過程中通過改變緩沖液的離子強度進行分離純化，損失蛋白較少，并進一步通過排阻層析提高純化倍數。

表4 瓊膠酶分離純化結果Table 4 Summary of isolation and purification procedures of agarase

2.2.4 SDS-PAGE 純度鑒定及相對分子量測定 由圖5 所示，該瓊膠酶在SDS-PAGE 圖譜上呈現單一條帶，表明分離效果較好并且經過以上純化步驟可以得到電泳純酶，該酶分子量為35 kDa，與Li 等[21]的結果相近。

圖5 SDS-PAGE 測定分子量結果Fig.5 Results of molecular weight determination by SDS-PAGE

2.3 瓊膠酶酶學性質研究

2.3.1 瓊膠酶最適溫度及熱穩定性 瓊膠酶的最適溫度及熱穩定性研究結果如圖6 所示，圖6A 中的結果表明瓊膠酶的酶活隨溫度的升高而增加，溫度為40 ℃時酶活最高，當溫度超過40 ℃后，高溫使蛋白變性失活，酶促反應會受到溫度的抑制，酶活力快速下降。因此該酶的最適反應溫度為40 ℃，該酶在60 ℃下酶活下降80%左右，說明該瓊膠酶具有一定耐熱性。將瓊膠酶在20、35 ℃保溫8 h，酶活保持在95%以上；在40 ℃保溫8 h 內，酶活保持在90%以上；而當溫度為45 ℃，酶活在1 h 內降低到20%，證明該酶在20～40 ℃穩定性較好。與金佳等[22]的研究結果相比，本研究的瓊膠酶溫度作用范圍較廣且熱穩定性較好。

圖6 溫度對酶活力的影響Fig.6 Influence of temperature on enzyme activity

2.3.2 瓊膠酶最適pH 及pH 穩定性 由圖7A 可知，瓊膠酶的最適pH 為6.5，且該瓊膠酶在pH5～8范圍內具有較高的酶活力。天然海水的pH 在7.9～8.4之間，而該酶在弱酸性環境下也具有較高的酶活，說明其具有一定的耐酸性。當pH＜5 或pH＞8 時，該瓊膠酶的酶活大大降低，這是由于過低或過高的pH 都會因為影響蛋白質中解離基團的解離狀態而影響酶活，甚至使蛋白質失活。由圖7B 可知，在最適pH環境下，該瓊膠酶6 h 內的酶活維持在90%以上，結果表明該瓊膠酶在弱酸性條件下穩定。

圖7 pH 對酶活力的影響Fig.7 Influence of pH on enzyme activity

2.3.3 不同金屬離子對酶活力影響結果 許多酶需要金屬離子的存在才能發揮其催化功能，金屬離子在酶的催化過程中起到的作用主要有傳遞電子、促進酶與底物的結合、穩定酶的分子的構象等作用。不同金屬離子對瓊膠酶活力影響結果如表5 所示。在50 mmol/L 濃度下，Cu2+、Zn2+、Fe3+、Al3+對瓊膠酶活力具有強烈的抑制作用；Mg2+、Fe2+、Mn2+對瓊膠酶活力也均有不同程度的抑制作用；原因可能在于反應體系中存在這些金屬離子時影響了一些功能基團的親和力，導致酶催化位點的結構發生變化，從而使得酶活降低[23]。而Na+、K+、Ca2+等在海水中含量豐富的離子對該酶的影響均不大，這可能與該菌株來源于海洋環境有關[24]。

表5 金屬離子對瓊膠酶活性的影響Table 5 Effects of metal ions on agarase activity

2.3.4 瓊膠酶動力學參數結果 分別配制濃度為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL 的底物，測定底物反應速率，按照Lineweaver-Burk 方程[25]處理，由圖8 中直線在橫縱軸的截距分別計算出該瓊膠酶的米氏常數為13.84 mg/mL，最大反應速度Vmax為0.54 mg/mL·min。1/Km可以近似地表示酶對底物親和力的大小，1/Km越大，Km越小，則達到酶促反應最大反應速率的一半所需要的底物濃度越小，可以表明酶和底物的親和力越大[26]。與Alkotaini 等[27]報道的Km值16.67 mg/mL相比較而言，該瓊膠酶對瓊脂具有相對較高的親和力以及催化效率。

圖8 Lineweaver-Burk 作圖法繪制米氏方程曲線Fig.8 Lineweaver-Burk double reciprocal plot of Michaelis-Menten equation

2.4 降解產物分析

利用電噴霧質譜技術對降解產物進行驗證，如圖9 所示，測得的離子峰質荷比（m/z）為：665.2[MH]+、971.4[M-H]+，根據降解產物的分子量可推知，該酶的降解產物為四糖和六糖，其中主要產物為四糖。通過13C-NMR 進一步鑒定瓊膠酶的降解產物，如圖10 所示，在90.72 ppm 處未檢測到信號，92 ppm和96 ppm 處檢測到的信號是由還原端的α-和β-異頭碳引起的[28]，在97 ppm 處的信號對應于非還原端3,6-脫水乳糖，這些特征信號表明了該瓊膠酶為β-瓊膠酶。經MS 和13C-NMR 分析，該酶主要降解產物為新瓊四糖。

圖9 瓊脂糖降解產物的質譜檢測結果Fig.9 MS result of the hydrolysis products of purified agarase

圖10 瓊脂糖降解產物的13C-NMR 檢測Fig.10 13C-NMR spectrum of the hydrolysis products of agarase

3 結論

本研究針對自主篩選的Sphingomonassp.Q2 菌株，通過產酶條件優化、鹽析沉淀以及不同形式的柱層析等技術手段，實現電泳純瓊膠酶的分離制備。經純化后的瓊膠酶比活為112048.82 U/mg，純化倍數為7 倍，回收率為48.04%。與現有的研究相比，得到的瓊膠酶比活高且回收率高。通過對酶學性質的考察得到了最佳的反應條件：最適溫度為40 ℃，最適pH 為6.5，其性質符合海洋來源瓊膠酶的基本特征。動力學參數結果表明，該瓊膠酶的米氏常數為13.84 mg/mL，最大反應速度Vmax為0.54 mg/mL·min，具有較高的親和力。通過MS、13C-NMR 證明該酶為β-瓊膠酶，主要降解產物為新瓊四糖，能夠對其結構進行驗證。

通過以上對Sphingomonassp.Q2 菌株所產瓊膠酶的酶學性質及降解產物的研究，充分了解其酶學性質，初步研究結果表明，該瓊膠酶具有較高的酶活且產酶條件穩定，為新瓊寡糖相關產物的制備提供技術基礎，也為瓊膠寡糖功能產品開發提供一種新型酶資源。但本文目前只局限于對野生菌產瓊膠酶的初步探索，隨著研究的深入還需進一步對該瓊膠酶的結構、催化特異性及異源表達等方面進行探索并有望將其廣泛應用到食品工業。