魔芋粗粉制備低聚糖工藝優(yōu)化及產(chǎn)物生理活性分析

張 薇，孫 楠，張鈺瑤，伍小丫，趙 育，張冰倩，張寶善

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710119）

魔芋是天南星科（Araceae）魔芋屬（Amorphophallus）多年生草本植物，具有低熱量、低脂肪、高膳食纖維的營(yíng)養(yǎng)特性。中國(guó)有著豐富的魔芋資源，現(xiàn)代魔芋深加工主要生產(chǎn)魔芋粗粉、魔芋葡甘聚糖、魔芋葡甘低聚糖三類產(chǎn)品。魔芋經(jīng)過(guò)干制、初步粉碎制得的粉末稱為魔芋粗粉[1]，每100 kg 鮮魔芋一般可制得粗粉20～30 kg。魔芋粗粉主要含有50%～60%的魔芋葡甘露聚糖（Konjac glucomannan，KGM）、20%～30%淀粉、5%～10%粗蛋白、2%～5%粗纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。KGM 是一種高分子可溶性膳食纖維，羥基含量豐富，具有很強(qiáng)的溶脹性和凝膠性能，通常難以被胃腸道消化和利用，這導(dǎo)致其生物活性功能大大降低[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，將KGM 制成低分子魔芋葡甘低聚糖（Konjac glucomannan oligosaccharides，KGOS）[4]，其溶解性、流動(dòng)性和口感大大改善，更易被機(jī)體吸收利用，還具有抑制淀粉老化、清除自由基、促進(jìn)腸道益生菌增殖等多重作用[5-6]。

KGM 屬于半纖維素，而纖維素是結(jié)構(gòu)物質(zhì)不能作為能源物質(zhì)，因此在KGM 被分解為寡糖前，無(wú)法直接作為碳源為微生物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)前KGM主要通過(guò)物理和化學(xué)等方法改性，均存在產(chǎn)物分子質(zhì)量范圍難掌控、副產(chǎn)物多和寡糖得率低等問(wèn)題[7]。研究發(fā)現(xiàn)部分特異性微生物生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物分解KGM，也同時(shí)分解其中的淀粉及蛋白質(zhì)，且作用條件溫和、寡糖產(chǎn)率高、成本低廉，能有效提高魔芋粗粉利用率[8]。因此，采用特異性菌株分解KGM是高效、快速制備葡甘寡糖的有效途徑之一。

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種在土壤中廣泛存在的革蘭氏陽(yáng)性嗜熱腐生菌[9]。該菌可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，調(diào)整體內(nèi)菌群失調(diào)，同時(shí)殺滅致病菌，達(dá)到治療目的。長(zhǎng)期以來(lái)，該菌在發(fā)酵工業(yè)方面的應(yīng)用廣泛，常被用于生產(chǎn)堿性蛋白酶、淀粉酶、表面活性劑的生產(chǎn)原料，并且對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒害作用[10]。據(jù)Xan 等[11]研究顯示，芽孢桿菌代謝產(chǎn)物含有葡聚糖酶，因此具有水解KGM 的能力，利用水解物進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，因此魔芋粗粉可直接作為地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。

本論文利用地衣芽孢桿菌水解魔芋粗粉，研究其水解特性和主要產(chǎn)物及其功能性，旨在將魔芋粗粉通過(guò)生物水解作用，制成完全可溶的液態(tài)功能食品材料，以期提升魔芋的加工利用率和食用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮魔芋 使用產(chǎn)自陜西省嵐皋縣花魔芋；地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，CGMCC 1.8791）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，CGMCC 1.12974）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，CGMCC 1.2028）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，CGMCC 1.580） 均購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；胰蛋白胨北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；酵母提取物 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、正丁醇、冰乙酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯胺 上海麥克林生化科技有限公司；β-甘露聚糖酶（10000 U/g） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Autoflex Speed 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、AVANCE NEO600M 核磁共振波（600 Hz）

德國(guó)布魯克公司；Multiskan Go 型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Electron 公司；RVDV-Ⅱ+Pro 型粘度計(jì) 美國(guó)博利飛公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SHP-200B 型搖床 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魔芋粉制備 魔芋粗粉制備方法為[12-13]：將魔芋洗凈、去皮、切片、熱風(fēng)烘干、粉碎，過(guò)80 目篩（取篩下物），獲得魔芋粗粉（不經(jīng)漂白處理），置于干燥器中常溫保存。

1.2.2 魔芋粗粉基礎(chǔ)指標(biāo)測(cè)定 水分：參照GB 5009.3-2016 方法[14]；KGM：參照GB/T 18104-2000方法[15]；粗纖維：參照GB/T 5009.10-2003 方法[16]；蛋白質(zhì)：參照GB 5009.5-2016 方法[17]；粗脂肪：參照GB 5009.6-2016 方法[18]；灰分：參照GB 5009.4-2016方法[19]；pH：參照GB 5009.237-2016 方法[20]；淀粉：參照GB 5009.4-2016 方法[17]。

1.2.3 地衣芽孢桿菌活化 將地衣芽孢桿菌接種于LB 固態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱40 ℃恒溫培養(yǎng)至有明顯褶皺及不規(guī)則邊緣的白色菌落，獲得活化菌株。

1.2.4 菌懸液的制備 將活化的地衣芽孢桿菌接種到含有50 mL LB 液體培養(yǎng)基，在40 ℃、180 r/min的條件培養(yǎng)22 h，將1 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50 mL LB液體培養(yǎng)基，用于制備種子液。將種子液4000 r/min離心10 min，棄上清液，0.9%無(wú)菌生理鹽水（w/v）洗滌兩次，添加無(wú)菌生理鹽水制備細(xì)菌懸浮液，調(diào)整濃度為108CFU/g。

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 還原糖和總糖含量測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定反應(yīng)混合物中的還原糖濃度和總糖濃度，參考Chen[21]的方法并略做修改。

還原糖的測(cè)定：移取1.0 mL 稀釋過(guò)的魔芋粗粉水解液或魔芋粗粉溶液于25 mL 具塞試管中，加入1 mL 蒸餾水，再在每個(gè)具塞試管中加入1.5 mL DNS 顯色液，搖勻后置于沸水浴中5 min，立即冷卻，用蒸餾水定容至刻度，于540 nm 處測(cè)定吸光度。利用測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算溶液中還原糖含量，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，建立回歸方程為：y= 0.4131x+0.0057，決定系數(shù)R2= 0.9982。

總糖的測(cè)定：移取1.0 mL 稀釋過(guò)的魔芋粗粉水解液或魔芋粗粉溶液于25 mL 具塞試管中，準(zhǔn)確加入3 mol/L 硫酸0.5 mL，搖勻后在沸水浴中具塞密封水解1.5 h，取出，冷卻。準(zhǔn)確加入6 mol/L 氫氧化鈉0.5 mL，搖勻；再在每個(gè)具塞試管中加入1.5 mL DNS 顯色液，搖勻后置于沸水浴中5 min，立即冷卻，用蒸餾水定容至刻度，于540 nm 處測(cè)定吸光度。利用測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算溶液中總糖含量。

式中：θ為換算系數(shù)，θ=0.9；T 為待測(cè)溶液用DNS 法測(cè)定在標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的值。

1.2.5.2 水解率和低聚糖產(chǎn)率測(cè)定 通過(guò)測(cè)定水解前KGM 溶液中總糖含量與水解前、后溶液中還原糖含量，得到水解率[22]，即公式（2）。

通過(guò)測(cè)定水解前KGM 溶液中總糖含量與水解后溶液中總糖含量，得到低聚糖產(chǎn)率，即公式（3）。

1.2.6 魔芋粗粉水解工藝單因素實(shí)驗(yàn) 以水解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究各因素對(duì)魔芋粗粉水解的過(guò)程的影響，固定底物濃度20 g/L，接菌量1×107CFU/g，水解溫度43 ℃，水解時(shí)間12 h 進(jìn)行試驗(yàn)。考察不同因素水平分別設(shè)定為底物濃度（10、20、30、40、50 g/L）、接菌量（1×105、1×106、1×107、1×108、1×109CFU/g）、水解溫度（37、40、43、46、49 ℃）和水解時(shí)間（0、2、4、6、8、10、12、14 h）對(duì)水解率的影響，各組試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.7 響應(yīng)曲面（RSM）試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取對(duì)魔芋粗粉水解影響較大的接菌量（A）、水解溫度（B）和水解時(shí)間（C）3 個(gè)實(shí)驗(yàn)因素，以水解率為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化水解魔芋粗粉獲取KGOS 的水解條件，因素水平編碼表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factor level design

1.2.8 水解時(shí)間對(duì)粘度的影響 粘度越大表示溶液內(nèi)分子量越大，因此粘度能直觀地表現(xiàn)魔芋粗粉溶液內(nèi)KGM 分解效果；在生產(chǎn)加工過(guò)程中，常以粘度表示KGM 含量[23]。本試驗(yàn)選用粘度作為KGM 分解效果的一項(xiàng)指標(biāo)。魔芋粗粉濃度為20 g/L、接菌量為1×107CFU/g、水解溫度43 ℃，設(shè)定水解時(shí)間分別為0、2、4、6、8、10 h，測(cè)定水解時(shí)間對(duì)魔芋粗粉溶液粘度的影響[24]。

1.2.9 水解產(chǎn)物的薄層層析（TLC） 在尺寸為20×20 cm 的硅膠玻璃板上對(duì)純化后的KGM 水解產(chǎn)物進(jìn)行TLC 分析，參考張敏[25]的方法并略做修改。取水解時(shí)間分別為0、2、4、6、8、10 h 低聚糖溶液和經(jīng)β-甘露聚糖酶酶解4 h 低聚糖溶液作為樣品液，用移液槍分別吸取各樣品液，在距離玻璃板2.5 cm，間距1.5 cm 分別點(diǎn)樣，點(diǎn)樣直徑小于0.5 cm。使用比例為4:3:4（v:v:v）的正丁醇:水:冰醋酸溶液作為展開(kāi)劑。將1 g 二苯胺、1 g 苯胺和50 mL 三氯乙酸溶解于50 mL 丙酮以制備顯色劑。樣品經(jīng)展開(kāi)劑充分展開(kāi)且晾干，將顯色劑均勻噴灑在硅膠玻璃板上，于105 ℃下加熱15～20 min，觀察斑點(diǎn)并進(jìn)行拍照記錄。以濃度為10 mg/mL 的甘露糖、葡萄糖、麥芽糖和甘露糖三糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液。甘露糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/mL）點(diǎn)樣量為1.5 μL，麥芽糖和甘露糖三糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/mL）點(diǎn)樣量為3 μL，所有樣品在TLC 硅膠板上的點(diǎn)樣量為25 μL。

1.2.10 魔芋粗粉水解液低聚糖的生理活性分析1.2.10.1 OH 自由基清除率測(cè)定 取最優(yōu)工藝條件下魔芋粗粉水解液1 mL，分別加入1 mL 8 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 8 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和1 mL 8 mmol/L H2O2溶液，搖勻于37 ℃放置40 min，510 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)i。對(duì)照組用蒸餾水代替樣液，測(cè)得吸光值A(chǔ)0[26]。空白組用蒸餾水代替FeSO4溶液，測(cè)得吸光值A(chǔ)j，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。OH 自由基清除率計(jì)算方法如公式（4）。

1.2.10.2 O2-自由基清除率測(cè)定 取魔芋粗粉水解液0.25 mL 于2.25 mL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液（pH=8.2），混合均勻，25 ℃放置10 min，加入15 μL 30 mmo1/L 鄰苯三酚溶液，快速混勻于320 nm 處測(cè)定吸光度，5 min 內(nèi)每隔30 s 測(cè)定一次吸光度，求得樣品溶液在320 nm處的鄰苯三酚自氧化速率Ai。用0.25 mL 蒸餾水代替樣液，于320 nm 處測(cè)得鄰苯三酚自氧化速率A0[27]，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。O2-自由基清除率計(jì)算方法如公式（5）。

1.2.10.3 DPPH 自由基清除率的測(cè)定 取魔芋粗粉水解液100 μL，加100 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)得吸光值A(chǔ)0；將100 μL 各樣品液加入到100 μL 95%乙醇，測(cè)得吸光值為Ai；將100 μL DPPH 加入到100 μL 95%乙醇，測(cè)得吸光值為Aj[28]，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算方法如公式（6）。

1.2.10.4 魔芋低聚糖的益生功能評(píng)價(jià) 使用3 株益生菌植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）測(cè)定KGOS 的益生元活性。菌株在MRS 培養(yǎng)基中37 ℃活化12 h，以制備種子溶液。最優(yōu)工藝下得到的魔芋粗粉水解液冷凍干燥48 h，制備KGOS凍干物，4 ℃儲(chǔ)藏，備用。

3 株益生菌分別在最終濃度為1%（w/v）的KGOS、1%（w/v）的魔芋粗粉（陽(yáng)性對(duì)照）和1%（w/v）的葡萄糖（陽(yáng)性對(duì)照）作為唯一碳源的MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌20 min，并在4 ℃放置過(guò)夜補(bǔ)充水分，每10 mL 培養(yǎng)基中注入200 μL菌液，菌株置于37 ℃靜置培養(yǎng)，控制初始變量相同，在24 h 測(cè)定OD600值和pH。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用Excel 軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用SPSS 22.0 和Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋粗粉成分分析

魔芋粗粉主要指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表2。

表2 魔芋粗粉指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of indicators of konjac crude powder

由表2 可得，魔芋粗粉中總糖含量＞70%，其中KGM 含量＞50%，表明粗粉中含有大量的高分子可溶性多糖。

根據(jù)魔芋粗粉指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，可以得到魔芋粗粉含有基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中糖類含量豐富。總體看，魔芋粗粉可為地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)KGM 會(huì)被代謝產(chǎn)物水解為低聚糖。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 底物濃度對(duì)水解率的影響 底物濃度對(duì)水解率的影響如圖1 所示，魔芋粗粉水解率隨底物濃度增大先升高后降低。當(dāng)?shù)孜餄舛仍?0～20 g/L，水解率隨底物濃度增大而升高；底物濃度為20 g/L 水解度達(dá)到最高值38.77%（P＜0.05）。當(dāng)?shù)孜餄舛扔?0 g/L增加至40 g/L 時(shí)，水解率隨底物濃度的增大而降低。這是由于隨著底物濃度升高，酶與底物結(jié)合幾率增加，魔芋粗粉水解率升高；而當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增大時(shí)，魔芋粗粉無(wú)法充分溶脹，溶液粘度大幅增加，阻礙了酶分子與糖分子的結(jié)合[29]，導(dǎo)致魔芋粗粉降解速率緩慢，水解速率降低，低聚糖產(chǎn)量減少。本試驗(yàn)選擇20 g/L 作為水解反應(yīng)的最佳底物濃度。

圖1 底物濃度對(duì)水解率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on hydrolysis rate

2.2.2 接菌量對(duì)水解率的影響 接菌量對(duì)水解率的影響如圖2 所示，魔芋粗粉水解率隨接菌量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)接菌量由1×105CFU/g上升至1×107CFU/g 時(shí)，水解率隨接菌量的增加而升高；當(dāng)接菌量1×107CFU/g，發(fā)現(xiàn)此時(shí)水解度顯著高于其他樣品組（P＜0.05）。而接菌量由1×107CFU/g增加至1×109CFU/g 時(shí)，水解率隨底物濃度的增加而降低。這可能是由于接菌量的增加，菌株大量繁殖，產(chǎn)酶量增多，酶促反應(yīng)速率加快[30]，對(duì)魔芋粗粉的降解速率加快，水解率升高；但當(dāng)接菌量繼續(xù)增加，菌株對(duì)糖的消耗速率高于酶對(duì)糖的降解速率，導(dǎo)致水解率下降[31]。本試驗(yàn)選擇1×107CFU/g 作為水解反應(yīng)的最佳接菌量。

圖2 接菌量對(duì)水解率的影響Fig.2 Effect of inoculation amounts of bacteria on hydrolysis rate

2.2.3 水解溫度對(duì)水解率的影響 水解溫度對(duì)水解率的影響如圖3 所示，魔芋粗粉水解率隨水解溫度增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)水解溫度由37 ℃增高至43 ℃時(shí)，水解率隨溫度增加而升高；當(dāng)溫度為43 ℃時(shí)水解度達(dá)最高值38.77%，相比于其他水解溫度有顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)水解溫度由43 ℃增加至49 ℃，水解率隨溫度增加而降低。這是由于在37～43 ℃內(nèi)，菌株所產(chǎn)生的酶并未處在最適溫度下，其酶活不高。高溫會(huì)增加葡甘露低聚糖的溶解度，降低了黏度，有利于底物與酶的結(jié)合。但隨著溫度繼續(xù)升高，會(huì)促使酶的變性，使酶的活力下降，從而使葡甘露低聚糖得率的降低。本試驗(yàn)選擇43 ℃作為水解反應(yīng)的最佳水解溫度。

圖3 水解溫度對(duì)水解率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis rate

2.2.4 水解時(shí)間對(duì)水解率的影響 水解時(shí)間對(duì)水解率的影響如圖4 所示，水解率隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)水解時(shí)間在0～10 h 時(shí)，水解率呈逐漸上升趨勢(shì)。在0～2 h 水解率上升較慢，是由于前期菌株產(chǎn)酶量較低；在2～8 h 內(nèi)水解率大幅度上升，是由于菌株大量繁殖，產(chǎn)酶量增多，水解率迅速上升；在8～10 h 內(nèi)水解率緩慢上升，是由于菌株大量繁殖，對(duì)底物消耗量增加，酶解效率降低，水解率上升緩慢。在水解時(shí)間為10 h 時(shí)，KGM 的水解率達(dá)到最大，為38.77%（P＜0.05）。當(dāng)水解時(shí)間在10～14 h時(shí)，水解率逐漸降低，本試驗(yàn)選擇10 h 作為水解反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖4 水解時(shí)間對(duì)水解率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis rate

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，降低成本，選擇底物濃度為20 g/L，以接菌量、水解時(shí)間和水解溫度為響應(yīng)面變量，以水解率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken 對(duì)地衣芽孢桿菌水解魔芋粗粉工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表3 和表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface test

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface test

如表4 所示，對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到回歸方程為 Y = 39.14+0.19A+1.02B+0.32C-0.60AB-0.57AC-0.51BC-2.29A2-2.45B2-1.06C2。

由表4 可以看出，該模型方程極顯著（P＜0.0001），各因素中一次項(xiàng)B 和二次項(xiàng)A2、B2模型影響極顯著（P＜0.0001），一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AB、AC、BC，和二次項(xiàng)C2模型影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，三個(gè)因素對(duì)地衣芽孢桿菌水解魔芋粗粉影響大小次序?yàn)锽＞C＞A。失擬項(xiàng)P=0.8511＞0.05，表明該模型相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著；R2=0.9880，表明有98.80%的Y 值變化是因?yàn)樗x擇的因素，說(shuō)明回歸方程數(shù)據(jù)擬合度高，試驗(yàn)誤差小，可以利用該回歸方程確定水解魔芋粗粉的最優(yōu)條件為：接菌量為1×107CFU/g、水解溫度為43.59 ℃、水解時(shí)間為10.20 h。

為驗(yàn)證結(jié)果可靠性，對(duì)最佳水解條件進(jìn)行實(shí)際調(diào)整，在接菌量為1×107CFU/g、水解溫度為43.6 ℃、水解時(shí)間為10.2 h的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得水解率為39.06%，比理論值39.25%僅低0.48%。董振香等[4]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)酶解KGM 的水解率可達(dá)到43.56%，但酶解專一性高，對(duì)魔芋粗粉的水解不具有廣泛性。同時(shí)菌解魔芋粗粉的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。該模型能夠較好預(yù)測(cè)實(shí)際水解率，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到水解魔芋粗粉的最佳參數(shù)準(zhǔn)確可靠，并以此最佳參數(shù)為后續(xù)試驗(yàn)條件。

2.4 水解時(shí)間對(duì)魔芋粗粉溶液粘度的影響

水解時(shí)間對(duì)粘度的影響如圖5 所示，據(jù)鄭梅霞等[32]研究表明KGM 溶膠具有剪切稀化現(xiàn)象，因此在試驗(yàn)過(guò)程中多以3 組以上平行試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖5 水解時(shí)間對(duì)粘度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on viscosity

隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)，粘度呈現(xiàn)出先迅速下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在0～4 h 內(nèi)，粘度降低速率最快；在4 h 時(shí)，溶液粘度由初始粘度2430.33 mPa·s 下降至50.16 mPa·s，水解率為2.73%；在4～10 h 時(shí)，粘度降低速率較慢，并逐漸趨于平穩(wěn)；在10 h 時(shí)，溶液粘度為18.06 mPa·s，水解率為38.77%。粘度變化證明了魔芋粗粉水解液中大分子物質(zhì)能被地衣芽孢桿菌分解，同時(shí)便于試劑生產(chǎn)中對(duì)魔芋的開(kāi)發(fā)利用。

2.5 魔芋粗粉水解產(chǎn)物的TLC 分析

利用地衣芽孢桿菌對(duì)魔芋粗粉進(jìn)行水解，水解產(chǎn)物的TLC 分析如圖6 所示。

圖6 水解產(chǎn)物的薄層色譜分析Fig.6 Analysis of bacterial hydrolysates by thin layer chromatography

如圖6 所示，從顯色情況看，水解時(shí)間在0～2 h，魔芋粗粉含有少量單糖與二糖；水解時(shí)間2～4 h，魔芋粗粉被水解為小分子糖，其中單糖與二糖逐被菌株利用，水解時(shí)間4～10 h，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到10 h，魔芋粗粉糖類被水解為低聚糖，其中大部分由二糖以上不同分子量的低聚糖組成[33-34]。圖中存在的少量拖尾現(xiàn)象是由于部分多糖未水解和魔芋粗粉溶液中其他大分子物質(zhì)未被展開(kāi)，經(jīng)β-甘露聚糖酶處理后，KGM 被分解為一些在二糖和三糖之間的低聚糖產(chǎn)物，未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生單糖。因此，地衣芽孢桿菌可將魔芋粗粉水解為低聚糖。

2.6 魔芋粗粉水解產(chǎn)物的體外抗氧化活性研究

2.6.1 魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)OH 自由基的清除率研究不同濃度的魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)OH 自由基的清除率，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 不同濃度的魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)OH 自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of ·OH by degradation products of konjac crude powder with different concentrations

在所選濃度范圍內(nèi)，隨著魔芋粗粉、魔芋粗粉水解產(chǎn)物濃度的增加，對(duì)OH 自由基的清除率均逐漸增強(qiáng)，并且魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)OH 自由基的清除率明顯優(yōu)于同濃度的魔芋粗粉溶液。當(dāng)魔芋粗粉水解產(chǎn)物濃度為10 mg/mL 時(shí)，對(duì)OH 自由基的清除率達(dá)到最大，為61.47%。KGOS 有顯著的羥基自由基清除能力。試驗(yàn)表明由地衣芽孢桿菌水解魔芋粗粉制得KGOS 對(duì)OH 自由基的抗氧化能力顯著。結(jié)合現(xiàn)有研究，這可能與低聚糖的糖醛酸含量、分子量大小和分支結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)，具體作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究[35]。

2.6.2 魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)O2-自由基的清除率不同濃度的魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)O2-自由基的清除率如圖8 所示。

在所選濃度范圍內(nèi)，隨魔芋粗粉、魔芋粗粉水解產(chǎn)物濃度的增加，對(duì)O2-自由基的清除率均逐漸增強(qiáng)，并且魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)O2-自由基的清除率明顯優(yōu)于同濃度的魔芋粗粉溶液。當(dāng)魔芋粗粉水解產(chǎn)物的濃度為10 mg/mL 時(shí)，對(duì)O2-自由基的清除率達(dá)到最大，為34.60%；同KGOS 溶液對(duì)OH 自由基的清除作用相比，魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)O2-自由基的清除能力較弱，這是由于兩種自由基的結(jié)構(gòu)不同，從而造成差異[36]。

2.6.3 魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基的清除率不同濃度的魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基的清除率如圖9 所示。

圖9 不同濃度的魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)DPPH·的清除率Fig.9 Scavenging rate of DPPH· by degradation products of konjac crude powder with different concentrations

在所選濃度范圍內(nèi)，隨魔芋粗粉、魔芋粗粉水解產(chǎn)物濃度的增加，對(duì)DPPH 自由基的清除率均逐漸增強(qiáng)，并且魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基的清除率明顯優(yōu)于同濃度的魔芋粗粉溶液。當(dāng)魔芋粗粉水解產(chǎn)物的濃度為10 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到最大，為81.43%。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KGOS 對(duì)于DPPH 自由基具有一定的清除作用，且隨著水解率的上升，多糖及其衍生物的抗氧化活性將增強(qiáng)。

2.7 水解魔芋粗粉促進(jìn)益生菌增殖作用

從對(duì)益生菌的影響來(lái)看，乳酸菌屬作為公認(rèn)的有益菌群，可以通過(guò)減少致病菌和提高免疫力來(lái)改善腸道微環(huán)境。但是由于胃酸的影響，使得攝入的乳酸菌活菌無(wú)法充分發(fā)揮功效，而低聚糖可以促進(jìn)乳酸菌增殖。通過(guò)試驗(yàn)研究KGOS 對(duì)于不同乳酸菌的增殖作用，同時(shí)比較KGOS 與魔芋粗粉和葡萄糖對(duì)乳酸菌的增殖效果，結(jié)果如圖10、圖11 所示。

圖10 三種碳源發(fā)酵乳酸菌24 h 的菌種濃度Fig.10 Strain concentration of fermented lactic acid bacteria with three carbon sources for 24 h

圖11 三種碳源發(fā)酵乳酸菌24 h 的pHFig.11 pH of fermented lactic acid bacteria with three carbon sources for 24 h

乳酸菌在魔芋粗粉（A）、葡萄糖（B）、KGOS（C）三種碳源中培養(yǎng)24 h 后，乳酸菌菌株濃度均為B＞C＞A，代謝產(chǎn)物pH 均為A＞C＞B，可以得到KGOS 對(duì)于三種乳酸菌的增殖效果介于魔芋粗粉和葡萄糖之間，表明KGOS 對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，且在相同條件下，促進(jìn)乳酸菌產(chǎn)酸效果優(yōu)于魔芋粗粉。葡萄糖屬單糖，作為直接碳源時(shí)能迅速被菌株利用，菌株生長(zhǎng)效果最好；KGOS 多由小分子寡糖組成，菌株需分解其為單糖后方可利用；魔芋粗粉多為KGM，菌株不含特異性水解酶，無(wú)法分解獲得單糖，只能利用其中少量的淀粉，因此菌株生長(zhǎng)效果最差。根據(jù)機(jī)體消化代謝途徑分析，KGOS 較于KGM 有更加廣泛的益生元活性[37]。在研究中，KGOS 對(duì)乳酸菌的體外增殖作用是可重復(fù)的，這表明由地衣芽孢桿菌水解魔芋粗粉產(chǎn)生的KGOS 與乳酸菌體外增殖存在聯(lián)系。

3 結(jié)論

魔芋水解液與魔芋原漿經(jīng)高溫處理后，魔芋水解液中的生物堿含量顯著低于魔芋原漿，因此熱風(fēng)烘干與菌解能脫除魔芋中的生物堿，同時(shí)菌解沒(méi)有對(duì)魔芋主要成分造成不利影響，對(duì)于魔芋的開(kāi)發(fā)利用具有積極影響[38]。

本研究利用地衣芽孢桿菌水解魔芋粗粉，通過(guò)薄層層析、抗氧化及體外發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)所得KGOS 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和生理活性研究。研究得到的水解魔芋粗粉最優(yōu)條件為：魔芋粗粉20 g/L，接菌量1×107CFU/g，水解溫度43.6 ℃，水解時(shí)間10.2 h，水解率可達(dá)39.06%，KGOS 產(chǎn)率為66.72%。同時(shí)，溶液粘度下降至18.06 mPa·s。隨著KGOS 濃度的增加，魔芋粗粉水解產(chǎn)物對(duì)OH、O2-和DPPH 自由基的清除能力均提高，并對(duì)3 種乳酸菌具有一定的增殖作用。本研究為拓寬魔芋的應(yīng)用范圍提供了科學(xué)依據(jù)，為KGOS的一體化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也為魔芋葡甘低聚糖在食品領(lǐng)域的研究和開(kāi)發(fā)提供理論支持和生產(chǎn)指導(dǎo)。