乳酸菌對(duì)羊乳酸奶體外降血糖和抗氧化功能的影響

張 會(huì)，孫曉琛，夏依旦·買買提，劉小莉，范琳琳，夏秀東，王 英,

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

活性氧自由基過(guò)多會(huì)引起氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激能引起體內(nèi)一系列疾病如心血管疾病，動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等[1]。而由糖尿病引起的健康問(wèn)題已經(jīng)成為全世界關(guān)注的問(wèn)題，2 型糖尿?。═2DM）是一種最常見(jiàn)的胰島素抵抗類型，即由于體內(nèi)胰島素分泌異常而引起的疾病[2]。糖尿病會(huì)引起一系列健康問(wèn)題，對(duì)人體造成嚴(yán)重危害，如增加動(dòng)脈粥樣硬化患病率，腎功能逐漸減退及視網(wǎng)膜血管損傷等問(wèn)題。研究表明乳酸菌具有多種益生功能，其自身及其代謝產(chǎn)物能促進(jìn)機(jī)體消化、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群、增加胰島素敏感性來(lái)改善糖尿病癥狀[3-4]。前人的研究表明利用乳酸菌發(fā)酵食品對(duì)人類健康有著積極影響[5]。

羊奶及其制品在人類的飲食中占有重要地位，因其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和易于消化的動(dòng)物源蛋白而廣受歡迎[6]。與牛奶相比，羊奶含有較低的過(guò)敏源—酪蛋白，且其脂肪顆粒較小，因此更容易被人體胃腸道消化吸收[7-8]。研究表明，羊奶具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種功能活性[9-10]。由于羊奶具有合理的營(yíng)養(yǎng)比例、良好的功能特性及可發(fā)展的商業(yè)價(jià)值，正成為乳制品行業(yè)的新市場(chǎng)。近年來(lái)，有研究人員將羊奶作為發(fā)酵基質(zhì)，采用乳酸菌發(fā)酵，降低羊奶自身膻味，并提高其風(fēng)味口感[11-12]。陳慧[13]研究益生菌發(fā)酵對(duì)羊奶食用品質(zhì)和脂肪酸的影響，表明益生菌能夠協(xié)同嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌降解羊奶脂肪酸，提升發(fā)酵羊奶品質(zhì)。Chen 等[14]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵后的羊酸奶能夠保持高血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性，Sla?anac 等[15]的研究結(jié)果也顯示了羊酸奶能夠減少胃腸道不適。Guo 等[16]利用動(dòng)物雙歧桿菌-M8 發(fā)酵羊奶，提升了發(fā)酵羊奶的感官、理化和功能特性。因此，利用不同的益生菌發(fā)酵羊奶能夠?qū)ρ蚰痰牟煌δ芴匦援a(chǎn)生不同的影響。

本研究以羊奶為原料，用課題組前期篩選的3 株具有體外降血糖功能和抗氧化功能的乳酸菌單菌發(fā)酵羊奶，研究乳酸菌對(duì)羊酸奶體外抗氧化和降血糖活性的影響。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵羊奶的DPPH 自由基清除率、PTIO 自由基清除率及還原活性評(píng)估體外抗氧化功能活性，測(cè)定羊酸奶的α-葡萄糖苷酶活性抑制率和α-淀粉酶活性抑制率評(píng)價(jià)其體外降血糖功能活性。前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單菌發(fā)酵羊奶的凝乳時(shí)間超過(guò)14 h，商業(yè)發(fā)酵菌株保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是酸奶發(fā)酵生產(chǎn)中的常用發(fā)酵劑，聯(lián)合商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵羊奶可以縮短發(fā)酵時(shí)間，因此研究中采用單菌發(fā)酵和聯(lián)合商業(yè)發(fā)酵劑復(fù)合發(fā)酵兩種方式發(fā)酵羊奶。研究結(jié)果將為后續(xù)開(kāi)發(fā)功能性羊酸奶提供可靠菌株資源，同時(shí)為新型功能性發(fā)酵羊奶產(chǎn)品提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊奶粉 南京浩明乳業(yè)有限公司提供；白砂糖購(gòu)于南京蘇果超市；發(fā)酵劑保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，LB）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST） 購(gòu)于微康益生菌（蘇州）股份有限公司；商業(yè)菌株Lactobacillus rhamnosusATCC53103（對(duì)照菌株） 購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心ATCC，被證實(shí)具有抗氧化、降血糖、提高免疫力等多種功能作用；Pediococcus acidilacticiGC215、Lactobacillus brevisPC-2、Liquorilactobacillus maliL31 均來(lái)源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室，具有抑制α-葡萄糖苷酶活性和α-淀粉酶活性的能力，同時(shí)也具有清除DPPH 自由基和PTIO 自由基的能力；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 北京克瑞斯生物技術(shù)有限公司；2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-3-氧代-1-氧（PTIO） 北京華威銳科化工有限公司；α-葡萄糖苷酶（10 units/mg ） 青島百奧百斯特化學(xué)試劑有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 北京華越洋生物科技有限公司。

3K15 型冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Sigma 公司；LRH-150 型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Epoch 酶標(biāo)儀 濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司；DSX-18L-1 型手提式高壓蒸氣滅菌器 上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；SW-CJ-1C 型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-4 型數(shù)字恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；WH-3 型漩渦混合儀 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵劑準(zhǔn)備 將乳酸菌分別以3%接種量接種到MRS 肉湯中，在37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，繼續(xù)培養(yǎng)兩次后于4 ℃，6000 r/min 條件下離心10 min，去除液體培養(yǎng)基，用0.85%無(wú)菌生理鹽水清洗菌體兩次，再用無(wú)菌生理鹽水重懸，將其菌密度調(diào)整為1×108CFU/mL 用作發(fā)酵羊奶的發(fā)酵劑。參照楊敏[17]發(fā)酵羊奶的保加利亞乳桿菌乳桿菌和嗜熱鏈球菌間的比例，選擇添加益生菌的發(fā)酵時(shí)間和純商業(yè)發(fā)酵的凝乳時(shí)間無(wú)顯著差異，同時(shí)考慮益生菌添加比例對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)品的生物活性有顯著影響，綜合比較，混合接種比例按照表1 混合。

表1 混合發(fā)酵組菌株的混合比例Table 1 Mixing ratio of starter in mixed fermentation group

1.2.2 羊酸奶的發(fā)酵工藝 參考陳慧[13]的方法并稍加修改，具體如下：將羊奶粉溶解于溫水中使其乳固形物濃度為14%（w/v），加入6.5%（w/v）的白砂糖，并充分?jǐn)嚢琛Ｔ?1 MPa、60 ℃下進(jìn)行均質(zhì)處理5 min。然后105 ℃、15 min 條件下滅菌處理，待冷卻到常溫條件時(shí)，將發(fā)酵劑以5%的接種量接種到羊奶中，在37 ℃條件下發(fā)酵15 h，并在4 ℃條件冷藏12 h，每種發(fā)酵處理做3 個(gè)重復(fù)。

1.2.3 羊酸奶活菌數(shù)的測(cè)定 根據(jù)GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》中的方法檢測(cè)羊酸奶中活菌數(shù)[18]。

1.2.4 羊酸奶上清液的制備 參考Abdel-hamid 等[19]的方法制備羊酸奶上清液。將樣品在10000 r/min、4 ℃條件下離心30 min。用0.45 μm 濾膜過(guò)濾樣品得到羊酸奶上清液用于后面的實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 羊酸奶抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 按照Singh等[20]描述的方法測(cè)定羊酸奶上清液DPPH 自由基清除能力，稍作修改。將羊酸奶上清液與 0.2 mmol/L的無(wú)水乙醇配制的DPPH 溶液1:1 渦旋混勻，常溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度A0，用無(wú)水乙醇替換上清液溶液，測(cè)定其吸光度記為A1，根據(jù)公式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除能力：

1.2.5.2 PTIO 自由基清除能力的測(cè)定 按照Li等[21]描述的方法測(cè)定羊酸奶上清液對(duì)PTIO 自由基清除能力，稍作修改，具體操作是將羊酸奶上清液與0.1 mg/mL PTIO 溶液1:7 充分混勻，在37 ℃條件下水浴2 h，在557 nm 處測(cè)定吸光度A0，用蒸餾水替換上清液，測(cè)定其吸光度記為A1，根據(jù)公式（2）計(jì)算PTIO 自由基清除能力：

1.2.5.3 還原活性測(cè)定 按照Lin 等[22]的方法測(cè)定酸奶上清液還原活性，稍作修改。取0.5 mL 羊酸奶上清液，加入等體積0.2 mol/L 且pH 為6.6 的PBS緩沖溶液以及0.5 mL 的1%（w/v）鐵氰化鉀溶液，搖勻后在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，置于冰水中冷卻。再加入0.5 mL 的10%（w/v）TCA，4000 r/min 離心5 min，取1 mL 離心后的上清液，加入1 mL 生理鹽水，1 mL 的0.1%（w/v）三氯化鐵溶液，混勻，反應(yīng)10 min 后，測(cè)定700 nm 處其吸光值，結(jié)果采用L-半胱氨酸當(dāng)量（μmol/L）作為標(biāo)準(zhǔn)表示還原活性，L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0034x-0.0228，R2=0.9927。

1.2.6 羊酸奶降血糖活性的測(cè)定

1.2.6.1α-葡萄糖苷酶抑制活性 參考Zhang 等[23]的方法并進(jìn)行修改。將50 μL 的0.1 mol /L PBS 緩沖液（pH 6.8）與1.5 mmol/L 的PNPG 溶液等體積混合，再加入25 μL 羊酸奶上清液，在37 ℃條件下反應(yīng)10 min后加入30 μL 的0.2 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液繼續(xù)在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，最后用50 μL 的0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀405 nm 處測(cè)定吸光值為A，樣品空白組用PBS 緩沖液替換α-葡萄糖苷酶溶液測(cè)其吸光度為B，對(duì)照組用PBS 緩沖液替換樣品測(cè)其吸光度為C，對(duì)照空白組用PBS 緩沖液替換樣品和α-葡萄糖苷酶溶液測(cè)其吸光度為D。根據(jù)公式（3）計(jì)算α-葡萄糖苷酶活性抑制率：

1.2.6.2α-淀粉酶抑制活性 參考龍楚媚等[24]的方法并稍加修改。將0.25 mL 羊酸奶上清液與1 mg/mL的α-淀粉酶溶液以1:1 體積混合，在37 ℃條件下反應(yīng)10 min 后加入0.5 mL 的1.5%的可溶性淀粉溶液，繼續(xù)反應(yīng)5 min，再加入1 mL DNS 顯色劑，在沸水浴中反應(yīng)5 min 后迅速冷卻至室溫，加入8 mL的PBS 緩沖液靜置30 min，在540 nm 處測(cè)定吸光值為A。樣品空白組用PBS 緩沖液替換α-淀粉酶溶液測(cè)其吸光度為B，對(duì)照組用PBS 緩沖液替換樣品測(cè)其吸光度為C，對(duì)照空白組用PBS 緩沖液替換樣品和α-淀粉酶溶液測(cè)其吸光度為D。根據(jù)公式（4）計(jì)算α-淀粉酶活性抑制率：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 和Origin 2021 軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果的差異性用單因素方差分析中的最小顯著差異法檢驗(yàn)，P＜0.05 為有顯著性差異。所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵羊酸奶中活菌數(shù)分析

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，1 mL 酸奶中所含乳酸菌活菌數(shù)不低于1×106CFU/mL，才能保證乳酸菌在人體腸道中發(fā)揮正常作用[25]。表2 反映了發(fā)酵結(jié)束后羊酸奶中所含乳酸菌活菌數(shù)，單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵組的羊酸奶活菌數(shù)超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所需最低活菌數(shù)1×106CFU/mL。ATCC53013 發(fā)酵的羊酸奶15 h 后活菌數(shù)達(dá)到8.44 lg CFU/mL。GC215 和PC-2 發(fā)酵的羊酸奶中的活菌數(shù)分別為8.41 lg CFU/mL 和8.40 lg CFU/mL，相比之下，L31 發(fā)酵后羊奶中所含活菌數(shù)相對(duì)較少，但也達(dá)到8.03 lg CFU/mL，表明4 株乳酸菌在羊奶中均具有良好的生長(zhǎng)性能。這與劉荔等[26]發(fā)酵普通酸羊奶的乳酸菌活菌數(shù)為8.42 lg CFU/mL的結(jié)果相似。本研究混菌發(fā)酵的羊酸奶中，4 株乳酸菌分別與LB: ST 混合發(fā)酵羊酸奶活菌數(shù)最低可達(dá)8.48 lg CFU/mL，與商業(yè)發(fā)酵劑LB: ST 發(fā)酵羊奶的活菌數(shù)相比，均有不同程度的提高。但無(wú)論單菌發(fā)酵還是混合發(fā)酵，不同發(fā)酵組羊酸奶中活菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。本研究結(jié)果表明，功能發(fā)酵菌株與商業(yè)發(fā)酵劑之間存在良好的共培養(yǎng)特性。

表2 單菌發(fā)酵組和混合發(fā)酵組發(fā)酵羊酸奶活菌數(shù)Table 2 The number of viable bacteria in fermented goat yoghurt in single fermentation group and mixed fermentation group

2.2 不同乳酸菌對(duì)發(fā)酵羊酸奶DPPH 自由基清除能力的影響

新陳代謝會(huì)產(chǎn)生自由基，當(dāng)體內(nèi)自由基含量顯著增加時(shí)，會(huì)對(duì)周圍的酶、蛋白質(zhì)和核內(nèi)DNA 造成損害，導(dǎo)致衰老和色素沉著等現(xiàn)象[27]。本研究利用不同乳酸菌發(fā)酵羊奶，探究不同乳酸菌對(duì)羊酸奶的DPPH 自由基清除能力的影響，結(jié)果如圖1 所示。與未發(fā)酵羊奶相比，經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵的羊酸奶對(duì)DPPH自由基清除能力顯著提高（P＜0.05）。GC215、PC-2和L31 單菌發(fā)酵羊酸奶的DPPH 自由基清除能力比混合發(fā)酵羊酸奶的DPPH 自由基清除能力顯著提高（P＜0.05），ATCC53103 單菌發(fā)酵的羊酸奶對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到51.78%±0.54%，顯著低于其與商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵的DPPH 自由基清除率（P＜0.05），GC215、PC-2、L31 單發(fā)酵的羊酸奶顯著高于其與商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵的羊酸奶（P＜0.05），這可能由于3 株功能菌株單發(fā)酵產(chǎn)生清除DPPH 自由基物質(zhì)含量高；單菌發(fā)酵羊奶組相比，GC215、PC-2 和L31 發(fā)酵的羊酸奶對(duì)DPPH 自由基清除能力均顯著高于ATCC53103 組羊酸奶（P＜0.05），其中GC215 組羊酸奶對(duì)DPPH 自由基清除率可達(dá)87.35%±0.08%。研究結(jié)果表明乳酸菌發(fā)酵羊奶之后，可提高其DPPH 自由基清除能力，但不同乳酸菌提高發(fā)酵羊奶的DPPH 自由基清除能力不同。這是因?yàn)檠蚰探?jīng)乳酸菌發(fā)酵后，蛋白分解活性增加，蛋白分解后與自由基反應(yīng)形成了更穩(wěn)定的化合物增加了發(fā)酵乳的抗氧化活性[28]。Eundeok 等[29]用植物乳桿菌NK181 和德氏乳桿菌KU200171 發(fā)酵牛奶的DPPH 自由基清除率顯著增加；Ayyash 等[30]用La.DSM 和Lc.K782分別發(fā)酵駱駝奶和牛乳，發(fā)酵結(jié)束后DPPH 自由基清除能力也顯著增加。本研究也表明利用乳酸菌發(fā)酵羊奶可提高羊酸奶的DPPH 自由基清除率，且不同乳酸菌發(fā)酵羊奶提高DPPH 自由基清除能力不同。

圖1 單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵組發(fā)酵羊酸奶DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of fermented goat yogurt by single bacteria and mixed bacteria fermentation groups

2.3 不同乳酸菌對(duì)發(fā)酵羊酸奶PTIO 自由基清除能力的影響

PTIO 是一種常用的一氧化氮清除劑，這是一種新的抗氧化實(shí)驗(yàn)[21]。目前關(guān)于發(fā)酵乳對(duì)PTIO 自由基清除率報(bào)道尚少。由圖2 可知，與未發(fā)酵羊奶相比，不同乳酸菌發(fā)酵羊酸奶對(duì)PTIO 自由基清除率具有顯著性提高（P＜0.05）。單菌發(fā)酵組中，PC-2 發(fā)酵羊奶的PTIO 自由基清除率顯著高于ATCC53103菌株單獨(dú)發(fā)酵羊奶的清除率（P＜0.05），但PC-2、GC215 和L31 發(fā)酵羊酸奶之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。乳酸菌與商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵組羊酸奶對(duì)PTIO 自由基清除率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但顯著高于商業(yè)發(fā)酵劑組（P＜0.05）。結(jié)果表明，功能菌的添加可以提升羊酸奶對(duì)PTIO 自由基清除能力；整體上單菌發(fā)酵組羊酸奶對(duì)PTIO 自由基清除率比混合發(fā)酵組低。這個(gè)結(jié)果與本研究中不同乳酸菌發(fā)酵羊酸奶對(duì)DPPH 自由基清除能力相反，這是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)分解并釋放出生物多肽對(duì)兩種自由基產(chǎn)生了不同的影響。從整體來(lái)看，未發(fā)酵與發(fā)酵酸奶對(duì)PTIO 自由基清除率較低，這可能是因?yàn)榫哂锌寡趸钚缘纳锘钚远嚯膮^(qū)域的水解度和裂解程度較高，活性多肽對(duì)PTIO 自由基不敏感，無(wú)法具有較高的清除率[31]。

圖2 單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵組發(fā)酵羊酸奶PTIO自由基清除率Fig.2 PTIO free radical scavenging rate of fermented goat yogurt by single bacteria and mixed bacteria fermentation groups

2.4 不同乳酸菌對(duì)發(fā)酵羊酸奶還原活性的影響

酶類和非酶類化合物可以減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生以防止氧化反應(yīng)，這被稱為還原活性，通常以L-半胱氨酸的還原力作為標(biāo)準(zhǔn)衡量物質(zhì)的還原力，本文研究不同乳酸菌發(fā)酵羊酸奶的還原活性，結(jié)果如圖3 所示。由圖可知，羊奶自身具有較高還原活性，相當(dāng)于（158.51±1.50） μmol/L L-半胱氨酸還原當(dāng)量。單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵羊奶均不同程度的提高了羊酸奶還原活性。單菌發(fā)酵組中，GC215 和PC-2 發(fā)酵的羊酸奶還原能力強(qiáng)，分別為（359.17±7.52） μmol/L和（345.41±5.53） μmol/L L-半胱氨酸還原當(dāng)量，分別比未發(fā)酵羊奶提高了2.27 和2.18 倍。與未發(fā)酵羊奶相比，除ATCC53103 單菌發(fā)酵組羊酸奶外，其他發(fā)酵組羊酸奶還原活性均有顯著提高（P＜0.05），增加L-半胱氨酸還原當(dāng)量在25.12～200.66 μmol/L 范圍內(nèi)。單菌發(fā)酵羊奶和混合發(fā)酵羊奶對(duì)羊酸奶還原活性影響趨勢(shì)與清除DPPH 自由基影響趨勢(shì)相同，經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵的羊奶，在發(fā)酵過(guò)程中增加了發(fā)酵酸奶的蛋白質(zhì)的水解度，導(dǎo)致了小分子肽物質(zhì)的形成，這有助于促進(jìn)還原過(guò)程中的氫的傳遞作用。此外，乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生具有功能特性的代謝物質(zhì)，如多糖、有機(jī)酸等，從而可能增加了發(fā)酵羊酸奶的還原活性。乳酸菌自身的抗氧化活性與發(fā)酵過(guò)程中代謝物質(zhì)所產(chǎn)生的活性物質(zhì)協(xié)同增強(qiáng)了乳酸菌發(fā)酵酸奶的抗氧化活性[32]。

圖3 單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵組發(fā)酵羊酸奶的還原活性Fig.3 Reductive activity of goat yogurt fermented by single bacteria and mixed bacteria fermentation groups

本研究根據(jù)DPPH 自由基清除率、PTIO 自由基清除率和還原活性3 個(gè)抗氧化性指標(biāo)的測(cè)定評(píng)估不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)羊酸奶體外抗氧化活性的影響，從整體結(jié)果來(lái)看，與未發(fā)酵羊奶相比，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，其體外抗氧化活性有顯著提高（P＜0.05）；與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵羊奶相比，添加功能性益生乳酸菌，其體外抗氧化活性也有顯著提升（P＜0.05）。從DPPH 自由基清除率和還原活性結(jié)果可以看出，GC215 和PC-2 單菌發(fā)酵羊奶的抗氧化活性最高；PTIO 自由基清除率結(jié)果表明，GC215、PC-2 和L31 發(fā)酵羊奶的抗氧化活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這是由于DPPH 自由基清除、PTIO 自由基清除和還原活性的物質(zhì)基礎(chǔ)不同所導(dǎo)致，但羊酸奶中具體的物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步研究。

2.5 不同乳酸菌對(duì)發(fā)酵羊酸奶α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

糖尿病與人體血糖水平有關(guān)，血糖水平與葡萄糖代謝調(diào)控緊密相關(guān)。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是藥物改善葡萄糖代謝的關(guān)鍵靶點(diǎn)[33]。抑制此兩種酶會(huì)減緩腸道中多糖和淀粉的分解，從而降低小腸對(duì)葡萄糖的吸收速度，有助于控制的餐后血糖[34]。不同乳酸菌對(duì)發(fā)酵羊酸奶α-葡萄糖苷酶抑制結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，發(fā)酵羊酸奶的α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著提高（P＜0.05），不同菌株之間和不同發(fā)酵方式的羊酸奶的α-葡萄糖苷酶抑制活性表現(xiàn)出不同程度的差異。單菌發(fā)酵羊奶的α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著高于混菌發(fā)酵（P＜0.05）。單菌發(fā)酵羊奶結(jié)果顯示，L31 發(fā)酵的羊酸奶抑制α-葡萄糖苷酶活性最高，抑制率為45.14%±1.61%。GC215 和PC-2 單菌發(fā)酵羊奶的抑制α-葡萄糖苷酶活性之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），ATCC53103 發(fā)酵的羊酸奶對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性為6.91%±0.43%，這可能是由于菌株不同，代謝途徑不同，生成產(chǎn)物不同所致。乳酸菌發(fā)酵分為同型乳酸發(fā)酵、異型乳酸發(fā)酵和雙歧桿菌發(fā)酵[35]，三種發(fā)酵類型產(chǎn)生的代謝物質(zhì)并不完全相同，含量也不同。Ayyash 等[30]的研究中用LC.K782 和La.DSM 發(fā)酵的駱駝奶和牛奶，LC.K782 發(fā)酵的兩種乳α-葡萄糖苷酶抑制率在30.00%～40.00%之間，La.DSM 發(fā)酵的駱駝奶中α-葡萄糖苷酶的抑制率均小于30%。本研究中，不同乳酸菌對(duì)發(fā)酵羊奶的α-葡萄糖苷酶抑制率提高程度不同，說(shuō)明不同功能菌株發(fā)酵對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的體外的降血糖活性影響不同。

圖4 單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵組發(fā)酵羊酸奶α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.4 Inhibitory activity of α-glucosidase in goat yogurt fermented by single bacteria and mixed bacteria fermentation groups

2.6 不同乳酸菌對(duì)發(fā)酵羊酸奶α-淀粉酶抑制活性的影響

不同乳酸菌發(fā)酵羊酸奶的α-淀粉酶活性抑制結(jié)果如圖5 所示。由圖可知，與純羊奶相比，乳酸菌發(fā)酵可以提高羊奶對(duì)α-淀粉酶活性抑制率。與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵羊酸奶相比，功能益生菌單菌發(fā)酵和添加功能乳酸菌的混菌發(fā)酵羊奶的α-淀粉酶活性抑制率均顯著提高（P＜0.05），α-淀粉酶活性抑制率在58.80%～82.30%；與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵羊酸奶的α-淀粉酶活性抑制率相比，添加功能性益生菌GC215、PC-2 和L31的羊酸奶的酶活抑制率顯著提高（P＜0.05），其中GC215 和PC-2 與商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵羊酸奶對(duì)α-淀粉酶活性抑制效果最高，分別達(dá)到78.22%和82.3%，兩者之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。對(duì)照菌株ATCC53103 單菌發(fā)酵羊酸奶和混合發(fā)酵羊酸奶對(duì)α-淀粉酶活性抑制率也顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明對(duì)照菌株ATCC53103 與功能菌株GC215、PC-2 以及L31 與商業(yè)發(fā)酵劑之間存在協(xié)同增效作用。

圖5 單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵組發(fā)酵羊酸奶對(duì)α-淀粉酶抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of α-amylase in goat yogurt fermented by single bacteria and mixed bacteria fermentation groups

目前，關(guān)于降血糖酸奶主要通過(guò)添加一些輔料提高酸奶降血糖效果，生物堿和水溶性膳食纖維等功能活性物質(zhì)[36]。肖凱等[37]通過(guò)向發(fā)酵乳加入蛋白桑和黃秋葵研制的酸奶對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力較強(qiáng)，其抑制率可達(dá)70%左右。Shori 等[38]向酸奶中添加大蒜輔料可有效提高酸奶對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制率。本文用具有降血糖功能的乳酸菌發(fā)酵羊奶，在發(fā)酵結(jié)束后，提高了羊酸奶的體外降血糖功能。因此，在提高羊酸奶的體外降血糖功能也可通過(guò)不同功能乳酸菌進(jìn)行混合發(fā)酵提高酸奶的降血糖功能活性。這可能在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了能降低血糖物質(zhì)，如有機(jī)酸、酶系等，提高了羊酸奶對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制，但具體哪些物質(zhì)起到關(guān)鍵作用，還需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

以3 株具有降血糖、抗氧化功能的乳酸菌和酸奶商業(yè)發(fā)酵劑株LB 和ST 為發(fā)酵菌株，采用功能菌株單菌發(fā)酵和聯(lián)合商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵兩種方式發(fā)酵羊奶，研究不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)羊酸奶體外抗氧化和降血糖功能活性的影響。體外抗氧化結(jié)果表明，單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵羊酸奶都提高了發(fā)酵酸奶的體外抗氧化功能，但不同菌株發(fā)酵羊酸奶在同一抗氧化指標(biāo)不一定都具有顯著性差異。3 株乳酸菌單菌發(fā)酵羊奶對(duì)DPPH 自由基清除能力及還原活性均比單菌與商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵羊酸奶高，但對(duì)于PTIO 自由基清除能力，3 株乳酸菌單菌發(fā)酵羊酸奶均比混合發(fā)酵羊酸奶低。降血糖結(jié)果表明，3 株乳酸菌單菌發(fā)酵羊酸奶的α-葡萄糖苷酶抑制率均比對(duì)應(yīng)的混合發(fā)酵羊酸奶α-葡萄糖苷酶抑制率顯著提高，但對(duì)α-淀粉酶活性抑制率結(jié)果呈相反趨勢(shì)。整體結(jié)果表明添加功能菌株發(fā)酵能提升羊酸奶體外抗氧化和降血糖功能，但具有菌株特異性。本研究結(jié)果可為功能性發(fā)酵羊奶提供可靠的菌株資源，同時(shí)為新功能性羊酸奶開(kāi)發(fā)提供新思路。