苯乳酸對(duì)單增李斯特菌生物被膜的影響

姜聰一，康 瑞，于 濤，姜曉冰,

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種重要的食源性致病菌，在自然界中廣泛存在。該菌能夠引起人畜共患病——李斯特菌病，典型的臨床癥狀表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等[1]。李斯特菌病的發(fā)病率不高，但是致死率可高達(dá)33%，嚴(yán)重威脅人類身體健康[2]。大量研究表明，食用被Lm 污染的食品是造成李斯特菌病散發(fā)和爆發(fā)流行的主要原因[3]。Lm 可粘附在食品接觸表面形成生物被膜，被膜態(tài)的Lm 能夠在食品加工環(huán)境中存活數(shù)月乃至數(shù)年之久[4]。被膜態(tài)Lm 分泌的胞外聚合物主要由胞外多糖、胞外蛋白和胞外DNA 組成，這些胞外物質(zhì)可形成物理屏障，阻礙抗菌藥物向被膜內(nèi)擴(kuò)散，提高Lm 在不利環(huán)境中的存活能力[5-6]。Lm 生物被膜是一種潛在的污染源，可能引起食品交叉污染和加工后污染，威脅食品安全[7]。因此，尋找能夠有效抑制Lm 及其生物被膜的抗菌物質(zhì)對(duì)預(yù)防和控制Lm 引起的食源性疾病顯得尤為重要。

苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA）廣泛存在于許多植物和食品中，如雪蓮、天麻、蜂蜜、乳酸菌發(fā)酵食品等[8-9]。PLA 抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌均表現(xiàn)出良好的抗菌活性[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)PLA 作用后細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，胞內(nèi)成分泄漏，表明細(xì)胞壁可能是PLA 的作用靶點(diǎn)之一。PLA 還能通過(guò)與細(xì)菌基因組DNA 結(jié)合阻止DNA復(fù)制從而干擾細(xì)胞正常功能[13-15]。PLA 具有水溶性好、理化性質(zhì)穩(wěn)定、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[16-17]。

目前的研究主要集中在PLA 對(duì)浮游態(tài)細(xì)菌的抑菌活性和抑菌機(jī)制方面[8,13-15]，而關(guān)于PLA 對(duì)細(xì)菌生物被膜抑制效果的研究相對(duì)較少。本文主要研究PLA 對(duì)Lm 生物被膜形成的抑制及成熟生物被膜的清除效果，通過(guò)檢測(cè)生物被膜胞外聚合物的含量、Lm 運(yùn)動(dòng)性以及生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平初步探究PLA 對(duì)Lm 生物被膜的作用機(jī)制，為PLA 在控制Lm 及其生物被膜方面的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Lm 標(biāo)準(zhǔn)菌株EGD-e 和10403S 由華中師范大學(xué)羅勤教授惠贈(zèng)，Lm 食品分離株L1、L44、L46、L60、L69 和L82 由本實(shí)驗(yàn)室保存，菌株信息見(jiàn)表1；腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI） OXOID；PALCAM 瓊脂 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；草酸銨 山東豪順化工有限公司；結(jié)晶紫 天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇 天津富宇精化工有限公司；戊二醛 上海麥克林生化科技有限公司；叔丁醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酚 濟(jì)南鑫沃化學(xué)有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth，TSB） 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；福林酚 北京索萊寶科技有限公司；小牛胸腺DNA上海麥克林生化科技有限公司；RealMaster Mix（SYBR Green）試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌RNA 提取試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR 試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

表1 菌株信息Table 1 Strain information

JSM-6390LV 場(chǎng)發(fā)射掃描式電子顯微鏡（Field Emission Scanning Electron Microscopy，F(xiàn)E-SEM）日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司；DMi1 倒置顯微鏡 Leica 公司；LightCycle96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀ABI 公司；Synergy H1 酶標(biāo)儀 美國(guó)安捷倫Bio Tek 公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZQ-X300C 恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LHS-800C 生化恒溫培養(yǎng)箱 上海力辰儀器科技有限公司；JIDI-20R 冷凍離心機(jī)廣州吉迪儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）的測(cè)定 采用瓊脂稀釋法檢測(cè)PLA 對(duì)Lm 菌株的MIC 值[18]。以無(wú)菌去離子水為溶劑配制為20 mg/mL 的PLA 母液。配制含有不同濃度PLA（終濃度分別為0、2、4、6 和8 mg/mL）的BHI 平板，取1 μL（稀釋比例為1:5）稀釋后的菌液接種至BHI平板，37 ℃培養(yǎng)2 d。

1.2.2 PLA 對(duì)Lm 生物被膜形成的影響

1.2.2.1 結(jié)晶紫法 采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定PLA 對(duì)8 株菌生物被膜形成的影響[19]。挑取單個(gè)菌落接種于BHI 液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)物按1%的比例加入培養(yǎng)基中，然后加入PLA（終濃度分別為1/10MIC、1/8MIC 和1/4MIC，不添加PLA 作為對(duì)照），37 ℃分別孵育1、2、3 d。孵育結(jié)束后，用無(wú)菌PBS 洗滌3 次以去除浮游細(xì)菌。生物被膜經(jīng)草酸銨結(jié)晶紫染色和95%的乙醇脫色后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD595nm，并置于倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.2.2.2 FE-SEM 觀察Lm 生物被膜 本研究選擇菌株10403S 進(jìn)行FE-SEM 觀察生物被膜結(jié)構(gòu)及生物被膜胞外多聚物含量檢測(cè)的研究。在微孔板中培養(yǎng)菌株10403S 生物被膜2 d 后，小心去除孔中的液體，使用無(wú)菌的PBS 緩沖液沖洗3 遍。在每個(gè)孔中加入4%戊二醛，充分混勻后4 ℃靜置9 h，再用PBS 緩沖液洗滌3 次。乙醇依次以30%、50%、70%、85%、90%和100%的梯度脫水3 次，每次脫水10 min。晾干后用100%叔丁醇置換100%乙醇3 次，每次10 min。將菌體干燥后利用離子噴濺射鍍膜儀在樣品表面鍍100-120 A 的金膜，放置觀察室中進(jìn)行觀察[20]。

1.2.2.3 PLA 對(duì)Lm 生物被膜胞外多聚物形成的影響 根據(jù)Dai 等[21]的方法提取菌株10403S 生物被膜胞外多聚物。分別采用苯酚硫酸法[22]、福林酚法[23]和二苯胺法[24]測(cè)定胞外多聚物中胞外多糖、胞外蛋白和胞外DNA 的含量。葡萄糖、蛋白質(zhì)和DNA 的標(biāo)曲方程及相關(guān)系數(shù)分別為y=11.65x+0.0698（R2=0.9984），y=29.229x+0.0441（R2=0.9966），y=0.004+0.0291（R2=0.9902）。

1923年7月，蔡元培偕夫人周養(yǎng)浩(1892—1975)和子女再度赴歐洲學(xué)習(xí)考察，先居住于比利時(shí)布魯塞爾，次年1月移居法國(guó)。1924年8月，蔡元培自法國(guó)赴荷蘭、瑞典參加一個(gè)關(guān)于哥倫布未發(fā)現(xiàn)新大陸之前美國(guó)民族問(wèn)題的國(guó)際民族學(xué)會(huì)議，巧遇但采爾。此時(shí)，但采爾已從萊比錫大學(xué)博士畢業(yè)，在漢堡大學(xué)做教授。

1.2.3 PLA 對(duì)Lm 成熟生物被膜的影響

1.2.3.1 結(jié)晶紫法 根據(jù)Zhou 等[25]的方法制備成熟生物被膜。將8 株Lm 接種到BHI 培養(yǎng)基中，在96 孔板中培養(yǎng)2 d 以形成成熟的生物被膜，用無(wú)菌PBS 沖洗生物被膜，然后分別添加不同濃度的PLA（0、1/2MIC、MIC、2MIC），孵育1 h，用PBS 洗滌后用草酸銨結(jié)晶紫染色和95%的乙醇脫色后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD595nm，并置于倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.2.3.2 FE-SEM 觀察生物被膜 將菌株10403S 生物被膜培養(yǎng)2 d 后分別添加0、1/2MIC、MIC、2MIC的PLA，孵育1 h 后用無(wú)菌PBS 洗3 遍，然后加入4%戊二醛固定，后續(xù)方法同1.2.2.2。

1.2.3.3 PLA 對(duì)Lm 成熟生物被膜胞外多聚物的影響 將菌株10403S 生物被膜培養(yǎng)2 d 后分別添加0、1/2MIC、MIC、2MIC 的PLA，孵育1 h，后續(xù)按照1.2.2.3 的方法測(cè)定胞外多聚物含量。

1.2.4 PLA 對(duì)Lm 運(yùn)動(dòng)性的影響 含有0.3%瓊脂的TSB 平板用于游泳運(yùn)動(dòng)性的檢測(cè)，含有0.5%瓊脂的TSB 平板用于群集運(yùn)動(dòng)性的檢測(cè)[26]。在TSB平板中加入不同濃度的PLA（1/10MIC、1/8MIC、1/4MIC）以調(diào)查PLA 對(duì)Lm 菌株10403S 運(yùn)動(dòng)性的影響。取1 μL 菌液點(diǎn)接至培養(yǎng)皿中心，25 ℃培養(yǎng)2 d。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌圈直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.5 PLA 對(duì)Lm 生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 將菌株10403S 菌液（OD600nm約為0.2）分為兩組，一組不加任何藥物作為對(duì)照組，另一組加入3 mg/mL的PLA 作為實(shí)驗(yàn)組，繼續(xù)培養(yǎng)30 min。按照細(xì)菌RNA 提取試劑盒的使用說(shuō)明提取細(xì)菌總RNA，利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度和純度。將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 作為模板，使用RealMaster Mix（SYBR Green）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。以16S rRNA 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平的分析。目的基因在實(shí)驗(yàn)組中的轉(zhuǎn)錄水平與其在對(duì)照組中的轉(zhuǎn)錄水平的比值即為該基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。所需引物參考文獻(xiàn)[27]設(shè)計(jì)，如表2 所示。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均設(shè)置3 個(gè)平行，處理后的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用GraphPad Prism8 軟件對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙尾t檢驗(yàn)分析（與對(duì)照組相比，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001）。PLA對(duì)Lm 生物被膜的抑制率和清除率、胞外多聚物的抑制率和清除率及運(yùn)動(dòng)性的抑制率計(jì)算公式如下：

式中A0：未經(jīng)PLA 處理組；A1：PLA 處理組。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLA 對(duì)Lm 生物被膜形成的抑制

測(cè)得PLA 對(duì)所有受試菌株的MIC 值均為6 mg/mL。如圖1 所示：8 株Lm 菌株均能在實(shí)驗(yàn)條件下形成生物被膜，但不同菌株的被膜形成能力存在差異，這可能是由于菌株自身特性不同造成的。在亞抑制濃度（低于MIC 的藥物濃度）PLA 的作用下，8 株Lm 形成生物被膜的能力受到不同程度的抑制。其中，菌株10403S 為L(zhǎng)m 標(biāo)準(zhǔn)菌株，具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力，且PLA 對(duì)其生物被膜的抑制效果較好，因此選擇菌株10403S 進(jìn)行后續(xù)的FESEM 觀察生物被膜結(jié)構(gòu)及胞外多聚物含量檢測(cè)。當(dāng)培養(yǎng)2 d 時(shí)，1/10 MIC、1/8MIC 和1/4MIC 的PLA對(duì)菌株10403S 生物被膜的抑制率分別為45.07%、64.12%和70.32%。結(jié)果表明，亞抑制濃度PLA 呈濃度依賴性抑制Lm 生物被膜的形成。

圖1 PLA 對(duì)Lm 菌株生物被膜形成能力的影響Fig.1 Effects of PLA on the ability to form biofilms of L. monocytogenes strains

利用倒置顯微鏡觀察不同濃度PLA 對(duì)Lm 菌株10403S 生物被膜形態(tài)的影響。經(jīng)過(guò)2 d 的培養(yǎng)，對(duì)照組形成均勻且致密的生物被膜，見(jiàn)圖2a。加入PLA 后，菌株形成的生物被膜變得疏松，見(jiàn)圖2b～圖2d。由FE-SEM 結(jié)果可知，未經(jīng)PLA 處理的菌株10403S 菌株細(xì)胞形態(tài)完好，大量細(xì)胞聚集成團(tuán)，豐富的胞外聚合物將細(xì)菌包裹起來(lái)，見(jiàn)圖2e。經(jīng)1/10MIC 和1/8MIC 的PLA 處理后，粘附的細(xì)胞減少，胞外多聚物也減少，見(jiàn)圖2f～圖2g。經(jīng)1/4MIC的PLA 處理后，粘附的細(xì)胞進(jìn)一步減少，同時(shí)能觀察到破損的細(xì)胞，見(jiàn)圖2h。這可能是由于生物被膜中的細(xì)胞失去胞外聚合物的保護(hù)后直接受到PLA 的作用，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞、細(xì)胞壁破裂。

圖2 倒置顯微鏡和掃描電鏡下的Lm 菌株10403S 生物被膜Fig.2 Biofilm of strain L. monocytogenes 10403S under inverted microscope and scanning electron microscope

由圖3 可知，經(jīng)1/10 MIC、1/8MIC 和1/4MIC 的PLA 處理后，生物被膜中胞外多糖的含量顯著降低（P＜0.05）。胞外蛋白僅1/4MIC 組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而胞外DNA 的含量在1/8MIC 和1/4MIC兩個(gè)濃度下均與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖3 PLA 對(duì)生物被膜中胞外多糖（a）、胞外蛋白（b）和胞外DNA（c）含量的影響Fig.3 Effects of PLA on the content of extracellular polysaccharides (a), extracellular proteins (b) and extracellular DNA (c) in biofilms

胞外聚合物主要由胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)和胞外DNA 組成，是生物被膜的重要組成部分，在生物被膜中起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和保護(hù)的作用[28]。胞外聚合物的成分和比例在不同種細(xì)菌中存在很大差異。大多數(shù)細(xì)菌生物被膜的胞外聚合物中占比最高的是胞外多糖[29]。而在Lm 生物被膜的胞外聚合物中胞外蛋白的含量最高，其次是胞外DNA 和胞外多糖[6]。研究表明，胞外蛋白和胞外DNA 在Lm 的初始粘附和生物被膜形成的早期階段發(fā)揮重要作用[30]。本研究中，亞抑菌濃度PLA 能夠抑制Lm 生物被膜的形成，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Lm 生物被膜中胞外多糖和胞外蛋白含量降低。以上證據(jù)表明，亞抑制濃度的 PLA 可以通過(guò)減少胞外多糖和細(xì)胞外蛋白的分泌來(lái)抑制Lm 生物被膜的形成。

2.2 PLA 對(duì)Lm 成熟生物被膜的清除

由圖4 可知，Lm 成熟生物被膜經(jīng)1/2MIC、MIC和2MIC 的PLA 處理后，生物被膜量均減少，其中菌株10403S 和L1 的生物被膜量顯著減少（P＜0.05）。1/2 MIC、MIC 和2MIC 的PLA 對(duì)菌株10403S 生物被膜的清除率分別為24.03%、39.56%和61.32%。相同的作用時(shí)間，PLA 的濃度越高，菌株的生物被膜越少，即PLA 對(duì)Lm 菌株生物被膜的清除作用呈濃度依賴性。

圖4 PLA 對(duì)Lm 成熟生物被膜的影響Fig.4 Effects of PLA on the mature biofilms of L. monocytogenes

倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照相比（圖5a），PLA 處理組的生物被膜更加疏松（圖5b～圖5d）。FE-SEM 結(jié)果顯示，PLA 處理后，Lm 粘附細(xì)胞變少，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮和塌陷，當(dāng)PLA 濃度為2MIC 時(shí)，這種變化更加明顯，甚至能夠觀察到細(xì)胞內(nèi)容物的外泄（圖5f～圖5g）。

圖5 倒置顯微鏡和掃描電鏡下的Lm 菌株10403S 成熟生物被膜Fig.5 Mature biofilm of strain L. monocytogenes 10403S under inverted microscope and scanning electron microscope

如圖6 所示，經(jīng)MIC 和2MIC 的PLA 處理后，成熟生物被膜中胞外多糖的含量顯著降低，分別降低了81.6%和95.3%（P＜0.05）。與對(duì)照相比，PLA 作用下成熟生物被膜中胞外蛋白的含量明顯降低。PLA 處理對(duì)成熟生物被膜中胞外DNA 的含量沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響（P＞0.05）。

圖6 PLA 對(duì)成熟生物被膜中胞外多糖（a）、胞外蛋白（b）和胞外DNA（c）含量的影響Fig.6 Effects of PLA on the content of extracellular polysaccharides (a), extracellular proteins (b) and extracellular DNA (c) in mature biofilms

成熟生物被膜對(duì)抗菌物質(zhì)的抵抗力很強(qiáng)，難以清除。本研究結(jié)果顯示Lm 成熟生物被膜經(jīng)PLA 處理后生物被膜生物量降低，表明PLA 對(duì)Lm 成熟生物被膜具有清除作用。PLA 處理后，Lm 生物被膜中胞外多糖的含量急劇下降。當(dāng)PLA 的濃度為1/2MIC時(shí)，胞外多糖含量減少超過(guò)一半；當(dāng)PLA 的濃度為2MIC 時(shí)，幾乎所有的胞外多糖被破壞。PLA 處理后，Lm 生物被膜中胞外蛋白的含量也明顯降低。值得注意的是，2MIC 的PLA 作用后胞外蛋白的含量高于1/2MIC 和MIC 處理組。這可能是由于在2MIC PLA 作用下Lm 細(xì)胞被破壞，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏所致。這些結(jié)果表明PLA 可以通過(guò)作用于胞外多糖和胞外蛋白來(lái)破壞Lm 的生物被膜結(jié)構(gòu)。

2.3 PLA 對(duì)Lm 運(yùn)動(dòng)性的影響

如圖7 所示，亞抑菌濃度PLA 作用下Lm 菌株10403S 形成的運(yùn)動(dòng)圈直徑減小。如表3 所示，在1/10 MIC、1/8 MIC 和1/4 MIC 的PLA 作用下菌株游泳運(yùn)動(dòng)性的抑制率分別為31.68%、36.29%和55.68%；群集運(yùn)動(dòng)性的抑制率分別為57.94%、62.40%、68.90%。由此可見(jiàn)PLA 對(duì)Lm 的運(yùn)動(dòng)性有較好的抑制效果。

表3 PLA 對(duì)Lm 運(yùn)動(dòng)性的抑制Table 3 Inhibition of PLA on motility of L. monocytogenes

大量文獻(xiàn)表明，鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性在細(xì)菌生物被膜形成中發(fā)揮重要作用[31]。鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性可以使細(xì)菌向有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在的表面游動(dòng)同時(shí)克服表面張力達(dá)到物體表面，從而促進(jìn)生物被膜的形成。鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性可分為游泳運(yùn)動(dòng)性和群集運(yùn)動(dòng)性，前者是細(xì)菌的個(gè)體運(yùn)動(dòng)，而后者可以協(xié)調(diào)細(xì)菌在固體表面的運(yùn)動(dòng)，因此群集運(yùn)動(dòng)性與細(xì)菌生物被膜的形成關(guān)系更密切[32]。本研究表明PLA 能夠抑制Lm 的群集運(yùn)動(dòng)性，這可能也進(jìn)一步導(dǎo)致了Lm 生物被膜形成能力的降低。

2.4 PLA 作用下Lm 生物被膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平

采用qRT-PCR 研究PLA 對(duì)鞭毛介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性的相關(guān)基因（motA、motB和flaA）和群體感應(yīng)相關(guān)基因（luxS、agrBD、agrC和agrA）轉(zhuǎn)錄水平的影響（圖8）。在PLA 的作用下，agr操縱子所有基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降（P＜0.01）；其余基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化：luxS和motB的轉(zhuǎn)錄水平分別為1.42 和1.36倍（P＞0.05）；motA和flaA的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.69 倍和0.93 倍（P＞0.05）。

圖8 PLA 作用下Lm 生物被膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.8 Transcriptional levels of genes associated with biofilms of L. monocytogenes in the presence of PLA

群體感應(yīng)是細(xì)菌通過(guò)自身產(chǎn)生的信號(hào)分子進(jìn)行信息交流和協(xié)調(diào)群體行為的過(guò)程。群體感應(yīng)系統(tǒng)在調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，利用群體感應(yīng)抑制劑干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)成為控制細(xì)菌生物被膜危害的有效策略。目前研究者已在Lm 中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)，即LuxS 和Agr 系統(tǒng)。前人研究證實(shí)luxS負(fù)調(diào)控Lm 生物被膜的形成[33]。Agr 系統(tǒng)是由agrBDCA四個(gè)基因組成的操縱子，agr基因的缺失導(dǎo)致Lm 生物被膜形成能力降低，即Lm 生物被膜的形成受Agr 系統(tǒng)正調(diào)控[34]。PLA 作用下luxS的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化，而agr系統(tǒng)所有基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低，表明PLA 可能是Agr 群體感應(yīng)系統(tǒng)的抑制劑。PLA 作用下flaA、motA和motB的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化，推測(cè)PLA可能通過(guò)抑制其他運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因來(lái)抑制Lm 的運(yùn)動(dòng)性。

3 結(jié)論

本論文主要研究PLA 對(duì)Lm 生物被膜的影響及其作用機(jī)制。結(jié)果表明，PLA 不僅能有效抑制Lm 生物被膜的形成，對(duì)成熟生物被膜也表現(xiàn)出良好的清除效果。在PLA 的作用下，生物被膜胞外多糖和胞外蛋白的分泌量減少，同時(shí)Lm 運(yùn)動(dòng)性及agr群體感應(yīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平也明顯受到抑制。本研究為PLA 在控制Lm 及其生物被膜方面的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。作為一種天然抗菌物質(zhì)，PLA 在控制Lm 及其生物被膜方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。