鎮江香醋醋酸發酵階段細菌的垂直分布與富集培養

崔運來，張 徽，李玉龍，羅少波，寧雪悅，田佳蓓，韓 冬

（江蘇科技大學糧食學院，江蘇鎮江 212100）

鎮江香醋作為中國四大名醋之一，具有“酸而不澀，香而微甜、色濃味解”特色[1]，富含氨基酸、多種有機酸[2]，含有四甲基吡嗪等功能成分[3]，受到了大眾的喜愛。鎮江香醋是以糯米、麩皮和大糠為主要原料，經過糖化、酒精發酵、固態分層的醋酸發酵、封醅、加炒米色淋醋等特殊工藝制作，經陶壇密封陳釀而成的食醋[4]。醋酸發酵階段以酒精度約為7%的酒醪、麩皮和大糠為原料[5]，選用發酵第7 d 醋醅進行接種[6]，發酵周期約21 d。每天翻醅，發酵前7 d，每日翻醅深度為7～10 cm，使接種于表層的種醅逐層擴培，發酵7 d 后，每天翻醅到缸底，俗稱“露底”，此時醋醅中的微生物組成與接種的種醅高度相似[7]。翻醅工序是將各種微生物充分混勻，以控制發酵醅溫和混入氧氣[8]，有利于的好氧微生物生長和乙醇氧化生產乙酸[9]。當鹵水酸度不再升高，代表醋酸發酵階段結束，用食鹽和塑料薄膜將醋醅封實，隔絕空氣，防止部分醋酸菌進一步將醋酸過氧化，影響得率，同時封醅有利于食醋風味品質的提高[10]。

鎮江香醋的釀造方式是開放型混合多菌種分層發酵，由于復雜多樣的微生物群落，在不同微環境的發酵作用，使釀制的香醋風味獨特[11]。近年來高通量測序技術作為良好的微生物群落研究手段，受到廣泛應用[12-13]。許多研究者以高通量測序技術對不同食醋發酵過程中的微生物群落的結構以及演變規律進行研究，揭示了不同微生物類群與食醋風味之間的關系。在對鎮江香醋的研究中，Wang 等[14]通過擴增子測序研究了鎮江香醋中與風味相關的核心微生物，Wu 等[15]通過宏基因測序建立了鎮江香醋微生物物種相關的風味代謝網絡，并通過功能微生物的原位強化用于提高乙偶姻含量，Huang 等[16]通過擴增子測序探究了發酵劑和環境變量對鎮江香醋發酵微生物和香醋風味的影響，并指出細菌是醋醅的優勢微生物。我國其他特色釀造食醋的微生物區系也有報道，如山西老陳醋、四川麩醋、涼州熏醋、浙江玫瑰醋等[17-22]。但是以制醋缸中醋醅的垂直結構分類的微生物的分布還未見報道。在固態醋酸發酵中，由于醋醅原料屬于非均相狀態，不僅隨發酵時間微生物存在群落演替，在空間上也存在微生物分布差異，現有研究鮮有從空間分布角度對發酵微生物分布的揭示。

本研究以傳統手工工藝制作鎮江香醋為研究對象，通過高通量測序，揭示醋醅垂直結構細菌群落區系組成，并比較了菌株富集和分離有效培養基。本研究可為固態食醋醋酸發酵中的垂直結構的細菌分布和變化提供理論支撐，從而完善不同空間分布的微生物的發酵機理，進而有利于發酵過程的精準控制，指導翻醅工藝。同時為分離醋醅中特定種屬微生物，提供采樣來源和培養基的選擇參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋醅樣品 以傳統工藝發酵鎮江香醋；土壤DNA 提取試劑盒 廣州美基生物科技有限公司；PCR 擴增引物 上海生工生物工程技術服務有限公司；培養基所用試劑 國藥集團。

H3-18KR 臺式高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；DW-HL340 超低溫冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；BJ-1CD 凈化工作臺 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；sQ810C 立式壓力蒸汽滅菌器 雅馬拓科技貿易有限公司；THZ-98A恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；T100 PCR 儀 美國伯樂。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 在發酵缸（總容積為350 kg）五點取樣法（即四個頂點以及中心位置）自上而下取出距頂部10 cm，30 cm 以及發酵缸底部10 cm 的醋醅并分層充分混勻，然后通過四分法舍去多余的醋醅，在3 個平行的發酵缸中分別取發酵第7 d 醋醅樣品，等質量混合，分別記為BC、ZC 和DC；種醅（ZP）則為發酵第7 d 時，醋醅自上而下的混合醋醅。

1.2.2 樣品中基因組DNA 提取 使用土壤DNA 提取試劑盒，取0.5 g 混合均勻的醋醅樣本在2.0 mL厚壁離心管中，加入0.1～0.6 mm 的玻璃微珠和裂解液進行勻漿裂解。90 ℃水浴進一步裂解10 min，裂解后的樣本通過高速離心去除固體雜質。最后利用醇沉法以及硅膠柱純化技術對澄清的裂解液進行過柱、洗滌等操作，最后用無菌水洗脫從而獲取高產量高純度的總DNA。

1.2.3 PCR 擴增及純化 擴增細菌的16S rDNA 的V3～V4 可變區，總擴增體系為25 μL，以提取的醋醅中總DNA 為模板（1 μL），使用TransStart Fastpfu DNA 聚合酶（0.5 μL），引物341F（CCTAYGGGRB GCASCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCT AAT）（各1 μL），2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5X Trans-Start Fastpfu Buffer 5 μL。PCR 條件，95 ℃ 2 min，變性95 ℃ 20 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，最終延伸72 ℃ 5 min，保持30 個循環。PCR 擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格樣品使用磁珠純化。

1.2.4 Illumina HiSeq 平臺測序 構建測序文庫主要用的試劑盒是Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit。在上機測序前用Agilent High Sensitivity DNA Kit 對文庫進行質量檢驗，使用Illumina NovaSeq 6000 測序儀上進行雙端測序，由上海融享生物科技有限公司完成。

1.2.5 樣品富集培養 分別稱取5 g 種醅樣品，無菌接種于裝有100 mL 寡營養液體培養基（蛋白胨 0.5 g，酸水解酪蛋白0.5 g，酵母浸粉0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，葡萄糖0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，乙酸鈉0.2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，調節pH至7.0）和富營養液體培養基（MRS 培養基pH7.0）的三角瓶中，振蕩混勻，置于恒溫箱內30 ℃靜置培養48 h。培養混合物經離心（4 ℃，10000 r/min，10 min），沉淀物用于基因組提取和高通量測序。種醅樣品記為ZP，經寡營養培養基富集物記為GY，經富營養培養基富集物記為FY。

1.3 數據處理

二代數據處理流程：首先使用Trimmomatic（version 0.33）質量過濾原始數據，用Cutadapt（version 1.9.1）進行引物序列的識別與去除，其后使用FLASH（version 1.2.11）對雙端reads 進行拼接并去除嵌合體（UCHIME，version 8.1），最終得到高質量的序列用于后續分析。

測序序列利用HiSeq 平臺對16S 的V3～V4 區域測序并按照中間overlap 方式進行拼接，使用USEARCH（version 10.0）序列分析軟件把序列的以97%的相似性進行OTU 注釋，與參考數據庫比對，將測序序列數的0.005%作為過濾OTUs 的閾值。使用QIIME 軟件進行Alpha 指數、Beta 多樣性分析[23]。使用R 語言和Graphpad 7 軟件做進一步的可視化展示。

2 結果與分析

2.1 鎮江香醋不同深度發酵醋醅細菌多樣性

2.1.1 OTU 分布 通過高通量測序分析手工發酵鎮江香醋不同發酵深度細菌多樣性，測序共獲得185413 條有效讀長序列，共計118 個OTU，其中樣品BC 的OTU 數目為66 個，樣品DC 的OTU 數目為111 個，樣品ZC 的OTU 數目為76 個。各OTU在樣品中分布見圖1，BC 與DC 共有62 個OTU，BC 與ZC 共有59 個OTU，ZC 與DC 共有71 個OTU，三者共有OTU 數目為57 個，占總OTU 個數的48.31%。而不同深度的醋醅中各含有特有OTU，數目分別為，BC 2 個，ZC3 個，DC 含有最多的特有OTU 數量為35 個。這表明不同深度醋醅中細菌的物種組成部分相似性，但不同深度微環境中含有特有的一些細菌類群，底層醋醅微生物種類最高。

圖1 不同深度發酵醋醅樣品細菌的OTU 分布圖Fig.1 OTU distribution of bacteria in Cupei fermented at different depths

將測序序列經物種注釋后，各樣品的不同分類學水平下物種數量見表1。從門、綱、目、科、屬級分類水平上都是隨著醋醅自上而下深度的增加物種數量越多。

表1 不同深度醋醅中各分類水平下物種統計結果Table 1 Distribution of bacteria in Cupei fermented at different depths by different taxonomic level

鎮江香醋醋醅中細菌在門水平上主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、疣微桿菌門（Verrucomicrobiota）、浮霉菌門（Planctomycetota）、異常球菌門（Deinococcota）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）組成，其中變形菌門（Proteobacteria）在樣品BC 中含量最高，平均相對豐度百分比為79.80%；樣品ZC 和DC 中厚壁菌門（Firmicutes）為優勢菌門，豐度分別為64.42%和50.17%。

鎮江香醋醋醅中細菌在屬水平分布如圖2 所示，醋醅中主要包含乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、泛生菌屬（Pantoea）、短桿菌屬（Curtobacterium）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、假單孢菌屬（Pseudomonas）、新鞘脂菌屬（Novosphingobium）的細菌。黃婷[7]在對鎮江香醋（恒順制醋車間2018～2019）發酵階段細菌的擴增子測序發現平均豐度超過10%為醋酸乳桿菌屬（Acetilactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）[7]；王宗敏[24]在對鎮江香醋（恒順制醋車間2014）發酵階段細菌的擴增子測序發現151 個OTU 參與發酵過程，乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）占絕對優勢，乳球菌屬（Lactococcus）、葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）也存在于發酵過程。本研究中鎮江香醋的細菌類群與制醋工廠生產發酵的主要細菌類群相似，也與其他固態發酵的食醋，如赤水曬醋[25]、山西老陳醋[26]、岐山醋[27]等主要細菌類群相似。

圖2 不同深度醋醅中細菌屬水平TOP10 群落結構分布Fig.2 Distribution of TOP10 bacterial at different depths in Cupei at genus level

BC 中醋酸桿菌屬（Acetobacter）相對豐度最高（77.22%），乳桿菌屬（Lactobacillus）豐度僅次于醋酸桿菌屬（Acetobacter）的含量，占19.24%。ZC 中乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度最高（64.31%），醋酸桿菌屬（Acetobacter）的豐度僅次于乳桿菌屬（Lactobacillus）的含量，占28.18%。DC 中乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度較高（49.80%），其次是醋酸桿菌屬（Acetobacter）12.95%，土壤桿菌屬（Agrobacterium）7.31%，黃單胞菌屬（Xanthomonas）5.79%、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）5.34%。醋醅發酵表層中的優勢菌是醋酸桿菌屬（Acetobacter），隨著醋醅深度加深，醋酸桿菌屬（Acetobacter）豐度呈降低的趨勢。由于醋酸桿菌屬（Acetobacter）是一類好氧微生物[28]，并且發酵工藝是從表層開始接種，發酵深度越深相對溶氧量越低，醋桿菌豐度也就越低。而乳桿菌屬（Lactobacillus）在中層豐度最高其次是底層，表層含量最低。引起乳桿菌分布不同的原因可能是由于乳桿菌屬（Lactobacillus）是一類兼性厭氧菌，并且整個醋缸中中層醅溫度高于底層醅溫，中層醋醅環境最適宜乳桿菌生長，其次是底層環境。乳酸菌發酵產乳酸可以改善醋最終的口感風味，使鎮江香醋的酸味柔和，乳酸菌還可以促進糖、蛋白質和脂肪的分解和代謝、合成乙偶姻等[29]。已有研究對鎮江香醋醋酸發酵階段中微生物變化和風味的相關性分析發現，少數物種是食醋發酵的核心功能微生物（醋酸桿菌屬、乳桿菌屬、水棲菌屬、乳球菌屬、葡糖醋桿菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬）[14]，特別是醋酸菌和乳酸菌它們的物種組成和比例含量是影響發酵過程的關鍵[15,30]。結合本研究醋酸菌和乳酸菌的相互作用不僅體現在隨時間的演替，在空間分布上也存在一定的規律。

2.1.2 不同深度醋醅中細菌群落的多樣性指數 各樣品Alpha 多樣性指數值統計如下表2 所示。Chao1、Ace、Shannon、Simpson、PD whole tree 多樣性指數均呈現相同的趨勢，即DC 高于ZC 高于BC，說明隨著醋醅的深度的加深細菌的多樣性越高，固態釀造食醋底層細菌種類最豐富。

表2 不同深度醋醅中細菌群落Alpha 多樣性指數Table 2 Alpha diversity index of bacteria at differentdepths of Cupei

Beta 多樣性使用樣本相關性熱圖來呈現樣品間細菌群落分布的相似性（圖3），BC 與DC 之間細菌群落差異較大，BC 與ZC 之間細菌群落差異較小。

圖3 不同深度醋醅中細菌分布相關性熱圖Fig.3 Heat map of bacterial distribution at different depths of Cupei

2.1.3 相關性與關聯分析 根據各個物種在各個實驗樣品中的豐度以及相互關系，基于python 在屬水平分析物種相關性進而繪制物種相關性網絡圖（圖4），可體現隨空間變化的微生物物種間的相關性。選取屬水平相關性最高的前37 個屬，進行斯皮爾曼（Spearman）秩相關分析并篩選相關性大于0.1且P值小于0.05 的數據構建相關性網絡。

圖4 屬水平物種相關性網絡圖Fig.4 Species correlation network at genus level

大多數物種間呈現正相關，其中水球菌屬（Aquisphaera），奧雷拉屬（Orrella），土圈菌屬（Pedosphaera）等優勢細菌屬物種和其他細菌屬相連的節點數目在1～3 之間；草螺菌屬（Herbaspirillum），鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），馬賽菌屬（Massilia），金黃桿菌屬（Chryseobacterium）等優勢細菌屬物種和其他細菌屬相連的節點數目超過5 個，節點連通性很高，和其他物種間聯系緊密，這些物種在醋醅中有利于多種微生物的共存。乳酸桿菌屬（Lactobacillus）與駒形氏桿菌屬（Komagataeibacter）呈負相關，奧雷拉屬（Orrella）與蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）呈負相關，他們之間可能存在競爭或拮抗作用。

2.2 富營養和寡營養培養基對醋醅中可培養微生物富集率的影響

2.2.1 不同培養基富集后OTU 變化 ZP、FY、GY樣品測序共獲得203572 對Reads，經質控和拼接后共產生201738 條Clean Reads，單個樣品不少于47429條Clean Reads。高通量測序共獲得146個OTU，其中種醅（ZP）中含有135 個OTU，富營養培養基（FY）有26 個OTU，寡營養培養基（GY）有37 個OTU。3 個樣品中OTU 分布Venn 見圖5，可見本研究所用的富集培養基只能培養出醋醅中部分細菌，富營養培養基可培養出23 種，寡營養培養基可培養出32 種。有少數富集培養后的OTU 未在種醅中檢測出，可能是由于微生物在樣品中分布不均勻導致。寡營養培養方式可富集到17 種富營養培養方式下富集不到的微生物菌群。

圖5 富集培養后OTU 分布Venn 圖Fig.5 Venn diagram of OTU distribution after enrichment culture

本研究所測序的種醅樣品，即發酵第7 d 的醋醅（上一批次），在本批次醋酸發酵中作為發酵劑。高通量測序顯示（圖6），種醅（ZP）中優勢屬為未有效注釋到已報道的物種的未知分類類群（Unassigned）平均相對豐度為85.49%，醋酸桿菌屬（Acetobacter）平均相對豐度為0.91%；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）平均相對豐度為0.72%；農桿菌屬（Agrobacterium）平均相對豐度為2.10%，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）平均相對豐度為2.00%，泛海屬（Pantoea）平均相對豐度為1.80%，黃單胞菌屬（Xanthomonas）平均相對豐度為1.20%，甲基桿菌屬（Methylobacterium）平均相對豐度為1.00%，短小桿菌屬（Curtobacterium）平均相對豐度為0.77%，新鞘層屬（Novosphingobium）平均相對豐度為0.68%、銅綠假單胞菌（Pseudomonas）平均相對豐度為0.62%，其他屬（Others）平均相對豐度為2.72%。

圖6 富集培養后屬水平TOP10 物種分布圖Fig.6 Distribution of TOP10 genera after enrichment culture

富營養培養基富集后擴增子測序顯示相對豐度＞1%的細菌菌群僅歸屬到2 個屬，其中包括醋酸菌屬（Acetobacter）和乳酸菌屬（Lactobacillus）。其中，醋酸菌屬（Acetobacter）是此種富集培養條件下得到的相對豐度最高的類群，平均相對豐度為56.45%，乳酸菌屬（Lactobacillus）平均相對豐度為43.02%。寡營養培養基對鎮江香醋醋醅中的菌群進行富集，高通量測序顯示相對豐度＞1%的細菌菌群同樣歸屬到2 個屬，醋酸菌屬（Acetobacter83.96%）和乳酸菌屬（Lactobacillus15.21%）。因此降低碳源和氮源的寡營養條件有利于鎮江香醋醋醅中醋桿菌屬的富集，富營養培養基有益于醋醅中乳酸菌的富集。

2.2.2 不同培養基對醋醅中細菌培養效果 以每個OTU 單元為橫坐標，以序列相對含量的對數值為縱坐標繪制散點圖（圖7），以比對寡營養培養基和富營養培養基對醋醅中細菌的培養效果。相對含量的對數值大于0，表示培養基對該類群有富集效果，相對含量的對數值小于0，表示培養基有一定培養作用但不能富集。富營養培養基對醋醅中細菌的富集作用主要體現在對厚壁菌門細菌的富集，他還可以富集變形菌門中的醋桿菌和一個未知類群細菌。寡營養培養基可以富集1 種擬桿菌門細菌，6 種厚壁菌門細菌，5 種變形菌門細菌和4 種未分類的類群，對厚壁菌門部分細菌富集作用最強。寡營養的培養基能夠富集的OTU 高于富營養培養基，且具有新類群微生物的培養潛力。

圖7 不同培養基對醋醅中細菌豐度的影響Fig.7 Effect of different media on the abundance of bacteria in Cupei

3 結論

本研究采用高通量測序技術，揭示了發酵第7 d鎮江香醋醋醅不同發酵深度的細菌群落的多樣性。共獲得了192680 條有效序列，樣品中鑒定出118個OTU。隨著發酵深度的增加，細菌物種數量和多樣性升高。表層醋醅細菌的優勢類群為醋酸桿菌（Acetobacter），且隨著醋醅深度增加的醋酸桿菌（Acetobacter）相對含量依次減少，中層和底層醋醅細菌的優勢類群為乳桿菌屬（Lactobacillus），醋酸桿菌（Acetobacter）和乳桿菌屬（Lactobacillus）作為食醋發酵核心微生物，它們主要在醋醅中不同的垂直環境發揮作用。為探究不同營養成分對醋醅中細菌的富集作用，本研究使用富營養和寡營養培養基對種醅微生物進行富集，并通過高通量測序了解細菌群落組成。3 個樣品共獲得203572 條有效序列，歸屬于146 個OTU。兩種培養基都可以對醋桿菌和乳桿菌有效富集，但寡營養培養基對比富營養培養基可培養的菌群更多樣，特別是對潛在的未分類新類群的培養。本研究可進一步加深對鎮江香醋醋酸發酵階段微生物空間分布的了解，同時可為醋醅中特定微生物的分離，特別是從培養基營養成分選擇和采樣位置選擇提供參考，但是如何結合時間和空間多維度對發酵機理的解析還需要深入的研究。