牡丹籽粕中黃酮類化合物的提取工藝優化及膜法分離純化

鄒 平，徐 瑩，陳文濤，張迎陽，徐 榮

（常州大學石油化工學院，江蘇常州 213164）

牡丹籽榨油后的殘渣即牡丹籽粕通常被隨意堆放、丟棄或用作肥料、動物飼料等，綜合利用率極低已被用來研究蛋白和多肽[1]，但對其中存在的黃酮類化合物研究很少。有機溶劑萃取法[2]成本較低，操作簡單，提取效率較高，且所用有機溶劑安全無毒副作用，適合工業生產中提高生產率降低成本。徐瑩等[3]采用75%乙醇-水（v/v）提取橄欖仁紅皮的類黃酮化合物，提取物對DPPH·、·OH 以及ABTS+·有較高的清除率。LU 等[4]使用90%的甲醇優化了鳳丹牡丹總黃酮的提取工藝，鳳丹牡丹總黃酮具有顯著的抗氧化、美白和抑菌效果，但甲醇具有毒性，會對人體呼吸道黏膜和視力造成損傷，而且甲醇易燃易揮發，因此高純度的甲醇具有一定的安全隱患。JI 等[5]采用超聲輔助乙醇/磷酸二氫鈉混合液萃取銀耳中的總黃酮，最大提取量為0.158 mg/g，與單一的乙醇溶液相比，提取量大大降低。這表明選用合適濃度的乙醇-水溶液作為牡丹籽粕總黃酮的萃取液不僅操作簡單且提取量高，但在提取過程中一些醇溶性的雜質也會隨之被萃取出來，因此將提取液進行分離，期望得到雜質更少，純度較高的黃酮提取物。

近20 年來迅速發展的膜分離技術是當代新型高效分離技術，與傳統的分離技術相比，具有節能、高效、過程易控、環境友好等特點。膜分離方法不需要經過相變或添加輔助劑，僅通過控制膜的孔徑提取目標產物，十分節能環保。QUIROS 等[6]采用集成膜工藝，從釀酒廠和橄欖廠廢料中分離回收了黃酮多酚。KHEMAKHEM 等[7]通過微濾、超濾、納濾結合的方法成功從橄欖葉中提取出橄欖苦苷，相較于橄欖葉中含量提高了約10 倍，并發現其具有較好的總抗氧化能力和三價鐵離子還原能力。目前，植物中黃酮類物質的提取分離工藝已經相當成熟，但仍存在選擇性差，污染環境，工業應用成本高等缺點。因此，本研究嘗試將現有的提取工藝與高新技術相結合，建立基于幾種分離提取方法的連續分離提取設備，使提取過程更加高效、安全、無污染，使黃酮類化合物成為一種優質的自然資源，得到更廣泛的應用。

將牡丹籽粕黃酮（PSMF）應用到醫藥保健[8]、食品加工[9]、化妝品生產等行業，深入研究其健康價值，不僅可以促進相關研究機構成果轉化，還能有效推動當地種植業發展，帶動農民增收，具有顯著的社會效益，為PSMF 的提取、純化及高值化綜合開發應用提高了參考價值。本論文以牡丹籽粕為研究對象，采用乙醇-水溶液進行萃取，在單因素的基礎上通過響應面分析方法得到PSMF 最佳提取工藝，采用不同種類微濾膜進行分離，將分離前后活性物質進行比較，采用LC-MS 技術對最優條件下提取液中黃酮類化合物進行分析，為進一步開展植物黃酮的研究和開發應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油牡丹籽粕 中國江蘇國色天香油用牡丹科技發展有限公司；蘆丁、1,2-雙（三乙氧基硅基）乙烷阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇 上海沃凱生物技術有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞 上海凌峰化學試劑有限公司；氯化鋁·六水、30%過氧化氫、福林酚試劑、去離子水（H2O）、氫氧化鈉、硫酸亞 、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、水楊酸、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、抗壞血酸（Ascorbic acid，Vitamin C，VC）、鄰二氮菲、鹽酸、氯化硝基四氮唑蘭（NBT）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS） 國藥集團化學試劑有限公司；上述實驗試劑均為分析純。

721N 可見光分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；MDF-U5412 低溫冰箱 三洋電機株式會社；SHB-ⅢA 循環水式真空泵 上海聚昆儀器設備有限公司；DF-Ⅱ數顯集熱式磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-3600 紫外可見近紅外分光光度計 日本島津公司；ATY224 精密電子天平 常州萬泰天平儀器有限公司；Tissuelyser-48 高通量組織破碎儀 上海凈信實業發展有限公司；Q Exactive質譜儀、Reacti-thermo 氮氣吹掃儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司；Acquity 高效液相色譜儀 美國Waters 公司；XH-T 漩渦混合器 金壇區白塔新寶儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹籽粕中黃酮類化合物的提取工藝 將牡丹籽粕粉碎過80 目篩，選擇乙醇-水（v/v）溶液作為溶劑對牡丹籽粕中的天然黃酮類化合物進行浸提，將浸提液離心取上清液，上清液濃縮后在-40 ℃凍干保存，將凍干粉研磨可得到PSMF 凍干粉末。

1.2.2 總黃酮含量測定 總黃酮標準曲線的繪制：取3 mL 蘆丁對照品溶液置于10 mm 比色皿，再加入5 mL 1% AlCl3溶液，搖勻后靜置10 min，以吸光度值（y）為縱坐標，蘆丁含量（x）為橫坐標，在415 nm處測定吸光度并繪制標準曲線圖。吸光度值與的濃度呈良好的線性關系，回歸方程為：y=(0.03±2.01E-4)x+(0.01±0.006)，R2=0.999 4。取200 μL 樣品溶液加30%乙醇-水（v/v）溶液定容至5 mL 再加入5 mL 1% AlCl3溶液，搖勻后靜置10 min，在415 nm 處測定吸光度，可根據公式（1）計算出樣品液中總黃酮含量。

式中，A、n 分別代表樣品吸光度和稀釋倍數。

1.2.3 單因素實驗 稱取1.0 g PSMF 粉末，固定提取時間30 min、乙醇體積分數70%、提取溫度50 ℃，改變料液比（m 牡丹籽粕:V 乙醇）1:5、1:10、1:15、1:25、1:50 g/mL；固定料液比1:15 g/mL、乙醇體積分數70%、提取溫度50 ℃，改變提取時間10、20、30、40、50 min；固定料液比1:15 g/mL、提取時間30 min、提取溫度50 ℃，改變乙醇體積分數40%、50%、60%、70%、80%；固定料液比1:15 g/mL、提取時間30 min、乙醇體積分數70%，改變提取溫度40、50、60、70、80 ℃進行單因素實驗，對總黃酮類化合物進行提取并使用紫外分光光度計對PSMF 含量進行計算。

1.2.4 響應面優化總黃酮提取工藝 響應面試驗的因素水平取值由單因素實驗得出，選擇提取時間、提取溫度、乙醇體積分數和料液比為影響因子，以黃酮提取量為響應值（見表1），利用Design-Expret 8.0.6軟件分別對牡丹籽粕進行曲面響應試驗，共29 個試驗點。得到二元多項式回歸方程，進行重復實驗。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Level of response surface experimental factors

1.2.5 黃酮類化合物的分離純化

1.2.5.1 微濾膜分離 由于牡丹黃酮提取物中所含成分較多，本研究采用雙層濾紙對粗提液進行預處理，以盡量除去固體懸浮物等物質，延長微濾膜的使用壽命，減輕膜的污染。微濾選用微孔膜，平均孔徑0.02 μm，能夠截留直徑0.05～10 μm 的微粒或分子量大于1000 Da 的物質。根據濾膜材質，將聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚醚砜（PES）、聚四氟乙烯（PTFE）、聚丙烯（PP）、混合纖維素（MCE）、聚丙烯腈（PAN）、水系醋酸纖維（CA）和聚酰胺（PA）微濾膜分為水系微濾膜、有機系微濾膜和混合系微濾膜三類。水系濾膜系列包括：CA[10]（用于乳清和果汁的分離時）、MCE、PES[11]（具有良好的分子穩定性、優異的機械性能和成膜性能，去除天然存在的有害有機物）等。常用有機系微孔膜：PTFE[12]（已用于膜蒸餾、油水分離和氣固分離等多種分離工藝，是目前最常見的膜分離材料）、PVDF（具有出色的化學、熱和機械穩定性[13]，有利于在不同分離條件下進行有機物的純化）。混合濾膜過濾：PA[14]（具有優異的分離性能，耐高溫，聚酰胺樹脂是一種從植物中分離黃酮的有效吸附劑）、改性的聚偏氟乙烯、改性的聚四氟乙烯膜等。因此選用PVDF、PES、PTFE、PP、MCE、PAN、CA 和PA 這8 種材料微濾膜對處理液進行分離。

根據8 種微濾膜通量、水接觸角以及PSMF 透過液凍干粉的掃描電鏡、熱重等表征確定分離效果最佳的微濾膜。在操作壓力為0.8 MPa，操作溫度為25 ℃，流量為9.99 mL/min 的條件下，對膜進行預壓30 min 后測定膜通量，根據公式（2）計算膜通量。

式中，J 代表膜通量（kg/（m2·h））；W 代表過膜液質量（kg）；T 代表取樣時間（h）；A 代表膜的有效面積（m2）。

1.2.5.2 納濾膜分離 納濾分離膜為實驗室自制，選擇PA 膜為支撐體，采用1，2-二（三乙氧基甲硅烷基）乙烷（BTESE）作為硅源前驅體，正丙醇為溶劑，以鹽酸為催化劑，制備了有機硅聚合溶膠。通過超聲噴涂法將有機硅溶膠涂覆在PA 撐體上制備BTESE/PA復合膜，對PSMF 溶液進行納濾膜分離。

1.2.6 微濾膜、溶膠和納濾復合膜的結構表征

1.2.6.1 掃描電鏡分析 分離膜在觀察前樣品進行噴金處理，采用德國-蔡司SUPRA55 場發射掃描電鏡（SEM）觀察BTESE 有機硅復合膜的表面和斷面形貌。

1.2.6.2 熱重分析儀分析 采用熱重分析儀（NETZSCH，209F3）對PSMF 溶液、PA 透過液和BTESE/PA 復合納濾膜透過液的熱穩定性進行表征，升溫速率為10 ℃·min-1，溫度范圍為50～800 ℃，在N2氛圍下操作。

1.2.6.3 液-質聯用組分分析 基于液-質聯用（LCMS）非靶向的方式進行檢測[15]，重復3 次，所得到的數據供生物信息學分析，最終得出代謝物。采用Thermo 超高效液相系統（Vanquish，USA），根據化合物的性質，采用Hyper ODS2 C18 填料，進樣量10 μL，流速0.9 mL/min，柱溫40 ℃，流動相A 為85%甲酸-水（v/v）溶液，流動相B 為去離子水溶液。質譜采用的是美國Thermo 公司的Qexactive 高分辨質譜檢測系統。

1.2.7 黃酮類化合物抗氧化能力測定

1.2.7.1 DPPH·清除能力測定 DPPH·清除能力測定實驗參照文獻[16]，稍作改進。樣品為2 mL PSMF 溶液（50、100、150、200、250 μg/mL）和2 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液（95%乙醇溶解）。空白為95%乙醇2 mL+0.1 mmol/L DPPH· 2 mL。室溫下避光反應30 min，在波長為517 nm 處測定吸光度。DPPH·清除率根據式（3）計算。

式中，A樣、A0分別代表樣品和空白的吸光度。

1.2.7.2 ·OH 清除能力測定 ·OH 清除能力測定實驗方法參照文獻[17]，稍作改進。混合液由4 mL 1,10-鄰菲咯啉（5 mmol/L）和4 mL FeSO4（5 mmol/L）組成，然后依次加入3 mL 磷酸鹽緩沖液（16 mL 0.2 mol/mL 磷酸二氫鈉+84 mL 0.2 mol/mL 磷酸氫二鈉配制，pH7.4），3 mL H2O2（0.01%）和4 mL PSMF樣品液，搖勻后靜置1 h，在536 nm 處測量吸光度。對照組用蒸餾水代替PSMF 溶液，其他試劑與樣品相同。空白組用蒸餾水代替過氧化氫，其他試劑與樣品相同。根據式（4）計算·OH 清除率。

式中，A樣、A損和A0分別代表樣品、對照和空白的吸光度。

1.2.7.3 O2-·清除能力測定 按照文獻[18]修改如下，取1.5 mL 樣品液，再分別按順序加入0.5 mL 0.30 mmol/L NBT （pH8.0 Tris-HCl 配制）、0.5 mL 0.468 mmol/L NADH （pH8.0 Tris-HCl 配制）和0.5 mL 0.060 mmol/L PMS （pH8.0 Tris-HCl 配制），混合均勻后在25 ℃水浴5 min。測定其波長在560 nm 處的吸光度，O2-·清除率計算方程式為：

式中，A樣和A0分別代表樣品和空白的吸光度。

1.2.7.4 還原力測定 按照文獻[19]，取1.5 mL 樣品液，再分別按順序加入1 mL 0.20 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH8.0 Tris-HCl 配制）、1 mL 1% 氰化鉀1 mL，混合均勻后在50 ℃水浴20 min，快速冷卻后加10%三氯乙酸（TCA），3000 r/min 離心后取上清液1.5 mL，加入1.5 mL 蒸餾水和0.4 mL 0.1%氯化鐵溶液，反應10 min。測定700 nm 處的吸光度， 還原力強弱反應在吸光值上。

1.2.7.5 半抑制濃度計算 按照公式（6）計算IC50值：

式中，Xm代表樣品最大濃度的對數；I 代表樣品最大濃度與樣品相鄰濃度之比的對數；P、Pm和Pn分別代表樣品濃度之和、樣品最大濃度和樣品最小濃度（μg/mL）。

1.3 數據處理

采用Origin 9.0 對提取實驗和單因素實驗數據進行處理；利用Design-Expert 8.0.6 對響應面優化測試數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

PSMF 提取量的提取受到料液比、提取時間、乙醇體積分數以及提取溫度的影響，各因素對其影響關系通過單因素實驗表明。按照1.2.1 中條件進行實驗，得到結果如圖1 所示。

圖1 料液比、提取時間、乙醇體積分數和提取溫度對PSMF 提取量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio, extraction time, ethanol volume fraction and extraction temperature on the extraction amount of PSMF

如圖1A 所示，不同小寫字母表示PSMF 的提取量在不同料液比時的差異顯著（P＜0.05），提取量隨著浸提溶劑量的增加而減少。由于PSMF 具有易溶于乙醇的性質，所以在料液比較小的時候，溶液中的黃酮類化合物很快溶出達到飽和[20]。考慮到隨著浸提溶劑體積的增加，也會增大濃縮工藝的難度，因此浸提溶劑量不宜過大，采用料液比為1:15 g/mL 最為合適。

如圖1B 所示，不同小寫字母表示PSMF 的提取量在不同提取時間時的差異顯著（P＜0.05），提取時間在30 min 時，提取量達到峰值（234.84±1.17）μg/mL，超過30 min 有所下降，可能是由于時間的延長，黃酮類化合物中酚羥基結構遭到破壞分解為雜質，導致提取量下降。

如圖1C 所示，不同小寫字母表示PSMF 的提取量在不同乙醇體積分數時的差異顯著（P＜0.05），黃酮類物質為典型的有機化合物，易溶于有機試劑[21]，因而提高乙醇體積分數，總黃酮的提取量也會隨之升高，但過高的乙醇體積分數導致大量有機雜質被溶出并擠占黃酮分子的溶出空間，從而導致活性有所下降。最終萃取劑選擇為70%乙醇-水（v/v）溶液。

如圖1D 所示，不同小寫字母表示PSMF 的提取量在不同提取溫度時的差異顯著（P＜0.05）。由于黃酮類化合物中含有酚羥基結構，適當的溫度可以激活羥基自由基活性，但過高的溫度會使其氧化分解，50 ℃后黃酮類化學物的結構遭到破壞，導致提取量降低。最終提取溫度選擇50 ℃。

由單因素實驗結果可知PSMF 提取的最佳條件為料液比1:15 g/mL，提取溫度50 ℃，乙醇體積分數70%，提取時間30 min，PSMF 提取量最高為（234.84±1.17）μg/mL。

2.2 響應面試驗結果

利用 Design-Expert 軟件對回歸模型進行方差和顯著性分析，結果如表2、表3 所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回歸模型的方差分析及顯著性結果Table 3 Analysis of variance and significance results of the regression model

利用 Design-Expert 軟件進行多元次擬合分析，得出PSMF 提取量與料液比、提取時間、乙醇體積分數以及提取溫度為變量的相關回歸方程為：

由表3 可知，模型的P＜0.0001，表明該模型具有極顯著性，失擬項P值為0.5600，因而該模型擬合程度較好，實驗誤差小，可用此模型對PSMF 進行預測和分析。在這種情況下，A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、D2對響應值具有極顯著影響（P＜0.01），C2對響應值具有顯著性影響（P＜0.05）。PSMF 與料液比、提取時間、提取溫度和乙醇體積分數的等高圖和3D 響應面見圖2。

圖2 PSMF 的3D 響應面圖Fig.2 3D Response surface of PSMF

將所得結果利用 Design-Expert 軟件進行響應面預最優點預測，得到料液比1:15 g/mL，提取溫度50 ℃，乙醇體積分數70%，提取時間30 min，預測PSMF 提取量（240.28±2.25）μg/mL。

2.3 微濾膜對PSMF 的分離純化效果

2.3.1 8 種材料微濾膜膜通量分析 膜通量指單位時間內通過單位膜面積上的流體量，對于同一種流體來講，膜通量越大，溶液透過率就越高，分離的效率越快。8 種不同材料的微濾膜膜通量見圖3。

圖3 8 種微濾膜的膜通量結果Fig.3 Membrane flux histogram of 8 kinds of microfiltration membranes

如圖3 所示，不同小寫字母表示膜通量在不同材料微濾膜時的差異顯著（P＜0.05），可以看出在同樣的分離條件下PA 膜的膜通量最高，PP 膜的膜通量最低，膜通量的高低由外加推動力和膜的阻力共同決定，其中膜本身的性質起決定性作用，天然致密的PA 結構表現出優異的離子截留性能，具有選擇性水滲透和鹽截留的特性[22]。因此推斷PA 膜較其他材料而言，對PSMF 溶液有較好的分離效果。

2.3.2 8 種材料微濾膜表面表征分析 與光滑的支撐體相比，在相對粗糙的支撐體表面制備出高質量的BTESE 有機硅涂層無疑是困難的[23]。由圖4 表明，PA 表面更光滑且過膜后的PSMF 溶液凍干粉顆粒更均勻，本實驗優先考慮PA 作為制備復合聚酰胺納濾膜的支撐體。

圖4 8 種微濾膜表面SEM 圖Fig.4 SEM images of the surface of 8 kinds of microfiltration membranes

2.3.3 8 種材料微濾膜分離效果分析 8 種微濾膜對PSMF 的分離效果：PA＞PAN＞CA＞MCE＞PVDF＞PES＞PTFE＞PP。由圖5（a）為PSMF 原料液-質圖，原料液中含有12 種黃酮類化合物。圖5（b）～圖5（e）分離程度較弱，大部分化合物未被分離。圖5（f）～圖5（i）分離程度有所提高，其中PA 膜分離效果最好，分離出5 個組分，分別為桑色素、山奈酚、野漆樹苷、羥基芫花素和槲皮素。PA 薄膜的這種強的結合親和力源于酰胺基團與目標化合物分子的供質子基團之間的氫鍵相互作用[24]。采用場發射掃描電鏡觀察微濾膜過膜后PSMF 凍干粉的形貌，與其他凍干顆粒相比，PA 凍干粉顆粒更均勻。由膜通量、掃描電鏡和液相出峰共同確定了選用PA 膜分離PSMF，可以達到較好的分離效果。

其中桑色素含量最高（Morin）含量最多，其分子式為C15H10O7（表4、圖6），桑色素具有許多藥理功能，包括抗氧化劑、抗癌劑、抗炎抗菌藥物等。ZHANG 等[25]通過對細胞抑制、周期分析、細胞凋亡、mRNA 表達和通過活性氧產生的抗氧化機制研究，驗證了桑色素在誘導癌細胞凋亡中起重要作用。JARINYAPORN等[26]發現桑色素可以抑制高脂飲食誘導的肥胖小鼠的脂肪的生成。

表4 PSMF 成分組成分析結果Table 4 Composition of PSMF

2.3.4 BTESE/PA 復合膜表征以及分離效果分析PA 薄膜具有良好的化學穩定性且耐溶劑性強，且對于PSMF 有較好的分離效果，將PA 膜過膜液進行納濾分離，納濾膜為實驗室自制的BTESE/PA 復合膜，膜表面形貌如圖7（右）所示。

圖7 PA 膜表面（左）、BTESE/PA 復合膜表面（右）SEM 照片Fig.7 SEM diagram of PA membrane surface (left) and BTESE/PA composite membrane surface (right)

由圖7 可知，膜表面小部分針孔被有機硅膠層修飾，膜整體連續、平整無明顯缺陷。同時由圖7（右）可見，BTESE/PA 復合膜的結構清晰。經過復合膜分離后的PSMF 溶液的液-圖以及組分如圖8 所示。由圖8 可見，BTESE/PA 復合膜過濾后PSMF分離出三個組分。可能是BTESE 納米粒子增加了PA膜的表面厚度和親水性，BTESE 納米粒子改變了PA膜的表面，使其結構更加緊密，截留更小的分子[27]。隨著植物黃酮的功效在歐美市場被認可，黃酮類化合物的應用領域越來越廣，但由于黃酮類化合物具有水溶性低的天然特性，限制了PSMF 在功能性飲料、化妝、普通食品等領域的應用。通過PA 和BTESE/PA 膜過濾后的溶液，有效的解決了這個問題。溶解度由55.22%提升至90.31%，過濾后的PSMF 水溶性明顯提高。過膜后熱穩定性好，食品熱加工不會破壞其生物活性，同時還保留著部分抗氧化活性，方便儲存。PSMF 作為一種天然的食品添加劑，其開發利用價值應給予重視，BTESE/PA 有機納濾膜在黃酮分離中的應用應當給予肯定。

圖8 BTESE/PA 復合膜過膜液的液-質聯用結果Fig.8 BTESE/PA composite membrane permeate liquid-mass spectrometry diagram

2.3.5 PSMF、PA 過膜液以及BTESE/PA 透過液性能表征 采用熱重分析儀分別對PSMF 提取液、微濾膜透過液以及BTESE/PA復合膜過膜液的熱穩定性進行表征，溫度范圍為50～800 ℃，在N2氛圍下操作。由圖9 可見，100 ℃之前，熱失重曲線幾乎沒有變化，說明在100 ℃之前，提取物穩定，沒有出現物質的熱分解；100～210 ℃之間，熱失重曲線開始出現緩慢下降趨勢，說明物料分解溫度，開始出現熱分解現象，樣品失重約為5%；在210～280 ℃之間，熱失重曲線大幅度下降，大部分被熱分解，樣品失重約為42%，此時三種物質的失重速率達到最大，其中PSMF提取液失重速率＞PA 透過液失重速率＞BTESE/PA復合膜過膜液失重速率，相比較而言，透過BTESE/PA 復合膜的黃酮提取物熱穩定性有所提高；280 ℃之后，熱失重曲線下降趨勢減小，為物料及灰分的熱分解。800 ℃以后PSMF 提取液、微濾膜透過液以及BTESE/PA 復合膜過膜液的殘留質量分別為1.43%、0.76%和0.26%，由此表明通過BTESE/PA復合膜的PSMF 溶液受熱后殘留的灰分更少雜質更少，純度更高，進一步表明BTESE/PA 復合膜對PSMF 溶液有較好的分離效果。

圖9 PSMF、PA 過膜液以及BTESE/PA 透過液熱重曲線Fig.9 Thermogravimetric curves of PSMF, PA film passing solution and BTESE/PA penetrating solution

2.4 抗氧化活性

由圖10 可知，不同小寫字母表示PSMF、BTESE/PA 過膜液、VC的抗氧化活性在不同濃度時的差異顯著（P＜0.05），在所測定濃度范圍內，VC對·OH、O2-·和DPPH·始終保持很高的清除能力，隨VC的濃度增加，其還原力也隨之提高。經過膜過濾后的PSMF 溶液在·OH、DPPH·的清除率和還原力上有所提升：還原力＞·OH 清除率＞DPPH·清除率，但過膜后O2-·清除率低于PSMF 原料液的清除率。PSMF 過膜液的·OH 清除率略高于原料液，其可能是因為膜將大分子的雜質截留，小分子的黃酮類化合物透過，王帥[28]以白皮杉醇PIC 為例，證明了抽氫反應·OH清除的優勢通道，PSMF 富含酚羥基結構，因此清除率有所上升；O2-·清除能力與酚羥基有直接的關系[29]，當酚羥基被金屬離子螯合時，清除能力下降，PSMF中的鄰二酚結構也會抑制O2-·清除；DPPH·[30]清除機理以H 原子轉移為主導，因此其清除率曲線與·OH 清除曲線相似；PSMF 過膜液的還原力略高于原料液，其因可能是過膜后的PSMF 溶液呈中性，化合物穩定，不發生自氧化作用，表現出較強的清除能力，隨化合物濃度增加而提高。

圖10 PSMF、BTESE/PA、VC 抗氧化活性曲線Fig.10 Schematic diagram of antioxidant activity test of PSMF,BTESE/PA and VC

綜上，PSMF 具有較好的清除自由基的能力，其抗氧化能力隨濃度升高而增大，最終趨近于VC的抗氧化能力，PSMF 過膜液對超氧陰離子的清除率低PSMF 于原料液，除此之外過膜液的抗氧化性能均有所提高。PSMF 是將牡丹籽榨油后剩余的殘渣回收后進行提取，提高了資源再利用，且具有較強的清除·OH、O2-·、DPPH·和還原力的能力，并均呈一定的量效關系（表5）。

表5 不同抗氧化劑清除自由基的IC50 值Table 5 IC50 values of different antioxidants for scavenging free radicals

3 結論

本研究以總黃酮提取量為參考指標，以乙醇-水（v/v）溶液為提取劑，經過響應面優化得出最佳的提取條件為料液比1:15，提取溫度50 ℃，乙醇體積分數為70%，提取時間為30 min，預測總黃酮提取量（240.28±2.25）μg/mL。采用LC-MS 技術分析PSMF共有12 種化合物。篩選了8 種不同的微濾膜進行分離研究，發現PA 膜分離效果較好，其中桑色素的相對含量最多。納濾膜選用實驗室自制的BTESE/PA 復合膜，截留分子量在400 Da 左右，分離后的PSMF純度和熱穩定性略提高，水溶性顯著提升。抗氧化測試結果顯示BTESE/PA 復合膜的抗氧化效果比未處理的PMSF 有所提升。本研究對牡丹籽粕中的活性成分進行分析，結果表明PSMF 是一種新型的植物黃酮資源，組成豐富，具有一定的研究空間。目前，對牡丹籽粕的研究較少，尤其是在分離提純和活性探究的空間還很大，例如單一黃酮類化合物的提純以及對提純后提取物的抑菌活性、抗氧化、抗癌等方面的分析還有待深入研究。