糖基化改性制備核桃分離蛋白-菊粉共軛物及其性質分析

陳 宇，曹詩諾，沈乙杰，李 暢，杜 建，王豐俊,

（1.北京林業大學生物科學與技術學院，林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京 100083；2.阿克蘇浙疆果業有限公司，新疆阿克蘇 843000）

核桃是我國主要農產品之一，2020 年我國核桃產量達到479.59 萬噸，居世界首位[1]。核桃分離蛋白（walnut protein isolate，WPI）是制備核桃油脂的副產物，但因為其溶解性較低，通常被用做生產經濟價值較低的飼料、肥料和其他材料，應用非常有限[2]，但是核桃分離蛋白營養價值高，具有巨大發展潛力[3]。

為了提高WPI 的溶解度，改善蛋白質的結構和功能特性，增加其加工利用度，需要對WPI 進行改性處理。常見的物理改性方法效果不明顯，酶解改性利用不同類型的酶使蛋白質適度、精準水解，雖然酶法改性反應條件溫和、副反應較少，但是酶法反應條件苛刻，生物酶價格較高導致經濟成本較高，另外會產生令人不愉快的風味物質。化學改性操作簡單效果明顯，但可能會因為化學物質的添加產生新的安全問題[4]，而糖基化改性不同于一般的化學改性，該反應在控制糖蛋白比例、加熱溫度、濕度以及反應時間等條件下即可進行，不需要添加額外的化學試劑，反應過程溫和，安全性高[5-6]。糖基化主要是還原糖鏈上的羰基與蛋白分子上的氨基發生羰氨縮合，形成較為穩定的蛋白質-糖共軛物。糖基化改性后的蛋白質結合了天然蛋白大分子特性及多糖的親水特性，功能特性得到明顯改善[7-8]。研究表明糖基化改性可使花生蛋白[9]、豌豆蛋白[10]、苦杏仁蛋白[11]、小麥蛋白[12]、大豆蛋白[13]等蛋白質的功能特性和營養性均得到明顯的改善。但目前對糖基化改性WPI 的研究較少。

本研究以WPI 為主要原料，選用具有調節腸道微生態、降血糖、降血脂等功能的菊粉[14]，用糖基化改性的方法研究蛋白與糖質量比、反應溫度、反應時間對WPI 溶解度的影響，通過單因素實驗與響應面優化實驗確定最優的核桃分離蛋白-菊粉共軛物，即菊粉改性蛋白（Inulin modified protein，IMP）的制備工藝，對糖基化改性蛋白的結構特性及功能特性進行研究，以期獲得高溶解的核桃蛋白，提高WPI 的利用率，為WPI 的精深加工利用提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃分離蛋白（87%） 實驗室前期實驗制備[15]；菊粉 食品級，上海鑫泰實業有限公司；鄰苯二甲醛、考馬斯亮藍G-250、20%十二烷基硫酸鈉溶劑鈉、牛血清蛋白 分析純，北京藍弋科技有限公司；β-巰基乙醇 分析純，北京津同樂泰化工產品有限公司；其他試劑 均為分析純。

LGJ-12 型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；524G 型磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；GL20G-II 型冷凍離心機 上海安亭儀器有限公司；L6 型紫外可見分光光度計上海儀電分析儀器有限公司；FM-200A 型高剪切分散乳化機 上海弗魯克科發展有限公司；VERTEX70型傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker 公司；GeminiSEM 300 型掃描電子顯微鏡 德國蔡司公司；FLS1000 型熒光分光光度計 英國愛丁堡儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 WPI-菊粉共軛物（Inulin modified protein，IMP）的制備 稱取0.5 g WPI 溶于50 mL 離子水中，于25 ℃室溫下攪拌1 h，以不同比例加入一定量的菊粉混合均勻后，使用恒溫磁力攪拌器，在不同的時間、溫度條件下，反應結束后立即用冰浴處理，使其快速冷卻至室溫，使用高速冷凍離心機設置轉速8000 r/min，離心時間10 min，將上清液于-4 ℃條件下置于食品級雙層透析袋中（60 mm×70 mm×0.22 mm）透析24 h 后冷凍干燥制得IMP。同時以未處理的WPI 和相同條件下只加熱處理的核桃分離蛋白（Heat treated walnut protein isolate，H-WPI）為對照。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 不同反應溫度條件下制備IMP 準確稱取0.5 g WPI 溶于50 mL 去離子水中，在反應時間60 min、pH7.0、WPI 與菊粉質量比1:1 的條件下，以溶解度為指標，考察反應溫度在50、60、70、80、90、100 ℃條件下對IMP 溶解度的影響。

1.2.2.2 不同反應時間條件下制備IMP 準確稱取0.5 g WPI 溶于50 mL 去離子水中，在反應溫度90 ℃、pH7.0、WPI 與菊粉質量比1:1 的條件下，以溶解度為指標，考察反應時間在20、40、60、80、100、120 min 條件下對IMP 溶解度的影響。

1.2.2.3 不同蛋白與糖質量比對IMP 溶解度的影響準確稱取0.5 g WPI 溶于50 mL 去離子水中，在反應時間60 min、反應溫度90 ℃、pH7.0 的條件下，以溶解度為指標，考察WPI 與菊粉質量比為3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4 條件下對IMP 溶解度的影響。

1.2.3 響應面試驗 響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Response surface test factor level table

1.2.4 接枝度（degree of grafting，DG）的測定 按照Jiang 等[16]改進的OPA 試劑法測定，根據公式（1）計算。

式中：A0為反應前樣品吸光度；A1為反應后樣品吸光度。

1.2.5 褐變程度的測定 取適量IMP 樣品溶于離心管中，使用高速冷凍離心機設置轉速8000 r/min 離心時間10 min 除去不溶物，設定波長為420 nm，測定上清液的吸光度，以蒸餾水做空白對照。以此表示體系的褐變程度。

1.2.6 結構特性的測定

1.2.6.1 掃描電子顯微鏡 取適量樣品直接粘到導電膠上，噴淋金45 s，噴金為10 mA。通過ZEISS Gemini SEM 300 掃描電子顯微鏡對鍍金試樣進行分析。在電子加速電壓為3 kV、放大倍數為3000×時對樣品進行觀察，并拍攝圖像。

1.2.6.2 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜 取1 mg 樣品與100 mg 干燥后的KBr 混合后研磨，放入壓片機上壓成透明薄片，通過VERTEX 70 紅外光譜儀進行測定，掃描波長4000～400 cm-1，掃描次數為32 次，分辨率為4 cm-1。

1.2.6.3 內源熒光光譜 用10 mmol/L 的pH7 的磷酸鹽緩沖溶液溶解樣品，制備成濃度為0.1 mg/mL的溶液。使用FLS1000 熒光分光光度計掃描樣品。激發波長290 nm，掃描范圍300～400 nm，狹縫寬5 nm，掃描速度200 nm/min，掃描間隔20 ms，反應時間0.1 s。

1.2.7 功能特性

1.2.7.1 溶解度的測定 采用牛血清蛋白配制標準蛋白溶液，繪制標準曲線為y=7.34x+0.1536，R2=0.9995。根據Horax 等[17]的方法稍作改動，準確稱取0.1 g 凍干后的樣品分散于10 mL 去離子水中，在磁力攪拌器上攪拌均勻，用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節溶液pH，使用高速冷凍離心機設置轉速8000 r/min 離心10 min，收集上清液；取1 mL 上清液和5 mL 考馬斯G-250 染液于試管中，振蕩混勻，避光放置3 min 后，在波長595 nm 處測定吸光度。以同體積去離子水作為對照。按照公式（2）計算溶解度。

式中：m0為樣品中蛋白質含量，mg/g；m1為上清液中蛋白質含量，mg/g。

1.2.7.2 起泡性（FC）和泡沫穩定性（FS）的測定 參考金鳳[15]的測定方法，記錄溶液和泡沫的總體積V1，將溶液靜置30 min 后，再次讀取量筒內液體和泡沫的總體積V2。按照公式（3）、（4）計算FC 和FS。

1.2.7.3 乳化性（EAI）及乳化穩定性（ESI）的測定準確稱取0.30 g WPI 溶于30 mL 去離子水中，混合均勻后，參考金鳳[15]的方法進行測定，按照公式（5）、（6）計算EAI 和ESI。

式中：DF為稀釋因子（100）；c 為樣品的濃度（g/mL）； Φ為光路（1 cm）；θ為油相在乳液的分散系數（0.25）；A0是樣品在0 min 的吸光值；A10是樣品在10 min 的吸光值。

1.3 數據處理

通過Design Expert 8.0.6 分析實驗數據；采用Origin 8.0 軟件作圖。使用SPSS 20.0 軟件進行方差分析，顯著性差異的分析選擇Duncan 法多重比較，結果表示為平均值±標準差，P＜0.05 為顯著性差異。實驗均重復3 次，結果用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同反應條件對IMP 溶解度的影響 如圖1a所示，隨著反應溫度的升高，IMP 的溶解度先上升后趨于平緩，在溫度為90 ℃時達到最大溶解度82.00%。有研究表明，適度的熱處理有利于蛋白質和多糖的相互結合，對WPI 的溶解性起到促進作用。但是當加熱溫度過高或加熱時間過長有可能會使蛋白質分子內部的疏水基團暴露，結構疏水性增強，溶解度降低[18]。此外，溫度過高使WPI 發生變性、聚集和沉淀，結合水的能力降低。因此，選擇溫度80～100 ℃進行響應面試驗。

圖1 反應條件對IMP 溶解度的影響Fig.1 Effect of reaction conditions on the solubility of IMP

由圖1b 可知，隨著反應時間的延長，IMP 的溶解度總體呈現先增加后降低的趨勢，在反應時間為80 min 時溶解度達到最高值81.00%。隨著反應時間的繼續增加，原本斷裂的肽鍵重新聚合，蛋白的疏水基團變多，不溶于水的大分子聚合物增多，從而導致溶解度下降[19]。因此，選擇反應時間為60～100 min進行響應面試驗。

由圖1c 可知，隨著菊粉占比增加，IMP 的溶解度先上升后降低，這是由于隨著菊粉濃度的不斷提高，多糖提供的反應位點逐漸變多，蛋白與多糖碰撞結合的可能性逐漸變大，在WPI 與菊粉質量比為1:2 時，溶解度達到最大值79.00%。菊粉比例增加過多時，溶液黏度不斷增強，反而不利于糖基化反應的發生，這與王棋等[20]的研究結果一致。因此，選擇WPI 與菊粉質量比為1:1、1:2、1:3 進行響應面試驗。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 方差分析 利用Design-Expert 8.0 軟件的中心組合設計，以A、B、C 為響應變量，IMP 溶解度為響應值，開展響應面試驗，試驗結果和回歸分析分別見表2、表3。得到回歸方程為：

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Design of response surface test scheme and results

表3 響應面回歸方程方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of response surface regression equation

由表3 可知，該模型P＜0.0001，R2=0.9736，失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型的顯著性較高，方程的可行性較好，該模型可用來預測制備IMP 的最優條件。根據表3 可知，各因素對IMP 溶解度影響的大小順序為C＞B＞A，模型中一次項A、B、C 對IMP溶解度的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。

2.2.2 交互作用對IMP 溶解度的影響 由圖2 可知，在因素較低水平條件下響應值隨著每個因素的增大而增大，當響應值增大到極值后，又逐漸減小。溶解度與AB、AC、BC 等高線均為橢圓形，AB 的交互作用圖橢圓形更明顯、曲面最陡，在兩兩因素的交互作用對溶解度大小的影響中，PAB=0.0017＜0.01，即AB 對IMP 溶解度的交互作用影響有極顯著影響。利用Design-Expert 8.0 軟件對反應條件進行優化組合，得到最佳工藝參數：反應溫度88.73 ℃、反應時間75.09 min、蛋白與糖質量比1:2.08，在此條件下菊粉修飾WPI 制備IMP 的溶解度為83.00%。考慮到實際實驗條件，最終調整工藝參數：蛋白與糖質量比1:2、反應溫度89 ℃、反應時間75 min。實驗進行3 次取平均值，得到的溶解度為83.00%±0.37%，與模型相符，說明通過響應面優化IMP 的制備條件是可行的，所得優化工藝條件可靠。

圖2 影響IMP 溶解度的各個因素之間的交互作用圖Fig.2 Interaction between factors affecting the solubility of modified protein of inulin

2.3 接枝度與褐變度的測定

接枝度和褐變度可以用來判斷糖基化反應發生的程度。由表4 可知，經工藝優化后IMP 的接枝度為41.73%，IMP 的褐變度為0.29。說明WPI 與菊粉發生的糖基化反應較為充分。同時糖基化反應伴隨著褐色產物的產生，但褐變程度低，糖基化反應生成的高級產物較少。反應結果與Zhang 等[21]的研究結果相似。

表4 IMP 的接枝度與褐變程度Table 4 Grafting degree and browning degree of IMP

2.4 結構性質

2.4.1 掃描電鏡 從圖3 可以看出，相同放大倍數下，WPI 呈大小不一的散落小顆粒狀堆積結構或塊狀結構，H-WPI 呈現破碎的細小片狀結構，出現大量不規則碎片，這主要是因為原來包埋在WPI 內部的疏水基團外露，表面疏水性增加，蛋白質分子間會發生聚集反應，形成熱聚集體，從而導致表面結構的變化[22]。IMP 的結構變得更加規整，呈更大更厚的片狀結構。推測原因為WPI 與菊粉通過共價鍵結合形成大分子的共軛物，表面疏水性降低，親水的糖鏈和疏水的蛋白質部分整齊排列，發生大量的結合聚集現象，因此接枝物呈大塊狀，本實驗結果與張楨玉[23]的研究結果相似。

圖3 不同改性方法對WPI 微觀結構的影響Fig.3 Effect of different modification methods on the microstructure of walnut protein

2.4.2 紅外光譜分析 由圖4 可知，在3700～3200 cm-1波數范圍內IMP 相比于WPI 透過率下降，光譜強度明顯增強，表明糖分子與蛋白以共價鍵形式結合，-OH 的數量增多，游離-OH 的伸縮振動引起透過率的下降[24]。在1600～1700 cm-1波數范圍內，H-WPI、IMP 都發生了明顯的振動（主要是由C=O 伸縮振動），說明加熱處理和糖基化改性處理都使WPI 的二級結構發生了變化[25]。從圖中可以看出在1050 cm-1波數附近IMP 的透過率下降，吸收峰光譜強度明顯增強，是糖環存在的典型特征，這與李靈誠[26]的研究結果一致，表明菊粉與WPI 通過共價鍵結合，生成了糖環，發生了糖基化反應，因此導致蛋白分子側鏈振動。

圖4 不同改性方法對WPI 二級結構的影響Fig.4 Effect of different modification methods on the secondary structure of walnut proteins

2.4.3 內源熒光光譜分析 蛋白與糖發生糖基化反應會生成有色物質，而熒光物質是有色物質的前體物，在290 nm 的熒光激發波長下，以色氨酸為發射基團的熒光光譜可以準確地描述蛋白結構的改變以及氨基酸的損失[27]。由圖5 可以看出，在320 nm處WPI 與熒光反應最劇烈，H-WPI、IMP 的內源熒光光譜都低于WPI，這可能是由于核桃分離蛋白經過加熱處理后，使蛋白質的三級結構發生了改變，導致熒光強度降低[28]。IMP 的熒光光譜峰值波長出現明顯的紅移（2～3 nm）且IMP 熒光強度減弱程度最大，這可能是因為多糖鏈的存在，糖分子和蛋白分子之間發生了共價結合等相互作用，蛋白表面引入羥基對熒光產生屏蔽，導致其熒光減弱程度大[29]。

圖5 不同改性方法對WPI 內源熒光譜圖的影響Fig.5 Effect of different modification methods on the endogenous fluorescence spectra of walnut protein

2.5 功能特性

2.5.1 溶解度 由圖6 可知，WPI、H-WPI、IMP 在酸性環境中溶解度的變化不明顯，隨著pH 不斷增加，WPI、H-WPI、IMP 的溶解度都得到明顯的改善，這主要是因為堿性環境下提高了蛋白質與水分子的親和力，從而增加了溶解度。在pH 6～11 環境下，IMP、H-WPI 溶解度均明顯高于WPI，WPI 經過加熱處理后使得蛋白質內部結構暴露，結構更加疏松，從而H-WPI 溶解度變大。菊粉的加入使溶解度得到進一步提高，結果表明糖基化反應可以有效改善WPI 的溶解度，在pH 6～10 環境下效果改善最明顯。

2.5.2 起泡性、泡沫穩定性 由圖7 可知，WPI 改性后的起泡性和泡沫穩定性均顯著提升。IMP 的起泡性明顯增加，這主要是因為糖基化反應使產物溶解性提高，蛋白溶解性提高能夠促使大量蛋白分子擴散至氣/液界面，導致其起泡能力增加[27]。同時IMP 的泡沫穩定性也得到改善，這主要是因為添加的菊粉本身具有粘性，在空氣與水交界處會更容易形成薄膜從而減緩了水分的流失，增強了泡沫的穩定性[30]。

圖7 不同改性方法對WPI 起泡性、泡沫穩定性的影響Fig.7 Effect of different modification methods on foamability and foam stability of walnut protein

2.5.3 乳化性、乳化穩定性 由圖8 可知，H-WPI 的乳化性及乳化穩定性對比WPI 都得到較大程度的改善。說明加熱處理可以使蛋白分子的空間結構變的松散，溶解度得到提高，較高的溶解度可促進蛋白質在乳化相中的分散和吸附[31]，H-WPI 的乳化穩定性略高于IMP 主要原因可能是多糖的加入使界面的膜的機械強度增加，提高了粘彈性，但較H-WPI 不足夠支撐空間穩定。IMP 的乳化特性對比WPI 也得到較大程度的改善。隨著菊粉的加入，蛋白與糖形成了分子量更大的共價復合物，分散在油水界面上，產生了空間位阻效應，糖基化產物不易聚集，使液滴短時間內無法快速聚集，糖鏈的加入也增加了蛋白膜厚度，從而增加了IMP 的乳化性指數[32]。并且由于菊粉為多糖，分子量大，抑制蛋白分子聚集的能力更強，蛋白質的部分吸附能力和糖的高親水性相結合，導致在油水界面附近形成強溶劑化層，從而使乳液油滴具有空間穩定性[33]，所以乳化穩定性較WPI 提高顯著。

圖8 不同改性方法對WPI 乳化性、乳化穩定性的影響Fig.8 Effect of different modification methods on emulsifying property and emulsion stability of walnut protein

3 結論

糖基化改性可以改變核桃分離蛋白的結構，有效改善核桃分離蛋白在溶液中的分散性，增強蛋白質與水的結合作用并改善功能特性。本研究通過響應面優化制備條件后，制備的IMP 溶解度可達到83%，顯著提高了核桃蛋白的溶解性。同時，通過對IMP結構特性研究發現，其紅外光譜圖出現明顯特征峰的波動，內源熒光光譜圖出現明顯的紅移，熒光強度明顯降低，說明糖基化改性技術能夠改變WPI 的結構，并且使其功能特性獲得改善。以上試驗結果為研究糖基化改性制備核桃蛋白菊粉共軛物的結構及功能特性研究奠定了理論基礎，該研究有利于拓寬WPI 在食品工業應用范圍，有利于核桃產業的發展。然而目前關于糖基化改性核桃分離蛋白的研究還不夠深入，單糖、二糖以及其他多糖對WPI 的影響尚不全面，在未來可加強不同糖對糖基化改性WPI 的研究，運用超聲波或者微波等方法輔助糖基化改性進行研究以期獲得更高功能特性的產品，開發新型功能性食品。