超聲退火法制備抗性淀粉及其理化性質分析

曾徐睿，劉良忠, ，齊 婷，朱 哲

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023；2.武漢隆豐園生物科技有限公司，湖北武漢 430040）

抗性淀粉（resistant starch，RS）是一種兼具可溶性纖維與不可溶性膳食纖維特性的淀粉，其在人體內無法被消化，且相對普通膳食纖維具有更高的生理活性[1]。抗性淀粉被分為五大類，其中Ⅲ型抗性淀粉（resistant starch Ⅲ，RS3）是指回生淀粉，因其良好的功能和安全特性，被廣泛用于食品工業，并已成為一個研究熱點。

現今，制備抗性淀粉的方法有很多，研究人員多采用物理、化學及酶法，或單一或多重的方式制備得到高含量的抗性淀粉。其中物理法以其安全、環保的優勢被廣泛使用在食品工業中。超聲波處理（ultrasonic treatment）是一種高效、環保和安全的新興技術，可以通過改變淀粉的非晶態和結晶結構域來影響淀粉的理化和功能性質[2]。Ding 等[3]研究了超聲處理對回生淀粉消化性的影響，結果表明，在超聲波處理下，分子重排發生，容易形成新的有序結構，其緩慢消化特性和抗消化特性增加，從而提高了抗性淀粉含量。退火處理（annealing treatment）是一種物理性的淀粉改性技術，它是指在過量的水中對懸浮的淀粉進行一段時間的加熱處理。這個過程會導致淀粉鏈的重組，從而形成緊湊的、物理上不可滲透的結晶結構。這些結構使消化酶無法催化水解糖苷鍵，從而產生了抗性淀粉[4]。Chung 等[5]研究了退火對玉米抗性淀粉的影響，結果顯示經退火處理的玉米抗性淀粉含量從4.6%提升到了8.0%。Marboh 等[6]經退火處理豆科植物塊莖淀粉，使其抗性淀粉含量從11.3%提升至17.36%。Babu 等[7]探究超聲波退火雙重處理谷子淀粉對其功能和結構的影響，結果表明超聲退火雙重改性谷子淀粉使得抗性淀粉含量顯著提升至45.59%。綜上所述，超聲退火工藝以其安全、便利的優勢，在抗性淀粉工業化生產應用中擁有廣闊的前景。

糯米淀粉（waxy rice starch）因含有較高比例的支鏈淀粉，所以具有難回生，消化快等特點[8]。近年來，對糯性淀粉進行物理、化學以及酶法改性處理，多是為了降低其消化率，滿足人們對健康飲食的追求。脫支酶處理糯性淀粉會使支鏈淀粉分子被切割成直鏈淀粉分子，直鏈淀粉分子會重新結合生成RS3[9-11]。目前，研究人員大多選用直鏈淀粉含量較高的天然淀粉或人工育種提取的高直鏈淀粉，成本高且不易得。因此，選擇以糯米淀粉為原料，在酶法脫支的基礎上獲取更多直鏈淀粉，在一定程度上可以降低原料成本，也可以為后續制備抗性淀粉提供便利。本研究以經普魯蘭酶脫支預處理的糯米淀粉為原料，采用超聲退火法制備糯米抗性淀粉。運用單因素實驗和響應面分析法獲得制備抗性淀粉的最佳工藝條件，并對所制備的抗性淀粉進行理化性質分析，為糯米抗性淀粉工業化生產及其在功能性食品中的應用提供理論支持。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

糯米淀粉 無錫金農生物科技有限公司；醋酸鈉、乙酸、氫氧化鉀、無水乙醇等 國藥集團化學試劑有限公司；普魯蘭酶Promozyme D6（4000 NPUN/g）諾維信（中國）生物技術有限公司；K-RSTAR 抗性淀粉試劑盒 愛爾蘭Megazyme 公司。

HZ150L 恒溫培養搖床 武漢瑞華儀器設備有限責任公司；7200 型分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；230HT 超聲波處理儀 深圳潔拓超聲波清洗設備有限公司；ZEISS Gemini 300 掃描電鏡

德國卡爾蔡司公司；Frontier 傅里葉紅外光譜儀美國鉑金埃爾默公司；Q2000 差示掃描量熱儀 美國TA 儀器公司；SmartLab SE X 射線衍射儀 日本株式會社理學。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗性淀粉制備方法 將適量糯米淀粉用pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制成18.5%的淀粉乳溶液，沸水浴糊化30 min 后，在121 ℃下高壓30 min。隨后，在淀粉糊中加入普魯蘭酶（160 NPUN/g）并在60 ℃下脫支24 h。沸水浴滅酶完成后放入45 ℃貯藏24 h[12]，然后轉移至45 ℃烘箱中烘干，獲得脫支回生糯米淀粉樣品。取適量上述脫支回生糯米淀粉樣品，配制成一定濃度的淀粉乳，放入超聲波處理儀中處理一段時間，接著在一定溫度的恒溫搖床中進行退火處理。超聲退火完成后的淀粉乳在45 ℃下保存24 h。45 ℃烘干、粉碎、過篩獲得超聲退火糯米RS3。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 水分含量對糯米RS3含量的影響 稱取5 g脫支回生淀粉樣品，在超聲功率為120 W 的條件下，固定超聲時間20 min，退火溫度55 ℃，退火時間24 h，調節水分含量為50%、60%、70%、80%、90%，研究水分含量對超聲退火糯米RS3得率的影響。

1.2.2.2 超聲時間對糯米RS3含量的影響 稱取5 g脫支回生淀粉樣品，在超聲功率為120 W 的條件下，固定水分含量70%，退火溫度55 ℃，退火時間24 h，設置超聲時間為0、10、20、30、40 min，研究超聲時間對超聲退火糯米RS3得率的影響。

1.2.2.3 退火溫度對糯米RS3含量的影響 稱取5 g脫支回生淀粉樣品，在超聲功率為120 W 的條件下，固定水分含量70%，超聲時間20 min，退火時間24 h，研究退火溫度50、55、60、65、70 ℃對超聲退火糯米RS3得率的影響。

1.2.2.4 退火時間對糯米RS3含量的影響 稱取5 g脫支回生淀粉樣品，在超聲功率為120 W 的條件下，固定水分含量70%，超聲時間20 min，退火溫度55 ℃，研究退火時間8、16、24、32、40 h 對超聲退火糯米RS3得率的影響。

1.2.3 響應面法優化制備糯米RS3工藝條件 在單因素實驗的基礎上，通過Box-Behnken 試驗設計，選定水分含量、超聲時間、退火溫度、退火時間4 個因素作為目標變量，抗性淀粉含量為響應值，設計四因素三水平的響應面試驗，試驗因素及水平如表1 所示。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.4 抗性淀粉含量測定 抗性淀粉含量測定依據AOAC2002.02 檢測。計算公式如下：

抗性淀粉含量＞10%：

式中：ΔE表示相對于空白試劑的吸光度值；F 表示從吸光度值到微克的轉換（F=100/100 μg D-葡萄糖的GOPOD 吸光度值）；W 表示分析樣本的干重。

1.2.5 理化性質分析

1.2.5.1 透明度 參考牛博文等[13]的方法，配制1%（w/v）的淀粉乳溶液，在沸水中加熱攪拌15 min，自然冷卻。在620 nm 下，以蒸餾水為空白對照設其透光率為100%，檢測淀粉糊的透光率。

1.2.5.2 溶解度和膨脹能力 參考許美娟[14]的方法稍作修改，配制2%（w/v）的淀粉乳，分別置于50、60、70、80、90 ℃水浴中攪拌30 min，自然冷卻。4500 r/min 離心15 min。將上清液于105 ℃烘干并恒重記為m1，沉淀物稱重記為m2，計算公式如下：

式中：m1為上清液中溶出物質量，g；W 表示樣品干重，g；m2表示離心沉淀物質量，g。

1.2.5.3 掃描電鏡觀察微觀結構 取適量樣品粘到導電膠上，并噴金。使用ZEISS Gemini 300 掃描電子顯微鏡拍攝樣品形貌，拍攝時加速電壓為3 kV，放大1000 和5000 倍。

1.2.5.4 紅外光譜分析 參考吳怡瑾等[15]并稍作修改，采用傅里葉紅外光譜儀進行測定。分辨率為 4 cm-1，掃描次數為32 次，采集范圍為400～4000 cm-1。

1.2.5.5 熱穩定性分析 稱取3 mg 淀粉樣品置于鋁坩堝內并加入9 μL 去離子水，密封后，在室溫下平衡24 h，采用差示掃描量熱儀進行檢測，測定溫度范圍20～130 ℃；升溫速率為10 ℃/min。

1.2.5.6 晶體結構分析 將粉末樣品置于載玻片上，使用X 射線衍射儀進行測試，測試范圍為5°～50°，掃描速度為5 °/min，光源為Cu-Kα射線，管電壓是40 kV，電流是40 mA。

1.3 數據處理

做3 次平行試驗，采用Origin 8.5、SPSS Statistics 19 與Design Expert 8.0.6 進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 水分含量對糯米RS3含量的影響 如圖1 所示，當其他工藝條件不變時，水分含量在50%～80%時，抗性淀粉含量相對較高。隨著水分含量不斷增加，抗性淀粉含量呈現先增加再減少的趨勢，其中當水分含量為70%時，糯米抗性淀粉含量達到最大峰值，為43.50%，原因是淀粉材料結晶生成抗性淀粉是直鏈淀粉分子通過氫鍵結合形成雙螺旋結構而成，淀粉乳的水分含量越低，其粘度越高，結晶受到限制，故形成的抗性淀粉含量偏低[16]。水分含量過高，直鏈淀粉分子之間相互作用的機會變少，也會造成抗性淀粉含量下降。

圖1 水分含量對糯米RS3 含量的影響Fig.1 Effect of water content on the yield of resistant starch from waxy rice

2.1.2 超聲時間對糯米RS3含量的影響 如圖2 所示，當其他工藝條件不變時，超聲時間在10～30 min時，抗性淀粉含量相對較高。隨著超聲時間的延長，抗性淀粉得率呈現先增加再減少的趨勢。當超聲時間為20 min 時，糯米RS3含量達到最大，為43.80%。超聲過程中會發生氣泡生長，膨脹、破碎的動態過程，氣泡破裂瞬間會產生巨大的壓力，在壓力的作用下切斷淀粉分子鏈[17]。在0～20 min 內，隨著超聲時間的延長，直鏈淀粉分子增多，增加了淀粉分子間相互作用的機會，促進了抗性淀粉的形成，使抗性淀粉含量從38.90%增長至43.80%。而超過20 min 抗性淀粉含量逐漸下降的原因可能是，超聲過程中產生的線性短鏈阻礙了直鏈淀粉分子之間的相互作用，抑制雙螺旋結構的形成[18]。

圖2 超聲時間對糯米RS3 含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of resistant starch from waxy rice

2.1.3 退火溫度對糯米RS3含量的影響 如圖3 所示，當其他工藝條件不變，在退火溫度為50～70 ℃的范圍內，抗性淀粉含量首先隨溫度升高而增加，并在55 ℃時有最大的抗性淀粉含量，為43.44%。而后，抗性淀粉含量不斷下降，直至37.40%。超過55 ℃抗性淀粉含量開始下降，原因是溫度過高，淀粉分子間的作用力被破壞，淀粉與水分子之間的作用力增強，使淀粉晶體發生凝膠化[19]。

圖3 退火溫度對糯米RS3 含量的影響Fig.3 Effect of annealing temperature on the yield of resistant starch from waxy rice

2.1.4 退火時間對糯米RS3含量的影響 如圖4，當其他工藝條件不變時，退火時間在8～24 h 時，抗性淀粉含量從30.17%逐漸增加至43.61%，原因是退火處理能促進淀粉分子間的相互作用，易生成完美晶體結構，其抗性淀粉含量隨之提升，Zhu 等[20]探究了退火處理對葛根淀粉消化率的影響，也得出了類似的結果。而當退火時間在24～40 h 時，抗性淀粉含量緩慢下降至40.62%，可能的原因是部分不完美晶體隨著處理時間的延長而發生熔融，穩定晶體結構的分子作用力減弱，導致抗性淀粉含量減少[21]。

圖4 退火時間對糯米RS3 含量的影響Fig.4 Effect of annealing time on the yield of resistant starch from waxy rice

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面優化結果分析 根據單因素實驗結果，選擇水分含量（A）、超聲時間（B）、退火溫度（C）、退火時間（D）為變量，抗性淀粉含量為響應值（Y）進行響應面優化分析，響應面試驗結果如表2 所示。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design

2.2.2 模型建立及顯著性分析 利用 Design-Expert 8.0.6 對表2 中的數據進行多元回歸擬合分析，得到回歸方程為：Y=43.50-0.77A+0.37B+0.41C+0.48D+0.13AB-0.30AC-0.14AD-0.11BC-0.15BD+0.14CD-1.57A2-0.48B2-3.62C2-1.28D2。試驗數據方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

如表3 所示，響應面多元回歸擬合模型極顯著（P＜0.01），失擬性檢驗不顯著（P=0.9140＞0.05），R2為0.9284，表明模型選擇合適。因此，能夠運用該模型來描述各變量與抗性淀粉含量的關系。依據表3中的F值大小可以看出四個因素影響抗性淀粉含量的主次順序為：水分含量（A）＞退火時間（D）＞退火溫度（C）＞超聲時間（B），據P值可知，水分含量A 與A2、C2、D2對抗性淀粉含量的影響是極顯著的（P＜0.01）。超聲時間B、退火溫度C、退火時間D 的P值均大于0.05，表明這3 個因素對抗性淀粉含量無顯著影響。

2.2.3 響應面優化及驗證試驗 利用Design-Expert 8.0.6 軟件，作出各因素間的交互作用對抗性淀粉含量影響的曲面圖及等高線圖。根據上述回歸擬合方程，固定任意2 個因素，得到另外2 個因素繪制的響應面曲線和等高線圖。響應面圖均為開口朝下的凸型曲面，有抗性淀粉含量極大值點。等高線圖多呈現近圓形，且交互項P值均大于0.05，意味著兩兩因素之間交互作用影響不顯著[22]。

根據模型擬合出的最佳的工藝條件為：水分含量67.54%，超聲時間23.13 min，退火溫度55.33 ℃、退火時間25.47 h。在該條件下的預測值為43.71%。實際操作時將條件調整為：水分含量68%，超聲時間23 min，退火溫度55 ℃，退火時間25 h。在此條件下進行驗證試驗的抗性淀粉含量為45.61%±0.95%，與理論的預測值相近，相對誤差為4.34%。由此可見，利用響應面分析法優化抗性淀粉工藝條件是合適的。

2.3 理化性質分析

2.3.1 透明度分析 淀粉樣品的透明度與淀粉中直鏈淀粉含量、膨脹能力以及膨脹和未膨脹殘留顆粒水平有關[23]。如表4 所示，超聲退火糯米RS3與糯米淀粉相比淀粉糊透明度從9.53%明顯提升至47.72%，造成這種現象的原因是普魯蘭酶脫支破壞了原淀粉的淀粉表面及結晶區，從而導致淀粉與水結合作用的增強，淀粉分子間的作用力減弱[24]；超聲波能增強樣品的機械振動，有助于更多空氣通過液體介質產生更多空化核，增強其對淀粉的作用效果，淀粉與水分子間締合能力增強，從而減少了光的折射和反射，使淀粉糊透明度提高[25]。

表4 糯米淀粉與其制備的糯米RS3 理化性質比較Table 4 Comparison of physicochemical properties of waxy rice starch and resistant starch

2.3.2 溶解度和膨脹能力 以10 ℃為間隔測定糯米淀粉與超聲退火糯米RS3在50～90 ℃的溶解度和膨脹能力如表4 所示。當溫度從50 ℃升至90 ℃，糯米淀粉的溶解度從0.64%上升至6.03%，糯米RS3從23.42%增至52.45%；相應地，其膨脹能力也分別從2.24 和3.23 g/g 增加到41.04 和6.38 g/g。由此可知，所有淀粉樣品的溶解度和膨脹能力隨溫度的升高隨之上升。這是由于淀粉分子內的作用力隨溫度升高被削弱，因此加速了直鏈淀粉浸出并促進顆粒膨脹[14]。同時，因為淀粉受普魯蘭酶脫支前處理和超聲波作用的影響導致大量線性葡聚糖的產生，而高比例的可溶性短鏈葡聚糖會直接導致溶出量增加。因此，在50～90 ℃下，糯米RS3溶解度均高于糯米淀粉的溶解度，其中在90 ℃下糯米淀粉和糯米RS3有最大的溶解度，分別為6.03%和52.45%。在50～60 ℃的較低溫度下糯米淀粉膨脹能力低于超聲退火糯米RS3，而在較高溫度（70～90 ℃）下卻呈現相反的結果，其中糯米淀粉在60～70 ℃下的變化尤為明顯，從2.81 g/g 升至32.07 g/g，原因是淀粉的溶脹行為是由于支鏈淀粉的膨脹而引起的[26]，在未達到淀粉的糊化溫度以前，淀粉分子與水的結合作用受溫度影響較小，而當到達糊化溫度以后因糯米淀粉含有大量的支鏈淀粉，其淀粉顆粒易溶脹、崩潰，因此膨脹能力高于糯米RS3。

2.3.3 掃描電鏡分析 利用掃描電鏡（SEM）研究了糯米淀粉與經超聲退火制備的糯米RS3的顆粒表面形態，如圖5。糯米淀粉顆粒形狀呈現為不規則多邊形，其表面較光滑，顆粒直徑多在3～8 μm。與原淀粉相比，糯米抗性淀粉顆粒形狀呈現出明顯的差異，其表面粗糙多孔，顆粒直徑大小不一。這可能是酶解和超聲波空化作用產生大量直鏈淀粉，而退火處理能使直鏈淀粉聚集形成螺旋復合體，Babu 等[27]認為這種現象會增強晶體結構，從而提高其抗酶解能力。

圖5 糯米淀粉與糯米RS3 的掃描電子顯微鏡圖Fig.5 SEM of waxy rice starch and resistant starch

2.3.4 傅里葉紅外光譜分析結果 為了探究超聲退火法制備糯米RS3對其短程有序結構的影響，如圖6 所示，顯示了糯米淀粉、糯米RS3的FT-IR 光譜（圖6a）及1200～800 cm-1的去卷積圖譜（圖6b）。如圖6a 兩種淀粉的吸收峰都很相似，證明超聲退火法沒有明顯改變其化學基團。圖6b 淀粉紅外吸收光譜中1047 和1022 cm-1處的特征峰表示淀粉的結晶區與非結晶區。1047 與1022 cm-1的比值來描述淀粉的有序程度，抗性淀粉的含量越高其有序程度越高，故該比值越大[28]。糯米淀粉與超聲退火糯米RS3的1047 與1022 cm-1的比值分別為1.284，1.671，顯然，糯米RS3比糯米淀粉的1047/1022 的值要大，說明超聲退火工藝能促進形成更多雙螺旋結構，使超聲退火糯米RS3擁有更多短程有序結構。

圖6 糯米淀粉和糯米RS3 傅里葉紅外光譜圖（a）和去卷積圖（b）Fig.6 FT-IR spectra (a) and deconvolution graph (b) of waxy rice starch and resistant starch

2.3.5 熱穩定性分析 由表5 可知，相較于糯米原淀粉，糯米RS3的起始糊化溫度（T0）、峰值溫度（Tp）和終止溫度（Tc）均有小幅提升。這是因為超聲退火處理能促進淀粉的重結晶，生成抗性淀粉。而晶體結構周圍的的無定型區可能受其影響，難與水形成氫鍵[29]，故導致糊化溫度升高。同時，糯米淀粉和糯米RS3的糊化焓分別為11.91 和16.96 J/g，經超聲退火處理的糯米RS3的焓值明顯高于原淀粉，這是因為退火處理使雙螺旋結構之間形成了更多氫鍵，增強了晶體結構[30]，說明要破壞其晶體結構就需要更多能量。由此可知，超聲退火法制備的糯米RS3有較高結晶度的晶體結構和良好的熱穩定性。

表5 淀粉樣品的熱特性參數Table 5 Thermal properties of native starch and resistant starch

2.3.6 X 射線衍射分析 通過X-射線衍射我們可以判斷淀粉的晶型和計算其結晶度。如圖7 所示，糯米淀粉在15°、17°、18°、23°的位置出峰，可以判斷糯米淀粉為典型的A 型晶體，而糯米RS3在15°、17°、22°、24°的位置有特征峰，為典型的B 型晶體，并在20°的位置出現了一個弱衍射峰，表現為V 型晶體，說明有淀粉-脂質復合物的存在，通常認為，是直鏈淀粉的長鏈在回生過程中在固有脂質分子上卷曲而形成的復合體[31]。由此表明，經超聲退火制備的糯米抗性淀粉改變了淀粉的原有晶型，且糯米RS3的結晶度為41.8%明顯比糯米原淀粉的30.0%高，說明超聲退火制備的糯米抗性淀粉具有較高的結晶度，這與DSC 的結果一致。不同的晶體形態會顯示出不同的酶解性質，其中V 型晶體抗酶解能力最強，A 型最弱[32]。由此可知，糯米RS3由抗酶解能力較弱的A 型轉變為了更耐酶解的B+V 型。

圖7 糯米淀粉和糯米RS3 X 射線衍射圖譜Fig.7 X-ray spectra of waxy rice starch and resistant starch

3 結論

本研究以普魯蘭酶脫支前處理的糯米淀粉為原料，采用超聲退火法制備糯米RS3。經響應面試驗設計優化得出的最佳工藝條件為：水分含量68%，超聲時間23 min，退火溫度55 ℃，退火時間25 h。在此條件下制備的抗性淀粉含量為45.61%±0.95%。糯米RS3的透明度和溶解度較原淀粉均有較大提升，但膨脹能力有所下降。掃描電鏡顯示，超聲退火處理破壞了淀粉顆粒形狀，使糯米RS3呈現粗糙多孔結構。通過紅外光譜、DSC 和XRD 等分析證實，該工藝可促進生成抗性淀粉、優化結晶晶型、提高結晶度，使糯米RS3具有良好的熱穩定性。本研究可為超聲退火法制備糯米RS3的工業化生產提供相應的理論依據，而具有良好功能特性的RS3未來可作為功能性食品配料應用于食品工業中。但現階段制備的RS3含量還未達到預期，有待日后研究并進一步提高。