菊芋中抗氧化成分的在線鑒定和構效關系分析

張志毅，白若熙，宗愛珍，張敏敏，鄭振佳，張 斌,

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東泰安 271018；

2.山東省農業科學院農產品加工與營養研究所，山東濟南 250012；3.齊魯工業大學（山東省科學院）山東省分析測試中心，山東濟南 250014）

菊芋（Helianthus tuberosusL.）為多年生菊科向日葵屬宿根生草本植物，又名姜不辣、洋姜、鬼子姜等[1]，我國各地均有種植[2]。菊芋中含有菊糖（菊粉）、酚酸類和萜類物質等多種生物活性成分[3-5]，具有抗氧化[6-7]、抗炎[8]、抗癌[9]、預防治療“三高”[10-12]以及改善腸道微生態等作用[13-14]。咖啡酰奎寧酸類化合物是菊芋中主要酚酸，具有較強的抗氧化能力[15-16]，其酚羥基與自由基容易發生反應，可以快速清除羥基自由基以及過氧自由基[17]，抑制脂質過氧化反應[18]，提高谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性[19]。菊芋中咖啡酰奎寧酸類化合物的相關報道多集中在菊芋莖葉中，菊粉的相關報道多集中在菊芋塊莖，而塊莖中的咖啡酰奎寧酸類化合物鮮有報道。

菊芋中酚酸目前多采用高效液相色譜、液相色譜-質譜法進行定量和定性分析，定向篩選并鑒定具有抗氧化活性成分的研究較少[20-21]。基于DPPH 篩選模型的高效液相色譜-飛行時間質譜聯用（high performance liquid chromatography-quadrupole timeof-flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）的方法可以在線篩選鑒別自由基清除劑，通過抗氧化成分與DPPH 反應在517 nm 處形成的負峰，篩選出菊芋中咖啡酰奎寧酸類化合物，通過飛行時間質譜獲得物質的精確分子量進行定性，從而實現樣品中成分的準確、快速鑒定[22]。鄭振佳等[23]通過HPLC-DAD-QTOF-MS 在牛蒡中篩選出綠原酸、咖啡酸、1,5-O-二咖啡酰奎寧酸等19 種咖啡酰奎寧酸類化合物及其衍生物。Hu 等[24]通過DPPH-HPLC-ESI-MS 在線篩選出十大功勞葉乙酸乙酯相中綠原酸、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷3 種化合物。該方法選擇性強，靈敏度與分辨率高于傳統方法，分析結果更精準。

本研究以菊芋為研究對象，通過高分辨質譜結合在線清除DPPH 自由基模型篩選鑒別菊芋中咖啡酰奎寧酸類成分，并評價此類成分單體的抗氧化活性，為菊芋的成分分析、功能研究和產品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊芋干片 購于河北晉州；DPPH 美國Sigma公司；甲醇（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、石油醚（分析純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純） 天津凱通化學試劑有限公司；純凈水 娃哈哈集團有限公司；硫酸亞鐵 化學純，博山化學試劑廠；水楊酸 分析純，上海源葉生物科技有限公司；ABTS 超純，上海麥克林生化科技有限公司；過硫酸鉀 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；Tris-HCl 緩沖液、鄰苯三酚 北京索萊寶科技有限公司；咖啡酸、綠原酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸標準品 上海源葉生物科技有限公司。

SECURA224-ICN 電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司；Rigol L-3000 泵 北京普源精電科技有限公司；Thermo Fisher UltiMate 3000 高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾公司；Waters ACQUITY UPLC H-CLASS 超高效液相色譜儀 美國沃特世公司；Bruker impact Ⅱ高分辨飛行時間質譜儀 德國布魯克科技有限公司；SPECTRAMAX M5 多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液及DPPH 自由基溶液制備 將菊芋粉碎后過60 目篩，稱取1.0 g 樣品，加入10 mL 95%乙醇回流提取30 min，過濾后取上清液，旋轉蒸發去除乙醇。參考袁曉艷等[4]的方法，依次用3 倍體積的石油醚和乙酸乙酯萃取后濃縮。取少許乙酸乙酯相吹干，甲醇復溶，過0.22 μm 有機濾膜，備用。精密稱定DPPH 標準品，用80%乙腈配制成濃度為6×10-5mol/L 的DPPH 自由基溶液備用，于4 ℃下儲存備用。

1.2.2 抗氧化成分在線篩選和鑒別 參考張敏敏等[25]試驗方法，采用Thermo Fisher U 3000 雙元三液相色譜系統進行目標組分的篩選和鑒別，柱后流出液與L-3000 泵中流出的DPPH 自由基溶液在反應池中反應后，在517 nm 波長下進行檢測，通過紫外檢測器在517 nm 波長處形成負峰并通過質譜進行分析。通過獲取的精確分子量結合DPPH 自由基清除的液相色譜圖實現菊芋中目標化合物的在線篩選與鑒定。

1.2.2.1 液相色譜工作條件 Waters X-Bridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-水（0.1%甲酸），梯度洗脫：0～9 min（13%A），9～10 min（13%～20%A），10～23 min（20%A），23～28 min（20%～30%A），28～33 min（30%～40%A）；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：3 μL；檢測波長：280、320 nm。

1.2.2.2 DPPH 溶液反應工作條件 反應器為PEEK盤管（10 m×0.25 mm）；流動相為DPPH 自由基溶液，流速0.5 mL/min，檢測波長517 nm。

1.2.2.3 質譜工作條件 參考張敏敏等[22]的方法，電噴霧離子源，分別采用電噴霧正離子及負離子模式；噴霧壓力310 kPa；毛細管電壓5000 V；干燥氣溫度200 ℃；干燥氣流速8 L/min；錐孔電壓60 V；裂解電壓120 V；檢測范圍為m/z 50～1500。

1.2.3 咖啡酰奎寧酸類化合物抗氧化活性評價

1.2.3.1 DPPH 自由基清除實驗 參考徐小博等[26]的方法并稍作修改，分別取1 mL 不同質量濃度的咖啡酰奎寧酸類化合物標準品溶液（0、10、20、30、40、50 μg/mL）于試管中，加入等體積的1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，混勻，室溫避光反應30 min，用酶標儀于517 nm 下測定吸光值A1。以不同質量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，測定其DPPH 自由基的清除能力。按以下公式計算DPPH 自由基的清除率。

式中：A1：反應后樣品溶液的吸光值；A2：樣品溶液自身的吸光值；A0：空白對照的吸光值。

1.2.3.2 ABTS+自由基清除實驗 參考徐小博等[26]的方法并稍作修改，稱取0.1943 g ABTS 和0.0323 g過硫酸鉀，分別用15 mL 蒸餾水溶解，混合并定容至50 mL，在室溫下放置12～16 h 得到ABTS+溶液。將ABTS+溶液用無水乙醇稀釋至吸光值為0.70±0.02（734 nm）備用。分別取0.2 mL 不同質量濃度的咖啡酰奎寧酸類化合物標準品溶液（0、10、20、30、40、50 μg/mL）于試管中，加入1.8 mL ABTS+溶液，混勻，室溫避光反應6 min，用酶標儀于734 nm下測定吸光值A1。以不同質量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，測定其ABTS+自由基的清除能力。參考“1.2.3.1”公式計算ABTS+自由基的清除率。

1.2.3.3 超氧陰離子自由基清除實驗 參考劉英等[27]的方法并稍作修改，分別取1 mL 不同質量濃度的咖啡酰奎寧酸類化合物標準品溶液（0、20、40、60、80、100 μg/mL）于試管中，加入4.5 mL 的Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH8.2），混勻，25 ℃水浴反應20 min，隨后加入0.4 mL 的1 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，25 ℃反應6 min，立即加入1 mL 0.12 mol/L 的鹽酸終止反應，用酶標儀于320 nm 下測定吸光值A1。以不同質量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，測定其超氧陰離子自由基的清除能力。參考“1.2.3.1”公式計算超氧陰離子自由基的清除率。

1.3 數據處理

抗氧化活性評價實驗重復三次，采用Origin 2017 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 菊芋咖啡酰奎寧酸類化合物的提取與液相分析條件優化

樣品經95%乙醇回流提取后，成分較復雜，影響質譜分析的效果，因此需要對樣品進行前處理。根據參考文獻，咖啡酰奎寧酸主要存在于乙酸乙酯相中，先用石油醚脫除脂類成分，然后用乙酸乙酯進行萃取[23]。咖啡酰奎寧酸類化合物的最大吸收波長在280 和320 nm 附近，在兩個波長下同時具有較高紫外吸收的組分可能為該類化合物，從圖1 菊芋乙酸乙酯相液相色譜圖發現，菊芋中含量較多的組分在280 和320 nm 均有較高的吸收峰，推測可能為咖啡酰奎寧酸類化合物。

圖1 菊芋樣品液相色譜圖Fig.1 HPLC of Jerusalem artichoke

2.2 抗氧化成分在線篩選

在280 和517 nm 條件下進行色譜分析和在線抗氧化篩選，結果見圖2。從圖中可以看出色譜峰的分離程度和峰形較好，且響應值強度適中，可以滿足抗氧化成分的在線篩選。通過“2.4”結合對照品共鑒定出該樣品中含量較高且具有抗氧化作用的活性成分有5 種。

圖2 菊芋提取物（280 nm）與在線清除自由基（517 nm）HPLC 圖Fig.2 HPLC of Jerusalem artichoke extract (280 nm) and online radical scavenging (517 nm)

2.3 MS 條件優化結果

分別考察了正、負離子模式下樣品的總離子流圖，結果見圖3。通過對比發現樣品在負離子模式下響應值優于正離子模式，雜質較少，因此選取負離子模式為質譜檢測條件。

圖3 正離子模式及負離子模式下總離子流圖Fig.3 Total ion current diagram in positive and negative ion mode

2.4 菊芋中咖啡酰奎寧酸類化合物的鑒別

在負離子模式下進行質譜掃描，通過精確分子量信息與相關文獻比對初步推斷5 種抗氧化活性成分中有1 種單咖啡酰奎寧酸、3 種二咖啡酰奎寧酸以及咖啡酸。對負離子模式下測得的碎片峰信息與咖啡酰奎寧酸類化合物在負離子模式下的相對分子質量進行對比，抗氧化成分分析結果見表1。化合物1 保留時間為6.1 min，在負離子模式下m/z 為353.0874，參考相關文獻可以推斷化合物1 為單咖啡酰奎寧酸，其中綠原酸存在范圍較廣，可能性最大，推測化合物1 為綠原酸[23]。化合物2 保留時間為9.6 min，在負離子模式下m/z 為179.0254，參考相關文獻可以推斷為咖啡酸[23]。化合物3、4、5 保留時間依次為18.0、19.2、22.7 min，在負離子模式下m/z 依次為515.1168、515.1188、515.1182，二咖啡酰奎寧酸的理論質譜信號為515.1195[M-H]-，通過參考相關文獻分析，推斷3 種化合物均為二咖啡酰奎寧酸[23]。與實驗室購置的標準品進行對照后，確認峰1～5 依次為綠原酸、咖啡酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸。

表1 菊芋乙酸乙酯相提取物的HPLC-Q-TOF-MS 分析結果Table 1 HPLC-Q-TOF-MS analysis results of ethyl acetate phase extract of Jerusalem artichoke

2.5 體外抗氧化實驗結果

2.5.1 DPPH 自由基清除能力 如圖4 所示，5 種咖啡酰奎寧酸類化合物均有很強的DPPH 自由基清除能力。在0～50 μg/mL 范圍內，DPPH 自由基清除率與化合物濃度呈劑量效應關系。當濃度為10 μg/mL和20 μg/mL 時，咖啡酸對DPPH 自由基的清除率大于其他組分，當濃度為50 μg/mL 時，各化合物對DPPH 自由基的清除率均在94%以上，其中咖啡酸的清除效果最好，為95.43%。

圖4 咖啡酰奎寧酸類化合物對DPPH 自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of caffeoylquinic acids on DPPH free radicals

2.5.2 ABTS+自由基清除能力 如圖5 所示，5 種咖啡酰奎寧酸類化合物對ABTS+自由基均有較強的清除能力。當化合物濃度為0～50 μg/mL 時，與ABTS+自由基清除率呈正相關，當濃度為10 μg/mL 時，5 種化合物對ABTS+的清除能力均大于陽性對照組VC。其中咖啡酸ABTS+自由基清除活性在各濃度下均優于其他組分，當濃度為50 μg/mL 時，VC、咖啡酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、綠原酸的ABTS+自由基清除率分別為71.97%、69.63%、54.17%、51.91%、49.61%、41.43%。

圖5 咖啡酰奎寧酸類化合物對ABTS+自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of caffeoylquinic acids on ABTS+free radicals

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力 如圖6 所示，5 種咖啡酰奎寧酸類化合物對超氧陰離子自由基均有一定的清除能力。在0～100 μg/mL 范圍內，化合物濃度與超氧陰離子自由基清除率呈正相關，當濃度為50 μg/mL 時，VC、綠原酸、咖啡酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸的超氧陰離子自由基清除率分別為84.21%、51.40%、51.12%、49.15%、47.18%、46.77%。

2.5.4 體外抗氧化活性分析 采用雷達圖對5 種咖啡酰奎寧酸類化合物的抗氧化活性進行分析。當濃度為40 μg/mL 時，5 種咖啡酰奎寧酸類化合物的抗氧化能力如圖7 所示，綠原酸、咖啡酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸的DPPH 清除率與VC十分接近，均在95%附近。以上篩選出的化合物富含豐富的酚羥基，保證了提供質子的能力，從而達到清除DPPH 自由基的效果[28]；此外還表現出較好的ABTS+自由基清除效果，其中，咖啡酸清除率與VC相當，除咖啡酸外，其他4 種化合物清除率均略低于VC；以上5 種化合物超氧陰離子清除率均低于VC，這與劉英等[27]的研究結果類似。多酚類化合物的抗氧化活性主要取決于其B 環上的鄰二羥基，抗氧化活性的強弱與酚羥基和自由基反應可否形成穩定的半醌式自由基結構有關[29]。總體來看，咖啡酰奎寧酸類化合物具有很高的自由基清除能力，咖啡酸對DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基3 種自由基的清除效果最好，其次是3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸，而3,5-O-二咖啡酰奎寧酸對3 種自由基的清除率略低，這可能是因為C4 位置被咖啡酰基酯化的奎寧酸比在C3 或C5 位置上顯示出更高的抗自由基活性，該結果與Tamayose 等[15]的報道相類似；此外，Li 等[30]的研究指出，對于二咖啡酰奎寧酸類化合物來說，含有相鄰的兩個咖啡酰基團（3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸）相比含有相互遠離的兩個咖啡酰基團（3,5-O-二咖啡酰奎寧酸）能表現出更好的抗氧化活性，這可能是因為分子間擁擠的程度會增加分子的能量，從而提高氧化還原電位，相反的，兩個相互遠離的分子之間能量較低，其抗氧化電位也隨之降低。

圖7 咖啡酰奎寧酸類化合物的抗氧化活性Fig.7 Antioxidative activity of caffeoylquinic acids

3 結論

本研究建立了在線鑒定菊芋中咖啡酰奎寧酸類化合物的方法，確定了菊芋乙酸乙酯相中5 種抗氧化活性成分，結合質譜數據、參考文獻并采用標準品對照后，確認菊芋中含有綠原酸、咖啡酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸5 種咖啡酰奎寧酸類化合物。抗氧化實驗表明5 種咖啡酰奎寧酸類化合物有良好的清除DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基的能力，其中咖啡酸的效果最好，分別為95.43%、69.63%、51.12%，其余4 種組分的清除效果略低于咖啡酸，這可能與咖啡酰基酯化位點的差異及酚羥基數目有關。本方法具有快速、準確、篩選效率高等優點，為建立快速、在線的菊芋中咖啡酰奎寧酸化合物的檢測方法提供技術支撐，同時為咖啡酰奎寧酸類化合物的開發利用及抗氧化產品研發提供理論支撐。