黃精多糖理化性質(zhì)及其對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠氧化損傷的保護(hù)作用

劉 旺，白金波，張王娟，劉春陽(yáng)，李木子，張金和，徐國(guó)兵，解松子,

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230012；2.中藥研究與開(kāi)發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230012；3.中藥飲片制造新技術(shù)安徽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230012；4.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230012）

《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“黃精，味甘、平、無(wú)毒，主補(bǔ)中益氣，除風(fēng)濕，安五臟，久服輕身，延年不饑”[1]。《中國(guó)藥典》2020 版收藏了滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.）、黃精（Polygonatum sibiricumRed.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）3 種原生藥，按形狀不同，習(xí)稱“大黃精”、“雞頭黃精”、“姜形黃精”[2]。黃精為百合科黃精屬植物Polygonatum sibiricumRed.的干燥根莖，屬于藥食兼用的中藥材。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃精具有降血壓、降血糖、抗氧化、抗菌和抗炎等功效[3]。

黃精主要含有多糖、皂苷、多酚、黃酮、木質(zhì)素、氨基酸、微量元素和揮發(fā)油等生物活性物質(zhì)[4]，多糖作為黃精的主要化學(xué)成分，具有抗癌[5]、抗腫瘤[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]、預(yù)防抑郁[8]和阿爾茲海默癥[9]等作用。已有研究表明，黃精多糖具有較好的抗氧化活性，如體外清除DPPH 自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等活性[10]；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖能顯著提高經(jīng)訓(xùn)練所致疲勞大鼠或炎癥性腸病小鼠血清中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）的含量，并減少丙二醛（Malondialdehyde, MDA）的產(chǎn)生[11]。另外，黃精酒制前后的水溶性多糖可以改善氧化損傷細(xì)胞內(nèi)總超氧化物歧化酶（Total-SOD）和谷胱甘肽酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）活性，抑制MDA和活性氧（Reactive oxygen species, ROS）的升高，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用[12]。目前，黃精多糖的抗氧化活性研究大多集中于黃精粗多糖，而對(duì)于黃精中均一多糖組分的抗氧化研究較為缺乏。

本研究采用傳統(tǒng)的水提醇沉法提取得到黃精的粗多糖，后經(jīng)DEAE-纖維素陰離子交換柱與Sephadex G-100 凝膠層析柱分離純化得到均一多糖組分PSP。通過(guò)建立D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠模型分析黃精多糖PSP 對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其潛在的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行初步探究，以期為黃精抗氧化作用機(jī)制的深入研究和天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí)昆明種雄性小鼠8 周齡70 只（20±2 g）飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（豫）2019-0002]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審議通過(guò)，審批編號(hào)AHUCM-mouse-2021128；黃精（雞頭黃精） 陜西秦嶺山；D-半乳糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；維生素C（分析純） 上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；正丁醇 上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；T-AOC（總抗氧化能力）、SOD（超氧化物歧化酶）、GSHPx（谷胱甘肽酶）、MDA（丙二醛）試劑盒 南京建成生物科技有限公司。HE 染液套裝 G1003，Servicebio；DEAE 纖維素DE-52、葡聚糖凝膠G-100 北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖分子量標(biāo)品 上海源葉生物科技有限公司。

FD-1B-50 冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；YHZ-212 恒溫振蕩搖床 蘇州國(guó)飛實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；GFL-230 烤箱 天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司；Nikon Eclipse E100 正置光學(xué)顯微鏡、Nikon DS-U3 成像系統(tǒng) 日本尼康公司；凝膠色譜儀 日本島津公司；DHL-A 電腦數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；Multiskan Spectrum 酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司；NIcolet in10 MX 傅立葉交換顯微紅外成像光譜儀 美國(guó)尼高力儀器公司；UV-8000 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；普通玻璃層析柱（1.6×60 cm）、（1.6×80 cm） 上海琪特分析有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗多糖的提取 多糖的提取參照課題組原有的提取方法[13]，并略作修改。稱取100 g 黃精粉末，加入80%乙醇在75 ℃的條件下震蕩24 h 除去脂肪、低聚糖、色素類等小分子物質(zhì)。用4 層200 目脫脂棉紗布過(guò)濾，濾渣在50 ℃的烘箱中干燥24 h，后按1:30 的料液比80 ℃水浴提取2 h，過(guò)濾。按照原有比例向?yàn)V渣中加入相同水量，繼續(xù)提取2 h。合并濾液并濃縮至300 mL 體積，向濃縮液中加入100 μLα-淀粉酶溶液（46 U/mL）于60 ℃反應(yīng)2 h除去淀粉。離心除去沉淀，在所得上清液中加入無(wú)水乙醇，使乙醇的終濃度達(dá)到80%，4 ℃靜置24 h。離心取沉淀，采用Sevage 法脫去沉淀中的蛋白質(zhì)。將脫完蛋白的糖液濃縮，透析，冷凍干燥后得到黃精粗多糖。

1.2.2 DEAE-纖維素陰離子交換柱（1.6 cm×60 cm）對(duì)粗多糖進(jìn)行初步分離 將200 mg 黃精溶解于5 mL 超純水中，依次使用超純水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl 水溶液進(jìn)行梯度洗脫（流速設(shè)置為5 mL/min，2 min/管），用自動(dòng)收集器收集，采用苯酚硫酸法測(cè)定每管中洗脫液的吸光度，并繪制洗脫曲線。收集組分最高的洗脫液，凍干得到黃精多糖P1組分。

1.2.3 黃精多糖P1 組分中成分的分離純化 將50 mg P1 組分溶解于3 mL 水中，采用Sephadex G-100 凝膠層析柱（1.6 cm×80 cm）對(duì)P1 組分進(jìn)行分離純化，以超純水作洗脫液，流速設(shè)置為0.2 mL/min，采用苯酚硫酸法測(cè)定每管中洗脫液（2 mL）的吸光度，并繪制洗脫曲線，將最終所得組分收集合并凍干得到PSP。

1.2.4 多糖的化學(xué)組成分析

1.2.4.1 碳水化合物測(cè)定 參照李媛媛等[14]的方法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚硫酸法測(cè)定PSP 組分中碳水化合物含量，獲得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=17.721X＋0.0641（R2=0.9929）。其中，X 為葡萄糖溶液濃度，Y 為吸光度。

1.2.4.2 糖醛酸含量測(cè)定 參照趙志強(qiáng)等[15]的方法，以D-半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥基聯(lián)苯法法測(cè)定PSP 組分中糖醛酸的含量，獲得D-半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=10.345X-0.0303（R2=0.998）。其中，X 為D-半乳糖醛酸溶液濃度，Y 為吸光度。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照張瑞平等[16]的方法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮法測(cè)定PSP 中蛋白質(zhì)含量，獲得牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=5.6699X+0.0444（R2=0.9987）。其中，X 為牛血清白蛋白溶液濃度，Y 為吸光度。。

1.2.5 紫外分光光度法分析 將PSP 溶于純水中，配制成0.1 mg/mL 的溶液，在200～800 nm 的波長(zhǎng)區(qū)間掃描。

1.2.6 紅外光譜分析 參照劉貴珍等[17]的方法，采用KBr 壓片法制樣。用紅外光譜儀在4000～400 cm-1區(qū)域進(jìn)行掃描。利用OriginPro 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.7 分子量測(cè)定 使用島津凝膠色譜柱，對(duì)多糖的均一性和分子量進(jìn)行分析，分析柱采用TSK G4000PWXL柱（7.8 mm×300 mm）。配制多糖溶液（5 mg/mL），以超純水作流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，在30 ℃的環(huán)境下用RID 檢測(cè)器檢測(cè)。根據(jù)由不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品制成的校準(zhǔn)曲線來(lái)確定分子量。

1.2.8 碘化鉀試驗(yàn) 精密稱取2 mg 黃精多糖樣品溶于1.2 mL 含0.02% I2的KI 溶液，稀釋10 倍，在300～700 nm 區(qū)域進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，觀察350 nm 處是否存在吸收峰，以此判斷多糖的側(cè)鏈和分支結(jié)構(gòu)。

1.2.9 剛果紅實(shí)驗(yàn) 配制PSP 溶液（2.5 mg/mL）與剛果紅溶液（80 μmol/L）按1:1（v/v）的比例充分混合，通過(guò)加入NaOH 溶液（4 mol/L），將混合物逐漸調(diào)整到不同NaOH 濃度（0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45 和0.5 mol/L）。通過(guò)紫外掃描（200～600 nm）記錄不同濃度的剛果紅多糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 氧化損傷小鼠模型的構(gòu)建與給藥 70 只SPF 級(jí)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，期間小鼠自由飲水、覓食普通飼料。適應(yīng)期后，隨機(jī)分為5 組（每組14只）：正常組（Control）、模型組（Model）、陽(yáng)性組（Positive）、多糖低劑量組（PSP-L）、多糖高劑量組（PSP-H）。除正常組外，各組連續(xù)每天上午腹腔注射D-半乳糖（500 mg/kg）三周，下午6～7 點(diǎn)灌胃黃精多糖PSP，多糖低劑量組灌胃50 mg/kg 的多糖溶液，多糖高劑量組灌胃200 mg/kg 的多糖溶液；陽(yáng)性對(duì)照組上午注射D-半乳糖（500 mg/kg），下午灌胃維生素C（200 mg/kg）。

1.3.2 樣本采集 小鼠禁食不禁水12 h，稱重，采集小鼠血液，在4 ℃放置3 h，離心15 min（3500 g），取血清，分裝保存?zhèn)溆茫徊裳罅⒓刺幩佬∈螅〕銎涓闻K、脾臟、腎臟、腦等組織，將臟器表面的血液用預(yù)冷的生理鹽水洗凈，隨后用濾紙擦干表層水分，稱重并計(jì)算臟器指數(shù)。隨機(jī)選取部分肝臟、腦組織加入的4%多聚甲醛溶液固定；另一部分用液氮預(yù)凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩０凑展剑?）～（3）計(jì)算臟器指數(shù)。

1.3.3 血清、肝臟、腦組織勻漿抗氧化指標(biāo)測(cè)定 血清、肝臟和腦組織勻漿液中的SOD、T-AOC、GSHPx、MDA 水平均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定。

1.3.4 肝臟HE 染色 將浸泡在4%多聚甲醛中的肝臟進(jìn)行常規(guī)的HE 組織化學(xué)染色，以觀察肝組織的病理變化情況，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

1.3.5 免疫組化 采用常規(guī)的免疫組化方法評(píng)估黃精多糖低、高劑量組處理的小鼠對(duì)Nrf2、HO-1 蛋白的表達(dá)。將樣本脫蠟和水化后，將組織切片浸入檸檬酸（pH6.0）以進(jìn)行抗原修復(fù)。此后，將切片在室溫下用血清密封30 min，然后與一級(jí)抗Nrf2 和抗HO-1抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。用PBS（PH7.4）洗滌3 次后，在室溫下用二抗（HRP 標(biāo)記）覆蓋切片50 min，并加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行顯色反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞核復(fù)染，切片用蘇木精染色溶液復(fù)染，后在光學(xué)顯微鏡下觀察[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)圖均采用Origin 2021、Graphpad Prism 8 繪制而成，所有數(shù)據(jù)分析均采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSP 的分離純化

黃精粗多糖DEAE 的洗脫曲線見(jiàn)圖1a，經(jīng)DEAE-纖維素陰離子交換柱分離純化后，收集水洗組分冷凍干燥后得水洗組分糖P1，得率為82.67%。采用Sephadex G-100 凝膠層析柱對(duì)P1 組分進(jìn)一步分離，所得組分冷凍干燥后命名為PSP，洗脫曲線見(jiàn)圖1b，得率為93.24%。制備PSP 繼續(xù)開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 多糖洗脫曲線Fig.1 Elution curve of polysaccharides

2.2 PSP 的化學(xué)組成分析

將樣品所測(cè)得的吸光度值帶入標(biāo)曲測(cè)得樣品中所含碳水化合物的含量為94.42%±14.73%、糖醛酸的含量為6.21%±0.71%、蛋白質(zhì)的含量為0.24%±0.032%，表明PSP 是純度較高的多糖。

2.3 PSP 的分子量測(cè)定

由PSP 的HPGPC 圖譜（見(jiàn)圖2b）可推斷，PSP是均一性較好的多糖組分。根據(jù)不同分子量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間（見(jiàn)圖2a）與其對(duì)數(shù)值，可獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=-0.3927X+10.716（R2=0.9951），將樣品的保留時(shí)間代入，算得PSP 的分子量為5566.41 Da。

圖2 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和PSP 的HPGPC 圖譜Fig.2 HPGPC spectra of dextran standards and PSP

2.4 PSP 的紫外光譜與紅外光譜分析

紫外光譜掃描圖見(jiàn)圖3a，PSP 在260 和280 nm處未見(jiàn)明顯的特征吸收峰存在，說(shuō)明PSP 中沒(méi)有核酸和蛋白質(zhì)的存在[19]。

圖3 PSP 的紫外和紅外掃描光譜Fig.3 UV spectra and FI-IR spectra of PSP

紅外光譜見(jiàn)圖3b，在3392 cm-1附近的強(qiáng)而寬的吸收峰是由O-H 的拉伸振動(dòng)引起的[20]，在2936 cm-1左右的峰值是C-H 拉伸振動(dòng)引起的，1635 cm-1附近的條帶是由C=O 所引起的，表明PSP 中有糖醛酸的存在[21]，這與化學(xué)組成分析結(jié)果相驗(yàn)證。1130 cm-1和1024 cm-1的吸收峰是由呋喃糖的C-O-C 的伸縮振動(dòng)引起的[22]，在932 和815 cm-1左右的吸收峰歸屬于含有β型糖苷鍵果糖的吸收峰[21-23]，在644 和528 cm-1附近的吸收峰表明PSP 中存在吡喃糖環(huán)骨架[13]。

2.5 PSP 的碘化鉀試驗(yàn)

PSP 溶液與碘試劑混勻后用紫外光譜儀掃描，光譜圖如圖4 所示，由于PSP 與I2-KI 的反應(yīng)物最大吸收峰出現(xiàn)在350 nm 處附近，而不是565 nm 處，說(shuō)明PSP 中可能具有較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支[24]。

圖4 碘化鉀紫外掃描圖Fig.4 KI UV scan chart

2.6 PSP 的構(gòu)象分析

剛果紅溶液可以與具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖形成絡(luò)合物，在弱堿性條件下絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)會(huì)上升，而較強(qiáng)堿性條件下復(fù)合物的最大吸收波長(zhǎng)會(huì)下降，這種最大吸收波長(zhǎng)的特征性變化用于判斷樣品中的螺旋結(jié)構(gòu)[25]。PSP 與剛果紅溶液在堿性條件下最大吸收波長(zhǎng)的變化見(jiàn)圖5，與單獨(dú)的剛果紅溶液相比，PSP 與剛果紅的混合溶液在0～0.15 mol/L 的NaOH 溶液中，其最大的吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯上升，表明PSP 中有三股螺旋結(jié)構(gòu)的存在[26]。

圖5 剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of Congo red with PSP

2.7 PSP 對(duì)氧化損傷小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

為測(cè)定PSP 在體內(nèi)對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用，建立了D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠氧化損傷模型。與對(duì)照組相比，D-半乳糖的注射顯著降低了小鼠的體重，然而，低、高劑量組的多糖顯著逆轉(zhuǎn)了小鼠的體重減輕（P＜0.05）。有研究表明，D-半乳糖的注射可引發(fā)臟器功能減弱與失調(diào)的免疫反應(yīng)[27]。如表1 中所示，氧化損傷模型組的脾臟指數(shù)顯著低于正常組（P＜0.05）；與模型組相比，高劑量保護(hù)組顯著提高了小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05）；低劑量和高劑量的PSP 均顯著提高了肝臟指數(shù)（P＜0.05）；給藥組的腎臟指數(shù)與模型組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這些結(jié)果表明，多糖處理可改善由D-半乳糖注射誘導(dǎo)所引起的體重減輕和肝臟及脾臟指數(shù)的降低。

表1 氧化損傷小鼠體重及臟器指數(shù)Table 1 Body weight and organ indices of mice with oxidative damage

2.8 PSP 對(duì)氧化損傷小鼠腦、肝、血清中GSH-Px、MDA、SOD、T-AOC 含量的影響

生物體的抗氧化能力與健康存在著緊密聯(lián)系，當(dāng)生物體的總抗氧化能力遭到破壞或降低時(shí)，容易引發(fā)各種疾病[28]。GSH-Px 作為機(jī)體內(nèi)部一種重要的過(guò)氧化物分解酶，其主要的功能是保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能的完整，防止機(jī)體受過(guò)氧化物的干擾及損害[29]。SOD 是一種抗氧化金屬酶，分布范圍較廣，幾乎存在于所有生物細(xì)胞中，能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過(guò)氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用[30]，MDA 可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化速率和強(qiáng)度，能間接反映組織過(guò)氧化損傷程度[31-32]，其含量的測(cè)定通常與SOD 含量的測(cè)定互相配合[33]。T-AOC 反應(yīng)測(cè)定對(duì)象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平[34]。

對(duì)小鼠腦、肝臟及血清中的GSH-Px、MDA、SOD、T-AOC 測(cè)定發(fā)現(xiàn)（圖6a-d, e-h, i-l），與正常組相比，模型組小鼠腦腦組織中GSH-Px 的含量顯著下降（P＜0.05），MDA 的含量顯著上升（P＜0.05），SOD 的含量顯著下降（P＜0.05），T-AOC 顯著下降（P＜0.05），均能夠說(shuō)明模型組小鼠的已產(chǎn)生氧化衰老癥狀，表明D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠氧化損傷模型造模成功。與模型組相比，雖然多糖低劑量組肝臟中GSHPx 與SOD 的表達(dá)量無(wú)顯著差異，但是其T-AOC 表達(dá)顯著提升（P＜0.05），MDA 的含量顯著降低（P＜0.05）。此外，在腦和血清中GSH-Px、SOD 與T-AOC的表達(dá)均有顯著提升（P＜0.05），MDA 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。多糖高劑量組小鼠的腦、肝臟及血清中的GSH-Px、SOD 與T-AOC 的表達(dá)均有顯著提升（P＜0.05），MDA 的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表明高劑量的黃精多糖對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用。

圖6 小鼠腦、肝、血清中GSH-Px、MDA、SOD、T-AOC 測(cè)定結(jié)果Fig.6 Results of GSH-PX, MDA, SOD and T-AOC measurements in mouse brain, liver and serum

2.9 PSP 對(duì)氧化損傷小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

經(jīng)過(guò)HE 染色，肝臟組織切片細(xì)胞中所存在的脂類物質(zhì)被二甲苯溶解成為空泡（見(jiàn)圖7）。正常組的小鼠肝細(xì)胞排列齊整，形態(tài)飽滿，細(xì)胞核呈圓形，周圍的細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞膜清晰。模型組小鼠的細(xì)胞排列順序紊亂、肝小葉的結(jié)構(gòu)被破壞，可見(jiàn)大量的脂肪空泡，部分細(xì)胞核氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重，顏色變淺或消失，表明模型小鼠的肝臟發(fā)生了嚴(yán)重的脂肪變性，肝臟氧化應(yīng)激損傷程度嚴(yán)重。從小鼠肝臟的HE 染色圖可以看出，與模型組相比，多糖高劑量組的空泡數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列整齊，大多數(shù)細(xì)胞核呈圓形，胞膜清晰，表明高劑量的黃精多糖對(duì)小鼠的肝臟細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用[18]。

圖7 氧化損傷小鼠肝臟的HE 染色Fig.7 HE staining of liver in mice with oxidative damage

2.10 PSP 對(duì)氧化損傷小鼠肝臟HO-1 和Nrf2 蛋白表達(dá)的影響

Nrf2/HO-1 信號(hào)通路是細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制的一個(gè)重要組成部分，在保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷中起著重要作用，當(dāng)ROS 過(guò)量產(chǎn)生時(shí)，Nrf2 被激活易位到細(xì)胞核，識(shí)別并激活A(yù)RE，進(jìn)而誘導(dǎo)HO-1 等下游抗氧化基因的表達(dá)[35]。HO-1 是防止氧化應(yīng)激最關(guān)鍵的蛋白。有研究表明，Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的激活可能是預(yù)防D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠氧化損傷的一個(gè)潛在途徑[36]。小鼠肝臟HO-1 染色情況如圖8 所示。

圖8 氧化損傷小鼠肝臟HO-1 染色Fig.8 HO-1 staining of the liver in mice with oxidative damage

本文采用免疫組化的方法檢測(cè)肝臟中Nrf2 和HO-1 蛋白的表達(dá)（見(jiàn)圖9～圖10）。結(jié)果表明，與正常組相比，模型組的Nrf2 和HO-1 蛋白的表達(dá)顯著降低，表明模型組造模成功；與模型組相比，低、高劑量黃精多糖能夠顯著增加Nrf2 和HO-1 蛋白的表達(dá)（P＜0.05），表明黃精多糖很有可能是通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

圖9 氧化損傷小鼠肝臟Nrf2 染色Fig.9 Nrf 2 staining of the liver in mice with oxidative damage

圖10 HO-1 蛋白與Nrf2 蛋白在小鼠肝臟組織中的表達(dá)Fig.10 Expression of HO-1 and Nrf2 proteins in mice liver tissue

3 結(jié)論

經(jīng)凝膠色譜測(cè)得PSP 的分子量為5566.41 Da；PSP 的化學(xué)組成分析發(fā)現(xiàn)，PSP 中碳水化合物、糖醛酸及蛋白質(zhì)的含量分別為94.42±14.73%、6.21±0.71%、0.24±0.032%；紅外光譜分析顯示PSP 中存在呋喃環(huán)與吡喃環(huán)構(gòu)型，且存在β型糖苷鍵的果糖；碘化鉀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PSP 中存在較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比，高劑量的黃精多糖能夠顯著提高小鼠肝臟組織、腦組織、血清中GSH-Px、SOD 和T-AOC 含量，降低MDA 水平；肝臟的HE 染色及免疫組化學(xué)分析顯示，黃精多糖對(duì)肝臟的氧化損傷細(xì)胞有著顯著的保護(hù)效果且能夠顯著增強(qiáng)Nrf2、HO-1 的表達(dá)。由此可以推斷，黃精多糖對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，且其發(fā)揮氧化損傷保護(hù)作用的機(jī)制可能與Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。