鳳岡鋅硒茶揮發性成分提取及其香氣成分分析

何 婷，吳其妹, ，向麗萍，馮 華,,

（1.遵義醫科大學藥學院，貴州遵義 563000；2.遵義市產品質量檢驗檢測院，貴州遵義 563000）

香氣對茶葉品質的形成有著至關重要的作用，其主要由揮發性組分決定。揮發性組分的成分類別、含量高低主要由原料和加工技術等因素決定。在檢測風味物質方面，相較于其他方法，頂空固相微萃取[1-2]（Headspace solid-phase microextraction，HSSPME）-氣相色譜-質譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用法簡單方便、靈敏度高、選擇性好，已被廣泛應用于各種樣品的揮發性組分檢測，為樣品的品質分析提供依據。

鳳岡鋅硒茶是貴州特色茶類之一，屬國家地理標志產品，其主要生產地區集中于貴州鳳岡地區。由于茶樹品種、產地、季節和采制方法的不同，鳳岡鋅硒茶形成了自己獨特的品質特征。成品外形扁平直滑，色澤翠綠或谷黃、湯色翠黃綠，香氣栗香，滋味醇和甘甜，其加工流程為鮮葉-攤青-殺青-做形（理條）-干燥-提香（炒干）-精選-成品。目前針對鳳岡鋅硒茶研究的文獻大多數研究集中在其活性的作用機制[3]，如王曉寧等[4]研究鳳岡鋅硒茶對小鼠代謝調節的機制，也有文獻研究通過電子鼻對湄潭翠芽茶、石阡苔茶、鳳岡鋅硒茶、都勻毛尖進行鑒別[5]。但對于鳳岡鋅硒茶活性成分，以及加工過程中鳳岡鋅硒茶揮發性組分的含量差異及其類別變化規律方面的研究少有報道。

因此，為探索鳳岡鋅硒茶揮發性組分以及探究加工過程中揮發性組分的變化規律，本研究以鳳岡鋅硒茶為原料，優化其揮發組分提取條件；基于HSSPME-GC-MS 技術對鳳岡鋅硒茶加工過程中揮發性組分進行測定，利用主成分分析[6]（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析法（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）[7]對鳳岡鋅硒茶進行判定、區分和篩選，通過變量重要性因子（投影）（Variable importance for the projection，VIP）[8]找出加工過程中的標志性化合物，以此探究加工過程中鳳岡鋅硒茶揮發性組分的差異，為綜合評價鳳岡鋅硒茶的品質提供參考，為鳳岡鋅硒茶的生產、質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鳳岡鋅硒茶原料（茶青） 殺青后半成品，成品各7 批，2022 年4 月收集于貴州省遵義市鳳岡縣；甲醇、乙腈 色譜純，安徽天地高純溶劑公司；超純水Milli-Q 純水器。

8890GC-7000D 型氣相色譜質譜聯用儀 美國Agilent 公司；磁力加熱攪拌器、頂空進樣瓶、固相微萃取手動進樣手柄、85 μm PA、100 μm PDMS、50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取頭 美國Supelco 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 鮮葉原料采摘后，其加工流程為鮮葉-攤青（原料）-殺青（半成品）-做形（理條）-干燥-提香（炒干）-精選-成品（成品），原料、殺青后半成品、成品經研磨后裝于自封袋中于4 ℃保存。

1.2.2 萃取方法 參考李永迪等[9]的條件，精密稱取樣品，置于15 mL SPME 萃取瓶中，加入熱水，并使用帶有聚四氟乙烯頂空隔墊的鉗口蓋密封頂空瓶，置于恒溫爐平衡。將固相微萃取針插入萃取瓶中，邊平衡邊萃取70 min，隨后將萃取頭插入到GC 進樣口，在250 ℃的條件下解吸5 min。為防止樣品間的污染，萃取頭于進樣前在300 ℃老化5 min，萃取結束后在300 ℃老化20 min。

1.2.3 萃取方法優化

1.2.3.1 萃取頭對揮發性成分的影響 固定提取時間為60 min，茶水比為1:7（g/mL），提取溫度為90 ℃，考察85 μm PA、100 μm PDMS、50/30 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭對揮發性成分的影響。

1.2.3.2 提取時間對揮發性成分的影響 固定茶水比為1:7（g/mL），提取溫度為90 ℃，采用50/30 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭，考察時間50、60、70、80 min 對揮發性成分的影響。

1.2.3.3 茶水比對揮發性成分的影響 固定提取時間為70 min，提取溫度為90 ℃，采用50/30 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭，考察茶水比1:5、1:6、1:7、1:8（g/mL）對揮發性成分的影響。

1.2.3.4 溫度對揮發性成分的影響 固定提取時間為70 min，茶水比為1:7（g/mL），采用50/30 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭，考察溫度70、80、90、100 ℃對揮發性成分的影響。

1.2.4 GC-MS/MS 條件 GC 條件石英毛細管色譜柱：Agilent HP-5MS（250 μm×0.25 μm，30 m）；載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%）；恒流體積流量：1.0 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，溶劑延遲3 min。升溫程序：35 ℃保持2 min，以3 ℃/min升至60 ℃保持3 min，以2 ℃/min 升至100 ℃，以5 ℃/min 升至150 ℃保持1 min，以8 ℃/min 升至250 ℃保持6 min。

MS 條件離子源：電子轟擊源（EI），離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質譜接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為全掃描模式（SCAN）：掃描范圍m/z 45～460。

1.3 數據處理

將各色譜峰對應的質譜圖與NIST 17 標準譜庫比對進行定性揮發性物質。采用面積歸一化法定量。數據統計采用Excel 2010，圖表繪制采用Origin 2018，主成分分析和正交偏最小二乘法回歸分析采用SIMCA 14.1。

2 結果與分析

2.1 萃取條件對鳳岡鋅硒茶揮發性成分的影響

2.1.1 不同萃取頭對鳳岡鋅硒茶揮發性成分測定的影響 本實驗考察了3 種不同類型的固相微萃取頭對鳳岡鋅硒茶香氣組分數量及總峰面積的影響，結果如圖1A 所示。50/30 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭明顯比85 μm PA、100 μm PDMS 萃取頭吸附到的峰面積總量和揮發物數量多，這是因為固相微萃取頭的吸附強度主要取決于涂層材料的性質和厚度，涂層的極性不同，對不同極性香氣物質的吸附差異性很大[10]。而50/30 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭因兼有極性和非極性涂層，所以吸附范圍較廣，這與茶葉香氣組成復雜、各組分之間極性差異很大的特點相適應。因此，選用50/30 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭捕集鳳岡鋅硒茶香氣組分。

圖1 萃取條件對揮發性成分檢測結果的影響Fig.1 Effect of extraction conditions on the detection results of volatile components

2.1.2 不同提取時間對鳳岡鋅硒茶揮發性成分測定的影響 由圖1B 可知，提取時間對峰面積總量影響較大，大致呈先上升后下降的趨勢，在提取時間為70min 時峰面積總量和揮發物種類均達到最大，分別為23.80×107、86 種。在80 min 分鐘時峰面積總量（21.99×107）和揮發物數目為（84 種）與70 min 時差異不明顯，主要是由于隨著平衡時間的增加揮發物濃度會增加直到平衡，但隨著平衡時間的繼續增加，原來揮發出來的物質會重新溶解在樣品當中，造成揮發物濃度的下降，而揮發物種類變化不大。因此，選擇提取時間為70 min 進行實驗。

2.1.3 茶水比對鳳岡鋅硒茶揮發性成分測定的影響由如圖1C 所示，隨著茶水比的增加，鳳岡鋅硒茶揮發性成分的總峰面積和揮發物數量呈現先增加后減少的趨勢。在茶水比為1:6（g/mL）時，總峰面積（27.30×107）和揮發物數量（87 種）達到最大。與其他茶水比的總峰面積（24.03×107～17.41×107）相比較，差異顯著，且其他茶水比的揮發物數量（72～75）遠小于茶水比1:6（g/mL）。合適的水量能使纖維頭在樣品瓶中有最大的吸附量。若水量過少則會有少量樣品沒有完全浸沒，水量過多，多余的水會使液面上方的頂空體積減小，影響揮發性物質的揮發。故選擇茶水比為1:6（g/mL）進行萃取較為合適。

2.1.4 不同萃取溫度對鳳岡鋅硒茶揮發性成分測定的影響 經GC-MS 分析獲得樣品的揮發物的數量和總峰面積，結果見圖1D。萃取溫度對鳳岡鋅硒茶香氣的萃取效果影響明顯。隨著溫度升高，揮發物數量與總峰面積明顯增大。當溫度在80～90 ℃時，揮發物數目變化不大；當溫度達到90 ℃時，峰面積達到最大（23.79×107），此時化合物數目為73 種；隨后繼續升高溫度至100 ℃時，化合物數目（79 種）大于90 ℃時的揮發物數目，而總峰面積無明顯差異。原因是在較低的萃取溫度下，茶葉香氣的揮發速度較慢，達到香氣平衡所需時間較長，從而影響分析結果的準確性。相反，在較高萃取溫度下，分子熱運動加劇，茶葉香氣的揮發速度增大，達到香氣平衡所需時間縮短；但溫度過高則會使香氣組分發生異構化或通過熱裂解途徑產生新的香氣組分，同時溫度高產生的水蒸氣會影響萃取頭的使用壽命，還會促使萃取頭固有組分的解析，從而降低萃取頭萃取分析組分的能力。因此，選擇萃取溫度為90 ℃。

2.2 加工過程中鳳岡鋅硒茶揮發性成分分析

通過上述的提取檢測條件，對鳳岡鋅硒茶揮發性組分進行分析，得出的總離子流色譜圖見圖2A。經譜庫搜索質譜解析，在鳳岡鋅硒茶加工過程中共分離鑒定出91 種揮發性成分，包含醇類（22 種）、醛類（12 種）、酮類（13 種）、酯類（11 種）、烯類（3 種）、酚類（5 種）、脂肪烴（4 種）、芳香烴（6 種）、和其他類（15 種）等9 種類型的揮發性物質，其揮發性組分在加工前后的數量分布見圖2B。對于分離鑒定出的91 種揮發性成分的定性和定量結果見表1，其中檢測到的共有化合物為37 種，相對含量較高的揮發性成分有14 種，分別為1-辛烯-3-醇、苯甲醇、（E）-氧化芳樟醇、（S）-氧化芳樟醇、芳樟醇、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇、苯乙醇、香葉醇、苯甲醛、苯乙醛、茉莉酮、β-紫羅酮、3,5,5-三甲基-1-己烯和5-戊基間苯二酚，這與前人研究結果類似[11]。綠茶原料經過殺青等工藝后，揮發性組分的總量、組分種類大多呈下降趨勢，這表明加工對鳳岡鋅硒茶綠茶香氣有較大的影響，但香氣總量與組分的變化速率并不一致。在原料中揮發性組分共有74 種，半成品檢出揮發性組分共有49 種，在成品中檢出55 種揮發性組分。半成品與原料相比，各成分均在減少，減少大小依次為其它=醛類＞酮＞芳香烴＞醇、酯、脂肪烴＞酚、烯類；成品與原料相比，酯類減少，醇、醛、酚、芳香烴、其他類增加，酮、烯、芳香烴保持不變。

表1 鳳岡鋅硒茶中揮發性成分組成及其相對含量（%）Table 1 Composition and relative content of volatile components in the Fenggang zinc-selenium tea (%)

續表1

圖2 鳳岡鋅硒茶加工過程中揮發性物質總離子流色譜圖（A）和揮發性物質的種類占比（B）Fig.2 GC-MS chromatogram of volatile components (A) and the proportion of volatile substances (B) during the production process of fenggang zinc-selenium tea

在鳳岡鋅硒茶中，醇類化合物的種類和相對含量均最高，常帶有特殊的花香和果香[12-13]，對鳳岡鋅硒茶香氣形成有著關鍵作用。在原樣中共有峰的相對含量由高到低的順序是：芳樟醇及其氧化物＞香葉醇＞2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇＞苯乙醇＞苯甲醇＞1-辛烯-3-醇＞蘇合香醇＞反-3-己烯醇＞雪松醇＞α-松油醇。芳樟醇及其氧化物在加工過程前后的相對含量均最大。這與石亞麗等[14]研究結果有所區別，其文獻研究表明香葉醇含量遠大于芳樟醇的含量。從原樣到成品過程中，具有花香氣味的芳樟醇[15]及其氧化物呈現減少趨勢，二氫芳樟醇逐漸增多，香葉醇相對含量在5.45%～6.80%之間。可能是由于芳樟醇被氧化而生成了芳樟醇的氧化物或者其他醇類物質，使得醇種類或含量發生明顯變化，同時在酶的作用下水解，使得花果香的萜烯醇類游離出來，這可能是鳳岡鋅硒茶的栗香形成的基礎。在鳳岡鋅硒茶的攤青、殺青等加工過程中，由于茶葉的失水和緩慢氧化，糖苷類水解[16]產生的苯甲醇等主要的揮發性物質增加，使得鳳岡鋅硒茶香氣形成。而正己醇、6-乙烯基-2,2,6-三甲基-四氫吡喃-3-醇、橙花醇、（E,Z）-金合歡醇僅存在于原樣中，在加工過程和成品中均未被檢測出；環丁基甲醇，1-辛炔-3-醇僅在成品中檢測到。

在醛類化合物中，含有苦杏仁味的苯甲醛相對含量較高，相對含量在4.83～6.05%之間。因在40～50 ℃條件下完成干燥，使得低沸點的固脂肪族醇醛類物質如苯甲醛等在此溫度下相對含量較高。具有果香、清香的β-環檸檬醛[17]在加工前后均被檢測到，且在成品中含量最高，可能由于醇類物質不穩定，通過氧化和酶解后形成醛，使其相對含量發生了改變。通過高溫產生的美拉德反應使具有花香味的苯乙醛相對含量有所增加[18]，為鳳岡鋅硒茶香氣的主要特征成分。巴豆醛僅僅存在于加工過程；2-己烯醛、庚醛、2-羥基-4-甲基苯甲醛僅在樣品中被檢測出。

酮類化合物使茶葉具有清甜香或甜香[19]。其中茉莉酮、α-紫羅酮、β-紫羅酮、甲基庚烯酮、苯乙酮、香葉基丙酮在原樣、半成品、成品中均被檢測到。茉莉酮、β-紫羅酮在檢測中呈現逐漸增加的趨勢，香葉基丙酮、甲基庚烯酮在檢測中呈現先增加后減少的趨勢；α-紫羅酮呈現逐漸減少的趨勢。茉莉酮有果香、花香和茉莉花的氣味[20]，在成品中相對含量達到最高。殺青是鳳岡鋅硒茶加工過程中的關鍵工序，這一過程使得茶葉中類胡蘿卜素香氣前體和脂肪酸類香氣前體降解，導致香葉基丙酮、茉莉酮等芳香物質相對含量增加；同時因殺青而產生的酶促和熱裂解作用，使鳳岡鋅硒茶產生了對茶葉香氣起關鍵作用的類胡蘿卜衍生物-紫羅酮系化合物[21]，主要是具有花果香的β-紫羅酮，這些過程共同促使了鳳岡鋅硒茶香氣的形成，這與YANG 等[22]研究類似。雙乙烯酮、1,1,1-三氟-2-丁酮、5-乙基-6-甲基庚-3-烯-2-酮、大馬士酮僅在原樣中被檢測到。（3E,5E）-辛-3,5-二烯-2-酮僅在半成品中被檢測出。

在酯類化合物中，水楊酸甲酯，乙酰水楊酸甲酯，二氫獼猴桃內酯，水楊酸辛酯，鄰苯二甲酸二異丁酯在加工前后均被檢測出。具有清香、花果香的二氫獼猴桃內酯[23]呈現先增加后減少的趨勢，對鳳岡鋅硒茶香氣的形成具有重要作用。具有清香味的水楊酸甲酯[24-25]在酯類化合物中的相對含量相對較高，在0.8%～4.15%之間。原樣中具有青草氣息的水楊酸甲酯含量較高，使得原樣中青草氣明顯。通過殺青等工藝后，使茶葉減少青草氣成分從而顯現茶香[26]。丁二酸二甲酯僅在原樣中檢測出；順-3-己烯基丁酯、苯乙酸甲酯僅在半成品中檢測出。

在烯類和酚類化合物中，3,5,5-三甲基-1-己烯、（+）-檸檬烯、對氨基鄰甲酚在原料、半成品、成品中均被檢測出。具有新鮮橙子與檸檬香氣的（+）-檸檬烯[24]，對鳳岡鋅硒茶香氣的形成有一定的貢獻。對氨基鄰甲酚在加工過程中呈現逐漸增多的趨勢；3,5,5-三甲基-1-己烯、5-戊基間苯二酚在檢測中呈現先增加后減少的趨勢。松油烯、2,5-雙（1,1-二甲基乙基）苯酚僅在原樣中被檢測出。

在脂肪烴、芳香烴類化合物中，2,2,6-三甲基環庚烷、十三烷、2-甲基萘在加工過程中均被檢測出。2-甲基萘可能作為某些化合物的載體而不參與鳳岡鋅硒茶香氣的形成。由于脂肪烴、芳香烴類化合物的相對含量占比較小，可能對鳳岡鋅硒茶氣味的貢獻不大。

在其他類化合物中，苊和咖啡因在加工過程中均被檢測出。成品中吲哚的相對含量為2.35%，是綠茶香氣品質形成的重要化合物，這與WANG 等[27]的研究結果一致。當其濃度較低時會呈現出花香等令人愉悅的味道[28]；當濃度較高時，會表現出刺激氣味。在殺青、做形等工序中，產生了美拉德、機械損傷脅迫等作用，形成具有焦香、甜香、花香等氣味的吲哚類、吡嗪類、吡咯類及呋喃類等[29]，對鳳岡鋅硒茶氣味具有重要作用。1-甲基-1H-四唑、甲酰肼、N-乙基琥珀酰亞胺、壬酸、2-乙基己酸酐僅在原樣中被檢測出；乙烯醚、丙酸酐僅在半成品中被檢測出。

2.3 主成分分析和OPLS-DA 分析

鳳岡鋅硒茶在加工過程中揮發性成分的變化在得分散點圖上實現了較好的區分，其中，原樣均分布在橫軸負半軸（第二、三象限），聚集程度較高，歸為1 類；而半成品和成品分布在橫軸的正半軸（第一、四象限），半成品和成品之間差異不明顯，聚為1 類，見圖3A。由此體現了鳳岡鋅硒茶在加工前后香氣存在一定的差異性。

通過OPLS-DA 篩選鳳岡鋅硒茶的標志性揮發性組分[30]。以37 個共有揮發性組分作為因變量，加工前后的類別作為自變量，對鳳岡鋅硒茶加工過程進行OPLS-DA 分析，見圖3B，所有樣本均在95%置信區間內，原樣分布在左側象限，半成品和成品分布在右側象限，能對加工前后的鳳岡鋅硒茶樣品進行有效區分。進一步，采用200 次響應的置換檢驗證模型是否過擬合，其擬合參數為R2X=0.721，R2Y=0.996，Q2=0.526，其中Q2＞0.5，R2Y-R2X＜0.3，代表該模型較可靠且穩定性良好[31]，可用于加工過程中鳳岡鋅硒茶的判別分析。如圖4A 所示，Q2的回歸線截距為負值，且所有的R2值和Q2值均是模擬值低于原始值，上述結果說明該模型穩定性較好，未出現過擬合現象，具有較好的預測能力，該結果可用于茶葉香氣的加工過前后的鑒別分析。

變量重要性因子（VIP）表示揮發性成分對樣本的貢獻度，從而篩選出重要的特征物質，一般認為VIP＞1 表示該變量具有重要作用[32]，且VIP 值越大，說明該變量在加工前后樣本間的差異越顯著。由圖4B、表2 可以看出，VIP 值大于1 的揮發性成分共有15 種，分別為茉莉酮、（S）-氧化芳樟醇、α-紫羅酮、水楊酸甲酯、甲基庚烯酮、（E）-氧化芳樟醇、雪松醇、β-環檸檬醛、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇、乙酰水楊酸甲酯、1-辛烯-3-醇、苯乙醛、對氨基鄰甲酚、2,2,6-三甲基環庚烷和3,5,5-三甲基-1-己烯等，上述15 種VIP 大于1 的標志差異性揮發性成分，可作為區分加工過程中鳳岡鋅硒茶的標志物。

表2 變量重要性因子（VIP 值）Table 2 Variable importance for the projection (VIP values)

3 結論

本研究采用HS-SPME-GC-MS 技術，通過優化提取條件，對加工前后的鳳岡鋅硒茶的揮發性組分進行分析與歸類，探究揮發性組分在加工過程中的變化規律。結果表明，醇類（22 種）、酮類（13 種）、酯類（11 種）和醛類（12 種）是構成鳳岡鋅硒茶香氣的主要揮發性組分。在加工前后共檢測出91 種揮發性組分，其中共有揮發性化合物有37 種，相對含量超過1%的共有13 種。主成分分析表明，因加工過程中揮發性組分的不同，使得鳳岡鋅硒茶加工前后的差異較大，可將加工前分為一類，加工后歸為一類。OPLSDA 分析表明具有貢獻作用的揮發性成分共有15種，其中關鍵香氣（VIP＞1.5）為茉莉酮、（S）-氧化芳樟醇。這15 種標志差異性揮發性組分，可作為區分加工過程種鳳岡鋅硒茶的標志物。鳳岡鋅硒茶品質除了受原料、加工工藝等影響外，茶樹的生長環境、貯藏條件等也會對其品質產生影響，目前有關鳳岡鋅硒茶品質與生長環境關系、貯藏條件的研究較少，還需進一步研究。本研究檢測指標和樣本數量有限，不一定完全適用于鳳岡鋅硒茶的鑒別分析，因而需要進一步收集鳳岡鋅硒茶的指標信息進行綜合性評價，為鳳岡鋅硒茶的生產、質量控制提供理論依據。