基于電子鼻和氣質聯用識別不同工藝的俄色茶

易宇文，何 蓮，鄧 靜, ，胡金祥，彭毅秦，喬明鋒，蔡雪梅，朱開憲，吳華昌，雷 敏

（1.四川旅游學院，四川成都 610100；2.爐霍雪域俄色有限責任公司，四川甘孜藏族自治州 626500）

變葉海棠（Malus toringoides（Rehd.） Hughes）為薔薇科蘋果屬落葉灌木，大多分布在海拔3000～3500 m 的高海拔地區，是中國特有植物資源，在四川、西藏等高海拔地區有分布。以變葉海棠葉為原料，按制茶工藝制成的飲品，當地人稱為俄色茶。藏醫和現代醫學均認為俄色茶具有治療消化不良，降血壓、血脂[1-3]等功效。近年來通過質譜、核磁、液相、氣相和IRIS Intrepid II XSP 等分析發現俄色茶主要成分為二氫查耳酮、黃酮、氨基酸、多糖、脂肪酸等[4-6]。由此可見，俄色茶保健價值極高。

茶葉香氣的形成既與所含香氣物質（占茶葉質量的0.01%～0.05%）有關[7]，又與后序加工工藝存在極大聯系[8]。茶葉香氣形成的4 條途徑[9]是影響茶葉香氣差異的重要因素。有研究表明，茶葉香氣對茶葉品質的貢獻率在25%～40%[9-10]之間。郭洪偉等[11]分析紅茶和綠茶的主要香氣成分表明：醇類和醛類物質是紅茶的主要揮發性物質；醇類和酯類是綠茶的主要揮發性物質。喬小燕等[12]的研究表明康磚茶主要揮發性物質為酮類、醛類和醇類。以變葉海棠葉為原料，通過不同加工工藝形成了俄色紅茶、綠茶和康磚茶，其整體香味輪廓是否存在差異以及具體香氣物質的差異未見相關報道。

茶葉中的香氣物質分子量小、沸點低、揮發性強。選擇有效香氣檢測方法至關重要。電子鼻是一種快速識別樣品整體氣味輪廓的儀器，其檢測結果具有客觀性、重復性、可視性等優點，但無法判斷樣品之間氣味差異的具體物質。捕集阱自動頂空（trap head space）具有樣品處理簡單，氣味物質自動萃取、富集和進樣，方便快捷等特點。氣相色譜質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是分離、鑒定物質的有效工具。電子鼻和GC-MS 在茶葉整體氣味輪廓及具體物質的鑒定領域有廣泛應用。陸晨浩等[13]發現發芽3 天的黑麥茶香氣與未發芽的差異明顯。邵淑賢等[14]研究表明利用黃觀音烏龍茶的5 種主要香氣成分所構建SVM 判別模型，其識別不同產地的黃觀音烏龍茶的識別率為100%。WANG 等[15]研究表明，不同工藝制備的茶葉其香氣和含量差異大，揮發性物質含量結合聚類分析能夠準確分類。另外，正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）是一種有監督的分析方法，其通過去除變量的數據變異，將分離信息集中在一個主成分中，使模型變得簡單且易于解釋。

本研究以不同工藝的俄色茶為研究對象，采用電子鼻、HS- Trap- GC-MS 技術結合OPLS-DA、ROAV、差異性熱圖，識別不同工藝的俄色茶整體氣味輪廓，鑒定俄色茶揮發性物質，分析俄色茶主要香氣物質及差異，旨在比較不同工藝條件下俄色茶氣味異同，探明不同工藝條件下俄色茶氣味特點，為俄色茶風味研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

俄色茶樣品 由四川爐霍雪域俄色有限公司提供，樣品信息見表1，樣品加工方法參見文獻[16]。取四個不同年份（2019、2020、2021 和2022 年）的俄色紅茶、綠茶和康磚茶各3 份，將樣品分別混勻，研磨成粉，過40 目篩，備用。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

FOX 4000 電子鼻 Alpha MOS 公司；Clarus 680氣相色譜儀、Elite-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱、Clarus SQ8T 質譜儀、HST40 捕集阱頂空進樣器 美國珀金埃爾默公司；DFY-400C 高速粉碎機溫嶺市林大機械有限公司；ME203E 電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限責任公司；6CR-40 型揉捻機、6CFJ-1 發酵機、6CH-12 烘干機 信陽一鼎茶業科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品工藝及參數 俄色紅茶制備工藝及參數：采摘（高山變葉海棠嫩芽）、萎凋（加溫50 ℃萎凋，至含水量60%左右）、揉捻（40 型揉捻機按輕、重、輕進行冷揉，至成條率90%）、發酵（發酵機溫度35 ℃，相對濕度80%，發酵時間6 h）、干燥（烘焙100 ℃，時間45 min）、篩選、檢驗、包裝。

俄色綠茶制備工藝及參數：采摘（高山變葉海棠嫩芽）、攤青（攤青床，厚度2～5 cm，通微風，15 min翻動一次，至鮮葉含水量70%）、殺青（溫度為270 ℃，至含水量為60%）、揉捻（40 型揉捻機按輕、重、輕進行冷揉，至成條率90%）、烘干（溫度100 ℃，至含量水為6%）、篩選 、檢驗、包裝。

俄色康磚茶制備工藝參數：采摘（高山變葉海棠嫩芽或碎嫩芽）、殺青（溫度為270 ℃，至含水量為55%）、揉捻（40 型揉捻機按輕、重、輕進行冷揉，揉捻葉細胞破壞率為80%）、渥堆（堆高80 cm，室溫25 ℃，茶坯含水量35%，渥堆時間為15 d）、干燥（烘焙200 ℃，時間15 min）、篩拼（蒸壓成型）、干燥（壓餅成型后的俄色茶置于干燥環境，自然干燥）、檢驗、包裝。

1.2.2 電子鼻檢測 樣品前處理：取2.0 g 俄色茶粉裝入潔凈的10 mL 頂空瓶，用頂空蓋、墊密封，備用。

電子鼻檢測條件：樣品在孵化器（70 ℃）內孵化5 min，進樣量500 μL，進樣速度500 μL/s，手動進樣。每個樣品檢測120 s，檢測器清潔180 s。每個樣品檢測20 次，取10 次穩定（依據其在主成分二維圖中的集中程度）數據進行分析。

1.2.3 GC-MS 檢測 樣品前處理：取俄色茶粉4.0 g裝入20 mL 頂空瓶，用GC-MS 專用瓶蓋密封，裝入自動進樣器。備用。

萃取及進樣條件：萃取溫度70 ℃，進樣針溫度75 ℃，傳輸線溫度80 ℃，萃取時間1800 s，干吹120 s，解析10 s，頂空瓶加壓/釋壓120 s，捕集阱保持240 s，捕集阱循環4 次。

氣相條件[17]：載氣（99.999% He），流速1.0 mL/min。起始溫度30 ℃，保持3 min，然后以2 ℃/min 升至160 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保留3 min。

質譜條件：EI 離子源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，電子倍增電壓1650 V；質量掃描范圍：45～450 m/z；標準調諧文件。

定性、定量：首先去除柱流失的含硅類物質，然后選取正反匹配度均大于700（最大999）, 參考NIST 2011 譜庫，同時結合質譜圖進行定性。以相對峰面積計算相對含量。

檢測結果有效性選擇：每個樣品檢測5 次，僅取3 次都能檢測到的物質作為有效結果。

1.2.4 相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）的計算 相對氣味活度值（ROAV）是一種結合閾值判定化合物重要性的方法，其原理及計算方法見參考文獻[18-19]。

式中：C 表示某物質的相對百分含量；T 表示該物質的呈香閾值。

1.3 數據處理

OPLS-DA 分析、繪圖、預測變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）：SIMCA14.1軟件。平均值及標準偏差（±SD）：SPSS 25。電子鼻雷達圖、差異性熱圖：數據歸一化處理及制圖采用origin 2021。

2 結果與分析

2.1 電子鼻分析俄色茶整體氣味輪廓

表2 是電子鼻檢測3 種工藝的俄色茶傳感器響應數據，經OPLS-DA 分析的結果。表中可以看出，傳感器（LY2/LG、LY2/G 、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCT、P30/2、TA/2）的響應值差異不顯著（P＞0.05），其他傳感器差異則顯著（P＜0.05）。從VIP 值可知，LY2/LG、LY2/AA、T40/2 這3 根傳感器的值大于1，說明其在識別樣品中貢獻比其他傳感器大；3 個樣品在T40/2 傳感器上，差異顯著且VIP 值大于1，說明傳感器T40/2 在識別俄色茶中有重要作用。

表2 不同工藝俄色茶電子鼻傳感器響應值Table 2 Response value of Malus toringoides (Rehd.) Hughes tea electronic nose sensor in different processes

圖1 是電子鼻檢測結果的傳感器數據繪制的雷達圖。圖中可以看出紅茶樣品在所有傳感器（除LY2 型）上的響應值均高于其他樣品。有研究表明，電子鼻能快速識別不同香氣的茶葉，茶葉香氣越濃郁，其電子鼻傳感器的響應值越高[20]。說明紅茶樣品香氣濃郁，其次是綠茶，康磚茶香氣最次。

圖1 電子鼻雷達圖Fig.1 Electronic nose radar diagram

圖2 是樣品經OPLS-DA 分析的散點圖。3 個樣品分布在不同區域，均無交叉，這既能說明工藝對俄色茶香氣形成的影響大，又能說明電子鼻能夠有效區分樣品且重復性良好。3 個樣品自變量擬合指數R2X= 0.991，因變量指數R2Y=0.964；模型預測指數Q2=0.957，其預測能力為95.70%。一般認為自變量和因變量擬合指數大于0.5 即可接受[21]。

圖2 電子鼻OPLS-DA 分析Fig.2 OPLS-DA analysis of electronic nose

圖3 是判別模型經過300 次（最大999）置換檢驗的結果。圖中，所有方形和圓形點橫坐標均在大于0 的位置，Q2回歸線與Y 軸的交點小于0。這說明模型擬合效果好，模型驗證有效。由此可見，通過電子鼻結合OPLS-DA 數據模型來區分不同工藝的俄色茶效果良好。

圖3 電子鼻模型交叉驗證結果Fig.3 Cross validation results of electronic nose model

2.2 不同工藝的俄色茶揮發性物質差異分析

GC-MS 對俄色茶揮發物質的定性及定量檢測結果見表3，分類見表4。3 種工藝的俄色茶共鑒定出98 種揮發性物質，紅茶、綠茶和康磚茶分別鑒定出52、52 和52 種；相對含量分別為94.01%、90.20%和92.98%。其中包括醛類24 種、酯類5 種、醇類16 種、烴類21 種、酮類13 種、呋喃4 種、其他物質15 種。醛類、酯類、醇類（康磚茶除外）、烴類（康磚茶）是樣品主要揮發性物質。共有物質10 種：異戊醛、辛醛、2-甲基庚醛、庚醛、三甲氧基酯、癸烷、2,2-二甲基癸烷、2,2,4,4-四甲基辛烷、4-甲基-3-丁烯-2-酮、2-乙基呋喃。這些被檢測到的物質、種類、共有物質及含量的差異，初步反映了3 種工藝條件下俄色茶氣味的差異。

表3 俄色茶揮發性物質差異分析Table 3 Difference analysis of volatile substances in Malus toringoides (Rehd.) Hughes tea

續表3

表4 俄色茶揮發性物質種類及相對含量Table 4 Types and relative content of volatile substances in Malus toringoides (Rehd.) Hughes tea

醛類物質生成途徑比較復雜，一般認為醛類物質是微生物發酵時，不同氨基酸在對應酶作用下生成不同的醛類物質[22]；醛類物質也可通過脂肪酸過氧化及降解產生或者是某些不穩定醇被氧化而成為醛類物質[23]。醛類物質是俄色茶主要揮發性物質，其含量在21.33%～48.62%之間。異戊醛（沸點92～93 ℃）是三個樣品主要共有物質，且含量較高（10.87%、4.75%、10.94%），在發酵茶中，特別是紅茶[19]和黑茶[24]中比較常見。異丁醛（沸點94 ℃）是俄色紅茶獨有的主要揮發性物質，含量為13.48%。李慧等[19]認為異戊醛、異丁醛是構成紅茶果香、甜香、焦糖香的主體香氣物質。因此可認為異丁醛是紅茶區別于綠茶和康磚茶的關鍵物質。已醛是紅茶和綠茶檢測到的共有物質，含量均大于7.50%，在康磚茶中未檢出。已醛在大多數茶葉中均有檢出，其含量在紅茶中相對較高[19]。3-甲基-2-丁烯醛（異戊烯醛）是康磚茶中檢出的含量很高的物質（11.32%），是一種具有脂肪香味的物質[25]；其在六大茶類[26-27]以及一些六大茶類以外的茶（如各種保健茶）中含量均不高[25,28]，而俄色康磚茶含量高，但無閾值相關數據，需要進一步研究。

酯類香氣形成[29]可能是氨基酸在脫氨、脫羧而氧化形成酸和醇，最后經過酯合成酶作用，從而形成酯香。酯類物質在三個樣品中種類較少，但含量高（17.41%～36.53%）。三甲氧基酯在三個樣品中的含量均高于16%，是含量最高物質，但無其氣味和閾值相關數據。三甲氧基酯在金牡丹[30]及鐵觀音[31]中有檢出。甲酸甲酯是一種具有甜香、青果香氣的物質，僅在俄色綠茶中有檢出，且含量較高（3.42%）。

茶葉中醇類物質的形成：蛋白質水解成氨基酸以及氨基酸與酶、鄰醌等作用生成醇類物質[32]。醇類物質含量在5.43%～14.09%之間，通常具有花、果氣息。紅茶和綠茶共有物質3 種，環丁基甲醇、青葉醇是含量較高的物質（＞1%）。紅茶與康磚茶共有物質2 種，為苯甲醇，3-戊烯-2-醇（＞1.50%）。綠茶與康磚茶共有物質1 種：順-4-環戊烯-1,3-二醇。

三個樣品均檢測到烴類物質，其含量均大于8%。康磚茶烴類物質含量最高（19.30%）。烴類物質中以烷烴為主，一般認為烷烴類物質閾值較高[33]，其可能對康磚茶香氣形成貢獻較小。

2.3 俄色茶ROAV 分析及差異比較

為探明3 種工藝的俄色茶中各揮發性組分對樣品整體香氣貢獻，實驗結合揮發性物質的氣味閾值、香氣描述以及香氣類型，對52 種（能檢索到閾值）揮發性物質進行分析，結果見表5。紅茶、綠茶、康磚茶分別檢測到28、35、19 種有閾值的香氣物質。根據香氣描述和香氣類型：果香（17 個）、腥香（8 個）、焙烤香（6 個）、異香（4 個）、花香（3 個）、焦香（2 個）、迷香（1 個）、奶香（1 個）、肉香（1 個）、焦糖香（1 個）、煙香（1 個）；果香、腥香和焙烤香是樣品主要香氣。依據香氣類型和ROAV 值，果香（12160768）、甜香焦糖香（8986444）、腥香（596098）對紅茶氣味的形成相對貢獻較大；對紅茶香氣貢獻最大的10 種物質是異戊醛、異丁醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、辛醛、己醛、庚醛、異戊醇、苯乙醛、活性戊醇；果香（6297561）、花香（1317535）、焙烤香（285808）對綠茶氣味的形成相對貢獻較大；對綠茶貢獻最大的10 種物質是異戊醛、壬醛、辛醛、庚醛、己醛、2-正戊基呋喃、苯乙醛、癸醛、萘、2-己烯醛；果香（10129749）、花香（3001136）、腥香（1918858）對康磚茶氣味的形成貢獻相對較大；對康磚茶香氣貢獻最大的10 種香氣物質是異戊醛、辛醛、3-己烯醛、庚醛、2-甲基萘、異戊醇、2-甲基戊醛、戊醛、D-檸檬烯、3-戊烯-2-醇。果香類物質對俄色茶氣味的形成貢獻大，醛、醇是俄色茶香氣的主要來源。異戊醛、辛醛、庚醛是3 種俄色茶共有主要香氣物質，且異戊醛是含量最高（有氣味）的物質。可以推測異戊醛可能是俄色茶關鍵香氣物質。

表5 俄色茶香氣成分的ROAV 分析Table 5 ROAV analysis of aroma components of Malus toringoides (Rehd.) Hughes tea

2.4 揮發性物質差異性分析

根據表4 的分類，選取每個樣品中每類含量前5 的物質[35]進行差異性熱圖分析，其結果見圖4。由圖4 各種物質豐度可知，三甲氧基酯、異戊醛、2-乙基呋喃是3 個樣品的主要共有揮發性物質。除共有物之外，紅茶主要揮發性物質是異丁醛、己醛、環丁基甲醇、2,2-二甲基癸烷、葉醇、2-甲基庚醛、2-乙基呋喃；綠茶主要揮發性物質是己醛、環丁基甲醇、2-乙基呋喃、甲基環氧丙烷、甲酸甲酯、環丙基甲基甲醇；康磚茶主要揮發性物質為2-乙基呋喃、trans-2-甲基戊二烯、L-乳酸乙酯、甲基環氧丙烷、3-戊烯-2-醇、3-甲基-2-丁烯醛、3-甲基壬烷、苯乙基甲基亞砜、五-3,4-二烯醛、2-羥基-2-環戊烯-1-酮、辛醛、異佛爾酮。

圖4 揮發性物質差異性熱圖分析Fig.4 Differential thermogram analysis of volatile substances

2,2-二甲基癸烷、葉醇、2-甲基庚醛、甲基環氧丙烷、甲酸甲酯、環丙基甲基甲醇的豐度反應了紅茶、綠茶的差異。己醛、環丁基甲醇、trans-2-甲基戊二烯、L-乳酸乙酯、3-戊烯-2-醇、3-甲基-2-丁烯醛、3-甲基壬烷、苯乙基甲基亞砜、五-3,4-二烯醛、2-羥基-2-環戊烯-1-酮、辛醛、異佛爾酮的豐度反應了綠茶、康磚茶的差異。紅茶、康磚茶的差異與綠茶、康磚茶類似，僅在綠茶、康磚茶差異的基礎上增加了葉醇、甲基環氧丙烷。縱觀整個熱圖， 3 個樣品差異明顯。

3 結論

實驗以俄色茶為研究對象，通過電子鼻和GCMS 分析，結合OPLS-DA、ROAV、差異性熱圖等方法對俄色茶整體氣味輪廓進行識別和鑒定具體揮發性物質。電子鼻雷達圖及OPLS-DA 分析表明不同工藝的俄色茶差異明顯。GC-MS 檢測表明三種處理方式分別鑒定出52、52 和52 種，共計98 種揮發性物質；醛類、酯類、烴類是俄色茶主要揮發性物質，醇類是紅茶、綠茶主要揮發性物質；醛類、酯類、烴類和醇類的含量差異是導致不同工藝俄色茶香氣異同的主要原因。ROAV 值結合香氣類型分析表明：果香、甜香和腥香對紅茶香氣的形成貢獻較大，果香、花香、焙烤香對綠茶香氣的形成貢獻較大，果香、花香和腥香對康磚茶香氣的形成貢獻較大；果香對俄色茶香氣的形成相對貢獻較大，異戊醛可能是俄色茶的關鍵香氣物質。差異性熱圖分析表明三甲氧基酯、異戊醛、2-乙基呋喃是3 個樣品主要共有揮發性物質。

三甲氧基酯是俄色茶含量最高的共有物質，3-甲基-2-丁烯醛（有氣味的相關報道）是康磚茶中含量較高的物質（11.32%），但目前沒有其氣味及閾值相關報道，故無法判斷其在俄色茶中具體作用。下一步課題組將結合GC-O 對其進行進一步研究。