等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)快速檢測學(xué)校餐飲中三種食源性致病菌

焦 強(qiáng)，陳萬勝，周 楠，張慶發(fā)，劉智勇,

（1.河南省食品檢驗(yàn)研究院，國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術(shù)），河南鄭州 450000；2.廣州迪澳生物科技有限公司，廣東廣州 510507）

感染食源性致病微生物導(dǎo)致食物中毒是目前食品安全的主要問題[1-2]，食源性致病菌能利用肉制品、乳制品、蛋制品等媒介進(jìn)行人體的消化系統(tǒng)，通過釋放致病因子引起機(jī)體中毒[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年有約10%的人因食源性致病微生物而引起中毒，其中主要的致病微生物為沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7/NM 和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[4]。我國的食源性疾病情況也較為嚴(yán)重，在食源性中毒事件中有70%～80%是由沙門氏菌污染引起的[5]，而學(xué)校食堂的食源性疾病也屢見不鮮，其直接影響了全校師生的身體健康[6]。目前大部分學(xué)校對食品檢驗(yàn)缺乏配套的快檢實(shí)驗(yàn)室，只有少數(shù)學(xué)校配備快檢實(shí)驗(yàn)室，但也只是對消耗量大、操作較容易、成本較低廉的蔬菜農(nóng)藥殘留項(xiàng)目進(jìn)行檢測，對使用量較大的生鮮肉類、植物油及微生物等，由于操作較復(fù)雜、耗時(shí)長、設(shè)備試劑較昂貴等原因，基本不進(jìn)行檢測[7]。一旦有學(xué)生發(fā)生嘔吐、腹瀉或其他疑似食物中毒的病癥，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題。因此，急需建立一種快速、靈敏、高效、準(zhǔn)確地鑒別學(xué)校餐飲中食源性致病菌的方法。

等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)（IMSA）是一種新型的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)的特點(diǎn)是針對靶基因序列設(shè)計(jì)了6 條特異性引物：一對莖引物和兩對雜交嵌套引物，能識別靶基因上7 個(gè)位點(diǎn)，在等溫（60～65 ℃）條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，可產(chǎn)生多倍數(shù)的能自我配對繼而引發(fā)循環(huán)擴(kuò)增的特殊核甘酸結(jié)構(gòu)[8-9]。樂振竊等[10]使用IMSA 技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因豆奶中外源基因成分，其靈敏度和特異性優(yōu)于FQ-PCR 法，但引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、產(chǎn)物結(jié)核復(fù)雜，難以進(jìn)行后續(xù)的回收克隆鑒定。Liu 等[11]利用IMSA 技術(shù)建立檢測產(chǎn)腸毒素大腸桿菌Ⅱ型不耐熱腸毒素（LT-Ⅱ）的體系，可快速檢測LT-Ⅱ，與LAMP 和CPA 法相比，具有檢測范圍更廣、檢測限更低、耗時(shí)更短和特異性更好等優(yōu)點(diǎn)，但擴(kuò)增結(jié)果需要通過觀察副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀進(jìn)行結(jié)果判定，易受主觀因素影響。王琪等[12]使用IMSA 技術(shù)建立檢測食品中腸出血性大腸桿菌O157:H7 的方法，可在11～12 h 內(nèi)得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，但檢測的目標(biāo)致病菌只有一種，無法進(jìn)行多種食源性致病菌的分析，應(yīng)用范圍有限。

本研究在擴(kuò)增體系中加入一種熒光染料SYTO-9，可以實(shí)現(xiàn)設(shè)備自動判讀結(jié)果，實(shí)時(shí)監(jiān)控靶基因的擴(kuò)增情況，避免主觀因素影響。選擇沙門氏菌的invA基因、大腸埃希氏菌O157:H7/NM 的rfbE基因和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的prfA基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立食源性致病菌的IMSA 檢測方法，并將該方法應(yīng)用到食品樣本的檢測中，為學(xué)校餐飲快速檢測食源性致病菌提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠傷寒腸道沙門氏菌等15 株菌種 ATCC 菌種保藏管理中心（表1）；涼拌牛肉等74 例食品樣本河南省中小學(xué)等學(xué)校食堂及周邊餐飲店；細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒 廣州迪澳生物科技有限公司；熒光染料SYTO-9、Bst聚合酶、buffer 紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；緩沖蛋白胨水、改良EC 肉湯、李氏增菌肉湯LB 等培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

表1 菌株信息Table 1 Strains information

Deaou-308C 恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀 廣州迪澳生物科技有限公司；HT-400B 電熱恒溫培養(yǎng)箱 江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 公布的沙門氏菌invA基因（登陸號：EU348365.1）、大腸埃希氏菌O157:H7/NMrfbE基因（登陸號：S83460.1）、單核細(xì)胞增生李氏特氏菌prfA基因（登陸號：LC00 6211.1）中的保守序列，利用Primer Explorer V4 在線軟件設(shè)計(jì)之后手動修飾成IMSA 引物（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.2.2 樣本預(yù)增菌處理 在無菌條件下，稱取25 g（mL）食品樣本，置于盛有225 mL 培養(yǎng)基的無菌均質(zhì)袋中，以1000 r/min 均質(zhì)2～3 min，轉(zhuǎn)至500 mL 錐形瓶內(nèi)，于30±1 ℃或36±1 ℃內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 增菌液DNA 提取 取待用的增菌液，10000×g離心2 min 后棄上清液，沉淀中加入100 μL 細(xì)菌DNA 提取液，渦旋混勻后，100 ℃處理10～15 min，10000×g 離心2 min，吸取上清液至新的EP 管內(nèi)，即為DNA 模板。

1.2.4 IMSA 擴(kuò)增反應(yīng) 配制反應(yīng)體系：10×Thermo-Pol 緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，5 mol/L甜菜堿5 μL，150 mol/L 硫酸鎂1 μL，8U Bst 聚合酶1 μL，10 μmol/L DsF/DsR 0.5 μL，20 μmol/L SteF/SteR 1 μL，40 μmol/L FIT/RIT 1 μL，DNA 模板2 μL，補(bǔ)超純水至25 μL。將配制好的反應(yīng)體系混合后，放入恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測儀Deaou-308C 中，反應(yīng)條件為63 ℃ 45 min。

1.2.5 菌液靈敏度實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)后的菌液10 倍梯度稀釋至10-9，選擇3 個(gè)適宜稀釋度菌液，取100 μL進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每組設(shè)置2 個(gè)重復(fù)。同時(shí)各稀釋度菌液取1 mL 進(jìn)行DNA 提取，并進(jìn)行菌液靈敏度IMSA 檢測，用滅菌的去離子水作為陰性對照。根據(jù)檢測結(jié)果分析三種食源性致病菌IMSA 方法的靈敏度。

1.2.6 特異性實(shí)驗(yàn) 復(fù)壯15 株菌種，各取1 mL 培養(yǎng)液進(jìn)行DNA 提取，并進(jìn)行特異性IMSA 檢測，用滅菌的去離子水作為陰性對照。根據(jù)檢測結(jié)果分析三種食源性致病菌IMSA 方法的特異性。

1.2.7 樣本的最短增菌時(shí)間和最低含菌量檢出限確定實(shí)驗(yàn) 在無菌條件下，將經(jīng)培養(yǎng)法和IMSA 檢測過沙門氏菌為陰性的涼拌牛肉，分別稱取25 g 加入225 mL 的緩沖蛋白胨水、改良EC 肉湯以及李氏增菌肉湯LB 中，然后將經(jīng)平板計(jì)數(shù)確定濃度為2.14×103CFU/mL 的鼠傷寒腸道沙門氏菌、2.79×103CFU/mL 的大腸埃希氏菌O157:H7/NM 和3.62×103CFU/mL 的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的純菌菌液10 倍梯度稀釋后，各取1 mL 加入到對應(yīng)的培養(yǎng)基中。鼠傷寒腸道沙門氏菌于36±1 ℃培養(yǎng)4、6、8 h，大腸埃希氏菌O157:H7/NM 于36±1 ℃培養(yǎng)6、8、10 h，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌于30±1 ℃培養(yǎng)6、8、10 h。各時(shí)間點(diǎn)取1 mL 增菌液進(jìn)行DNA 提取，并進(jìn)行IMSA 檢測，用滅菌的去離子水作為陰性對照。根據(jù)檢測結(jié)果分析三種食源性致病菌IMSA 方法的最短增菌時(shí)間和最低含菌量檢出限。

1.2.8 食品樣本檢測實(shí)驗(yàn) 在無菌條件下，將74 份食品樣本分別稱取25 g（mL）加入225 mL 的緩沖蛋白胨水、改良EC 肉湯以及李氏增菌肉湯LB 中，緩沖蛋白胨水的樣本于36±1 ℃培養(yǎng)6 h，改良EC 肉湯的樣本于36±1 ℃培養(yǎng)8 h，李氏增菌肉湯LB 的樣本于30±1 ℃培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)結(jié)束后各取1 mL 培養(yǎng)液提取DNA，進(jìn)行IMSA 檢測；同時(shí)，按照國標(biāo)培養(yǎng)法GB 4789.4-2016、GB4789.30-2016 和GB4789.36-2016 分別對74 例樣本進(jìn)行沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌以及大腸埃希氏菌O157:H7/NM 檢測。根據(jù)檢測結(jié)果分析比較三種食源性致病菌IMSA 方法與國標(biāo)培養(yǎng)法的一致性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

食品樣本IMSA 檢測和國標(biāo)培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)各重復(fù)2 次，得到的檢測結(jié)果按表3 定性方法的性能指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液靈敏度實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過平板計(jì)數(shù)確定，鼠傷寒腸道沙門氏菌的純培養(yǎng)液濃度為2.14×109CFU/mL，大腸埃希氏菌O157:H7/NM 的純培養(yǎng)液濃度為2.79×109CFU/mL，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的純培養(yǎng)液濃度為3.62×109CFU/mL。經(jīng)過10 倍梯度稀釋后，對各濃度稀釋液進(jìn)行IMSA 檢測，結(jié)果如圖1 所示。建立的沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7/NM、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌IMSA 檢測方法的純菌液靈敏度分別為2.14×103、2.79×103、3.62×103CFU/mL。

圖1 3 種菌液靈敏度Fig.1 Sensitivity of three bacterial solutions

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

對15 株菌種的純培養(yǎng)液進(jìn)行IMSA 檢測，結(jié)果如圖2 所示。建立的沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7/NM、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌IMSA 檢測方法均只對本身所屬的菌株存在特異性的擴(kuò)增曲線，其他菌株均無擴(kuò)增曲線，特異性達(dá)到100%。

圖2 IMSA 檢測3 種菌株的特異性Fig.2 Specificity of IMSA to detect three bacterial

2.3 樣本的最短增菌時(shí)間和最低含菌量檢出限確定實(shí)驗(yàn)

建立的IMSA 方法檢測沙門氏菌結(jié)果如圖3 所示，增菌時(shí)間不少于6 h 時(shí)，人工污染濃度為2.14×100CFU/mL 以上的樣本均能穩(wěn)定檢出鼠傷寒腸道沙門氏菌，人工污染濃度為2.14×10-1CFU/mL 的樣本延長培養(yǎng)時(shí)間依然無法檢出鼠傷寒腸道沙門氏菌。由此可知，建立的IMSA 方法檢測沙門氏菌的最短增菌時(shí)間為6 h，最低含菌量檢出限為2.14×100CFU/25 g。建立的IMSA 方法檢測大腸埃希氏菌O157:H7/NM 結(jié)果如圖4 所示，最短增菌時(shí)間為8 h，最低含菌量檢出限為2.79×100CFU/25 g。建立的IMSA 方法檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌結(jié)果如圖5 所示，最短增菌時(shí)間為8 h，最低含菌量檢出限為3.62×100CFU/25 g。

圖3 人工污染鼠傷寒腸道沙門氏菌培養(yǎng)4 h（A）、6 h（B）、8 h（C）IMSA 檢測結(jié)果Fig.3 IMSA test results of artificially contaminated Salmonella typhimurium cultured for 4 h (A), 6 h (B), 8 h (C)

圖4 人工污染大腸埃希氏菌O157:H7/NM 培養(yǎng)6 h（A）、8 h（B）、10 h（C）IMSA 檢測結(jié)果Fig.4 IMSA test results of artificially contaminated Escherichia coli O157:H7/NM cultured for 6 h (A), 8 h (B), 10 h (C)

圖5 人工污染單核細(xì)胞增生李斯特氏菌培養(yǎng)6 h（A）、8 h（B）、10 h（C）IMSA 檢測結(jié)果Fig.5 IMSA test results of artificially contaminated Listeria monocytogenes cultured for 6 h (A), 8 h (B), 10 h (C)

2.4 食品樣本檢測實(shí)驗(yàn)

對74 份食品樣本進(jìn)行IMSA 和國標(biāo)培養(yǎng)法檢測，結(jié)果如表4 所示。其中4 份樣本利用建立的IMSA 方法檢出沙門氏菌，與國標(biāo)培養(yǎng)法的檢測結(jié)果一致；3 份樣本檢出大腸埃希氏菌O157:H7/NM，與國標(biāo)培養(yǎng)法的檢測結(jié)果一致；1 份樣本檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，與國標(biāo)培養(yǎng)法的檢測結(jié)果一致。由此可見，IMSA 方法與國標(biāo)培養(yǎng)法的一致性高達(dá)100%，說明建立的IMSA 方法對于檢測食品樣本中沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7/NM 和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有很好的效果。

表4 兩種方法檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis table of test results of two methods

3 討論與結(jié)論

IMSA 技術(shù)的一大難點(diǎn)是引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，IMSA引物由一對莖引物和兩對雜交嵌套引物組成，有別于FQ-PCR 引物，因此靶基因序列需要較長的高度保守序列。沙門氏菌毒力島SPI 在其對宿主細(xì)胞的粘附、侵襲等致病過程中起著重要的作用[13]。而inv基因位于SPI-1 上，最早由Galan 等人提出，包括invA、invB、invC等多個(gè)基因，其中invA基因通過參與細(xì)菌侵入宿主并啟動感染，從而影響沙門氏菌致病力[14]。invA在沙門氏菌中具有高度保守性，常常被用作分子生物學(xué)的檢測中[15]。出血性大腸桿菌的主要血清型為大腸埃希氏菌O157:H7/NM，可導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎等嚴(yán)重性疾病，具有感染劑量小和感染癥狀反應(yīng)劇烈等特點(diǎn)[16]。而O157 抗原編碼基因rfbE 在大腸埃希氏菌O157:H7/NM 中具有很高的種特異性，常用于分子生物學(xué)檢測[17]。在單核細(xì)胞增生李斯特菌中，起到調(diào)控絕大多數(shù)毒力基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白因子是PrfA 蛋白[18]，而編碼PrfA 蛋白的prfA基因自然成了許多學(xué)者研究的對象。綜上，本研究選擇invA、rfbE和prfA基因的高度保守序列設(shè)計(jì)IMSA引物進(jìn)行檢測，菌液靈敏度檢測結(jié)果分別為2.14×103、2.79×103和3.62×103CFU/mL，特異性達(dá)到100%。

目前食源性致病菌的檢測方法以國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789 為主，一般分為預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等多個(gè)步驟[19]。現(xiàn)今培養(yǎng)法檢測技術(shù)已成熟，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，有商品化的檢測試劑，一定程度上能減少工作量。但檢測時(shí)長依然需要3～6 d、操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，不能滿足現(xiàn)今快速的檢測要求，是其最大的弊端[20]。免疫學(xué)檢測方法近年來也常被用到檢測微生物、疾病的診斷中，主要有酶聯(lián)免疫技術(shù)、免疫熒光檢測技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)和蛋白芯片技術(shù)等[21]。免疫學(xué)檢測方法是運(yùn)用抗原和抗體間能夠相互特異性識別，并牢固結(jié)合的原理，該方法具有特異性好、敏感度高、檢測時(shí)間短等優(yōu)勢[22]。但其缺點(diǎn)也比較明顯，反應(yīng)過程易受環(huán)境因素以及酶的純度等因素影響，重復(fù)性和穩(wěn)定性欠缺，容易造成漏檢和假陽性[23]。分子生物學(xué)檢測方法是利用核酸具有的特異性，檢測是否含有特異性的基因片段[24]。目前用于食源性致病菌檢測的分子生物學(xué)技術(shù)有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)等[21]。IMSA 技術(shù)是一種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)具有快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于微生物、醫(yī)療檢測等領(lǐng)域[25-26]。本研究建立的IMSA 檢測方法可在12 h 內(nèi)完成三種食源性致病菌的檢測，與國標(biāo)培養(yǎng)法相比，大大縮短了檢測時(shí)間，且結(jié)果一致性高達(dá)100%。

學(xué)校食品安全問題是食安重點(diǎn)關(guān)注的問題，它不僅關(guān)系到師生的身體健康和生命安全，同時(shí)也關(guān)系到社會的和諧穩(wěn)定。但是目前大部分學(xué)校未配備食源性致病菌快速檢測實(shí)驗(yàn)室，只有發(fā)生食物中毒時(shí)才會對留樣食品進(jìn)行檢測，無法及時(shí)監(jiān)控食品加工過程中的問題。而本研究建立的沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157:H7/NM 和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌IMSA快速檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)完成食品中致病菌的檢測，非常適合學(xué)校餐飲食源性致病菌的快速檢測，具有很好的實(shí)用價(jià)值和前景。

盡管建立的IMSA 檢測方法對三種食源性致病菌有很好的檢測效果，但該方法依然有不足之處：第一，三種食源性致病菌的檢測需要分三次進(jìn)行，無法做到在同一管內(nèi)完成檢測。第二，引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)雜，不便于后續(xù)產(chǎn)物的鑒定工作。