三葉青超微粉對(duì)酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

程曉陽，廖 明，何全光，莫財(cái)鋒，黃茂康，黃梅華,

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧 530021；2.肇慶市鼎湖區(qū)人民醫(yī)院，廣東肇慶 526070；3.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧 530007；4.廣西華銀醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，廣西南寧 530000）

有害飲酒被列為全球死亡和殘疾的前五大危險(xiǎn)因素之一，據(jù)報(bào)道每年約造成250 萬人死亡，約6940 萬人殘疾[1]。酒精仍然是肝病發(fā)生和死亡的主要原因，過度飲酒導(dǎo)致肝損傷已成為全球令人擔(dān)憂的健康問題。酒精性肝病（ALD）與一系列肝臟疾病有關(guān)，從脂肪變性到脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌[2-3]。有研究表明，飲酒可引起腸道菌群失調(diào)，從而導(dǎo)致有益微生物代謝產(chǎn)物的減少和有害微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致腸道通透性增加和細(xì)菌易位，引發(fā)各種酒精性肝病。因此，腸道菌群被認(rèn)為是ALD 潛在的治療靶點(diǎn)[4]。

三葉青（SYQ）是我國(guó)特有珍稀植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，葡萄科崖爬藤屬）的塊根，形狀似紅薯，富含淀粉、黃酮、花青素等成分，是一種民間極具盛名的食藥兩用植物，具有護(hù)肝防癌等多種功效[5]，對(duì)小鼠免疫性肝損傷以及由四氯化碳或者α-異硫氰酸萘酯誘導(dǎo)的肝損傷具有治療和保護(hù)作用[6-9]。

原料經(jīng)過初步粉碎，再采用特殊機(jī)械進(jìn)一步粉碎直至粒徑達(dá)到1～75 μm 的超細(xì)粉末被稱為超微粉[10]。超微粉碎可增加原料的比表面積和孔隙率、提高溶出速率和生物利用度，特別是非水溶性成分的生物利用度，進(jìn)而提高有效成分在體內(nèi)的吸收速率，提高功效。如黨參超微粉對(duì)潰瘍的抑制率比普通粉高54%；菊苣根超微粉可改善免疫抑制導(dǎo)致的腸道菌群紊亂，用量?jī)H約為普通粗粉的50%[11-12]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)三葉青超微粉的研究較少，特別是對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)功能鮮見報(bào)道[13]。

因此，本文以酒精性肝損傷大鼠為研究對(duì)象，考察三葉青超微粉對(duì)酒精性肝損傷大鼠的改善作用及其對(duì)腸道菌群的影響，為以三葉青超微粉作為主要原料的保肝護(hù)肝及腸道菌群調(diào)節(jié)產(chǎn)品的開發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí)SD 大鼠 6 周齡，60 只，雌、雄各半，體重180～210 g 左右，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)[SYXK（桂）2014-0003]，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，恒溫21～23 ℃，恒濕（45%～65%），各12 h 明暗周期的飼養(yǎng)室，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；三葉青 采集于百色興業(yè)縣三葉青種植基地，挑選出無蟲孔，顏色形狀正常的塊根，洗凈表面泥沙等雜質(zhì)，自然曬干，用中藥粉碎機(jī)預(yù)粉碎后，用CJM-SY-A KC-701 型超微粉碎機(jī)粉碎至中位粒徑達(dá)到30～40 μm；56 度白酒 北京紅星股份有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸 北京協(xié)和藥廠；過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其它試劑 均為分析純。

CJM-SY-A KC-701 型超微粉碎機(jī) 北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；BS-2000 型全自動(dòng)化學(xué)分析儀 深圳邁瑞科技股份有限公司；5810R 型高速低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；CX31+DP73 型倒置顯微鏡 奧林巴斯有限公司；MK3-EL800 光吸收酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與給藥 將動(dòng)物隨機(jī)分為6 組，每組10 只，分別為正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯LBSZ 150 mg·kg-1）和三葉青超微粉低（0.25 g·kg-1）、中（0.5 g·kg-1）、高（1.0 g·kg-1）劑量組。除正常對(duì)照組給同劑量的生理鹽水外，其余各組大鼠均用白酒灌胃造模，參照劉明等[14]的造模方法，30°白酒1 mL/（200 g·d）灌胃1 周后，改為56°白酒1 mL/（200 g·d）灌胃1 周，最后增至56°白酒2 mL/（200 g·d）灌胃至造模成功，即連續(xù)灌胃8 周。每天給酒4 h 后，陽性對(duì)照組和3 個(gè)三葉青劑量組各大鼠1 mL/200 g 灌胃給藥8 周直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，正常對(duì)照組和模型組灌胃同體積的生理鹽水。

1.2.2 樣品采集 參照劉澤鑫、朱詩雅等[15-16]的方法，末次給藥后，無菌條件下采集各組大鼠新鮮糞便，-80 ℃?zhèn)溆谩?dòng)物禁食不禁水，24 h 后經(jīng)麻醉心臟取血，測(cè)定血清生化指標(biāo)。另外取肝組織固定于多聚甲醛固定液，用于做病理切片。其余肝組織用預(yù)冷生理鹽水清洗后，凍存于-80 ℃冰箱，備用。

1.2.3 血清生化指標(biāo)的檢測(cè) 參照劉澤鑫、朱詩雅等[15-16]的方法，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各種動(dòng)物的血液生化指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）。

1.2.4 肝組織生化指標(biāo)的檢測(cè) 參照劉澤鑫、朱詩雅等[15-16]的方法，稱取適量的肝組織，按重量體積比（組織:生理鹽水=1:9）加入冰冷的生理鹽水，剪碎，冰上勻漿，3000 r·min-1離心10 min，制成10%肝組織勻漿，過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）及蛋白定量按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 組織病理檢查 參照劉澤鑫、朱詩雅等[15-16]的方法，將固定于多聚甲醛的部分肝大葉先用石蠟包埋，然后進(jìn)行切片，通過常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.6 大鼠腸道菌群分析 參照Shin 等[17]的方法，稱取200 mg 糞便樣品，按照DNA 提取試劑盒說明書上的操作步驟對(duì)各樣本DNA 進(jìn)行提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提基因組DNA 的完整性。取質(zhì)量合格的基因組DNA 樣品30 ng 及對(duì)應(yīng)的融合引物（全長(zhǎng)16S 擴(kuò)增引物：27F--AGRGTTYG ATYMTGGCTCAG 和1492R--RGYTACCTTGTTA CGACTT）配制PCR 反應(yīng)體系，設(shè)置PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。使用Agencourt AMPure XP 磁珠對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer，貼上標(biāo)簽，完成建庫(kù)。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的文庫(kù)根據(jù)插入片段大小，選擇pacbio 平臺(tái)進(jìn)行16S 全長(zhǎng)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，因?qū)嶒?yàn)過程中有個(gè)別組的小鼠會(huì)有死亡1～2 只的情況，所以n=8～10。生理指標(biāo)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組內(nèi)兩兩比較采用LSD 法。菌群數(shù)據(jù)分析使用USEARCH（v11.0.667）進(jìn)行OTU 聚類結(jié)果統(tǒng)計(jì)，R（v3.2.1）的mixOmics 包用于OTU PLSDA 分析，R（v3.1.1）的Venn Diagram 包用于繪制韋恩圖，RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。軟件mother（v.1.31.2）用于統(tǒng)計(jì)Alpha 多樣性。LEfSe 軟件進(jìn)行物種差異分析，Picrust 軟件進(jìn)行菌群功能預(yù)測(cè)。以上軟件均使用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠一般情況

造模過程中，正常對(duì)照組大鼠飲食及大便規(guī)律，皮毛色澤光亮，行動(dòng)靈活，體重增長(zhǎng)較快；模型組大鼠在每日給予酒精灌胃后出現(xiàn)反應(yīng)慢，步態(tài)不穩(wěn)，精神萎靡且部分呈現(xiàn)嗜睡狀態(tài)，持續(xù)約2 h，而2 周后該組大鼠皮毛色澤變暗，粗糙，精神狀態(tài)不佳，進(jìn)食量減少，體重增加變緩；三葉青給藥組和陽性對(duì)照組大鼠一般情況優(yōu)于模型組。

2.2 三葉青超微粉對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST 和ALP 的影響

如圖1 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP 濃度均明顯升高約1.5 倍。與模型組相比，陽性對(duì)照組大鼠血清的ALT、AST和ALP 濃度明顯降低；中、高劑量實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中的ALT、AST 和ALP 濃度均有所降低，其中，在中劑量組大鼠中，ALT 濃度降低至（36.33±3.79） U·L-1（P＜0.05），AST 濃度降低至（135.11±21.24） U·L-1（P＜0.01），ALP 濃度降低至（85.00±41.21） U·L-1（P＜0.05）；在高劑量組大鼠中，ALT、AST 和ALP 濃度均降低，但無顯著性差異；低劑量組大鼠血清中的ALT、AST、ALP 濃度均無顯著性變化。

圖1 三葉青超微粉對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST 和ALP 的影響Fig.1 Effects of SYQ on the activity of ALT, AST and ALP induced by ethanol in rat serum

上述結(jié)果提示，酒精連續(xù)灌胃8 周后，可引起大鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶升高，顯示出肝臟毒性，聯(lián)苯雙酯、中劑量三葉青對(duì)酒精導(dǎo)致的大鼠肝損傷具有保護(hù)作用，高劑量三葉青對(duì)酒精導(dǎo)致的大鼠肝損傷可能具有保護(hù)作用，低劑量三葉青對(duì)酒精導(dǎo)致的大鼠肝損傷未顯示出保護(hù)作用。

2.3 三葉青超微粉對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖2 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟中GSH、SOD 濃度均降低，而MDA 濃度升高。與模型組相比，陽性藥組和低、中、高劑量組大鼠肝臟中GSH、SOD 濃度均有所升高，MDA 濃度下降。其中，在中劑量組實(shí)驗(yàn)大鼠中，GSH 濃度升高至（4.18±0.45） μg·mg-1（P＜0.01），SOD 濃度升高但無顯著性差異，MDA 濃度降低至（0.54±0.14） nmol·mg-1（P＜0.05）；在低劑量組實(shí)驗(yàn)大鼠中，GSH、SOD 濃度升高但無顯著性差異，MDA 濃度降低至（0.55±0.22） nmol·mg-1（P＜0.05）；在高劑量組實(shí)驗(yàn)大鼠中，SOD 濃度升高至（9505.51±1252.47） U·mg-1（P＜0.05），GSH、MDA 濃度有變化但無顯著性差異。

圖2 三葉青超微粉對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠肝組織GSH、SOD 和MDA 的影響Fig.2 Effects of SYQ on GSH, SOD and MDA in liver tissue of rat caused by ethanol

上述結(jié)果提示，連續(xù)灌胃8 周酒精后，可引起大鼠肝臟中MDA 水平升高，GSH 和SOD 水平降低，表現(xiàn)出氧化應(yīng)激損傷。中劑量三葉青可改善酒精所引起的氧化應(yīng)激水平變化，而低、高劑量三葉青雖也能改善氧化應(yīng)激水平，但無明顯劑量依賴性。

2.4 三葉青超微粉對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠肝組織病理觀察

如圖3 所示，在正常對(duì)照組中（3A），可見肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞索排列整齊，肝血竇正常；在模型組中（3B），可見肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)彌漫性的圓形脂滴，肝小葉界限模糊，小葉內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)點(diǎn)狀或灶狀壞死，匯管區(qū)見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。三葉青各劑量組（3D、3E、3F）及陽性對(duì)照組（3C）肝細(xì)胞腫脹減輕，脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較模型組有所改善。

圖3 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE, 200×）Fig.3 Histopathological changes of each group（HE, 200×）

上述結(jié)果提示，連續(xù)灌胃8 周酒精后，可引起大鼠肝細(xì)胞腫脹和彌漫性脂滴等損傷，結(jié)合生理指標(biāo)的變化，說明ALD 模型造模成功。三葉青超微粉明顯改善酒精所引起的肝細(xì)胞腫脹和脂肪變性，治療效果類似于陽性對(duì)照藥聯(lián)苯雙酯，療效中劑量組＞高劑量組＞低劑量組。

2.5 三葉青超微粉對(duì)慢性酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響

2.5.1 OTU 聚類分析 以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，OTU 表示一組來源于某一相同分類單元的序列，OTU 數(shù)量越大說明微生物群落的多樣性越大。如圖4 所示，共產(chǎn)生795 個(gè)OTU，其中CK:674，M:566，Y:592，ST:644，所有樣品共有的OTU數(shù)目為393 個(gè)，約占總OTU 數(shù)的49%，其余各組獨(dú)有的OTU 數(shù)目分別為CK:42，M:2，Y:23，ST:19。酒精處理會(huì)降低大鼠腸道菌群多樣性，三葉青和陽性藥均可使物種多樣性得到改善。如圖5 所示，OTU 累積曲線圖末端上升趨勢(shì)趨于平緩，表明采樣量足夠，繼續(xù)增加測(cè)序深度只會(huì)產(chǎn)生少量新的OUT。

圖4 OTU Venn 圖Fig.4 OTU Venn

圖5 OTU 累積曲線圖Fig.5 OTU diagram of integration

2.5.2 OTU PLS-DA 分析 為了更好地分析各組間差異，進(jìn)行了PLS-DA 分析。如圖6 所示，模型組（M）、陽性對(duì)照組（Y）、三葉青中劑量組（ST）均與正常對(duì)照組（CK）明顯區(qū)分開來，說明酒精處理可對(duì)大鼠腸道微生物物種多樣性造成顯著差異，三葉青中劑量組（ST）與模型組（M）之間差異較小。

圖6 OTU PLS-DAFig.6 OTU PLS-DA

2.5.3 Alpha 多樣性 Alpha 多樣性是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。選擇observed Species 指數(shù)、Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)，Shannon 指數(shù)以及Simpson 指數(shù)評(píng)價(jià)其Alpha 多樣性。前4 個(gè)指數(shù)越大，最后一個(gè)指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富。其中，observed Species 指數(shù)、Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)反映樣品中群落的豐度，只與群落中物種的數(shù)量有關(guān)，與群落中每個(gè)物種的豐度無關(guān)；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映群落的多樣性，與樣品群落中物種豐度和物種均勻度有關(guān)。如表1 所示，前三項(xiàng)指標(biāo)指示各樣品的物種豐度規(guī)律較一致，由高到低依次為：正常對(duì)照組（CK）＞三葉青中劑量組（ST）≈陽性對(duì)照組（Y）＞模型組（M），說明灌胃酒精會(huì)顯著降低大鼠腸道菌群物種豐度，三葉青或陽性藥組大鼠腸道菌群物種豐度有所升高，效果相近，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。后兩項(xiàng)指標(biāo)指示樣品的物種多樣性和均勻度變化與豐度變化一致。

表1 Alpha 多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index

2.5.4 三葉青超微粉誘導(dǎo)酒精性肝損傷大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化 通過與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，將OTU 在不同的分類等級(jí)進(jìn)行分類并注釋，得到物種注釋柱狀圖。如圖7 所示，在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）在所有樣品中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度之和均在80%以上。與正常對(duì)照組相比，模型組厚壁菌門豐度極顯著降低（P＜0.01），擬桿菌門、變形菌門豐度顯著升高（P＜0.05），三葉青中劑量組、陽性對(duì)照組均可使其得到恢復(fù)，且三葉青中劑量組效果更優(yōu)。如圖8 所示，在屬水平上，與正常對(duì)照組相比，模型組普雷沃菌屬（Prevotella）、厭氧螺菌屬（Anaerobiospirillum）顯著增加（P＜0.05），三葉青中劑量組、陽性藥對(duì)照組均得到恢復(fù)，普雷沃菌屬三葉青效果更優(yōu)，厭氧螺菌屬陽性藥更優(yōu)；模型組、三葉青中劑量組、陽性藥對(duì)照組較正常對(duì)照組Lachnoclostridium、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Muribaculum、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、支原體屬（Allobaculum）、真桿菌屬（Eubacterium）、羅姆布茨菌（Romboutsia）減少，三葉青中劑量組乳桿菌屬、Muribaculum、羅姆布茨菌可得到有效恢復(fù)。

圖7 基于門（phylum）分類水平的分析Fig.7 Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum level

圖8 基于屬（genus）分類水平的分析Fig.8 Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level

如圖9 所示，在種水平上，模型組、陽性藥對(duì)照組較正常對(duì)照組產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌（Eubacterium coprostanoligenes）、腸道粘液桿菌（Muribaculumintestinale）減少，三葉青中劑量組得到恢復(fù)；模型組、三葉青中劑量組較正常對(duì)照組產(chǎn)琥珀酸厭氧螺桿菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）增加，陽性對(duì)照組得到有效恢復(fù)；模型組較正常對(duì)照組人體普氏菌（Prevotella copri）顯著增加，三葉青中劑量組、陽性對(duì)照組均得到有效恢復(fù)。

圖9 基于種（species）分類水平的分析Fig.9 Analysis of intestinal microbial flora among groups in species level

在種水平上對(duì)具有顯著性差異（P＜0.05）的菌種進(jìn)行分析，繪制差異菌種熱圖。如圖10 所示，模型組（M）約氏乳桿菌（Lactobacillus_johnsonii）、毛桿菌（Raoultibacter_massiliensis）豐度較正常對(duì)照組（CK）顯著降低，三葉青中劑量組（ST）能有效恢復(fù)酒精降低的約氏乳桿菌、毛桿菌豐度，效果優(yōu)于陽性藥對(duì)照組（Y）；同時(shí)三葉青中劑量組Gabonia_massiliensis、Collinsella_stercoris、普雷沃氏菌（Prevotella_stercorea）、Turicibacter_sanguinis、副腐化梭狀芽胞桿菌（Clostridium_paraputrificum）豐度增加，與其它三組差異顯著。相關(guān)研究表明約氏乳桿菌具有抗炎、緩解抑郁、提升腸道代謝率、改善過敏等多種益生作用[18-20]；過敏、多發(fā)性硬化癥等的發(fā)生均與普雷沃氏菌豐度減少有關(guān)，普雷沃氏菌可參與治療肥胖、代謝綜合征、炎性腸病等，但作用及機(jī)制等還需進(jìn)一步探究驗(yàn)證；Turicibacter_sanguinis在腸道中表達(dá)一種神經(jīng)遞質(zhì)鈉轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白[21]；Gabonia_massiliensis等其他幾個(gè)菌種可查證的資料較少，對(duì)人體的利弊等還有待進(jìn)一步研究。

圖10 差異顯著的菌種熱圖Fig.10 Heatmap of significantly differential species

2.5.5 差異物種分析及功能預(yù)測(cè) 根據(jù)多級(jí)物種差異判別（LEfSe）分析顯示了四組間豐度差異顯著的物種，如圖11 所示，正常對(duì)照組（CK）中菌群結(jié)構(gòu)主要以伊格爾茲氏菌目（Eggerthellales）中的伊格爾茲氏菌科（Eggerthellaceae），擬桿菌門（Bacteroidetes）中的臭桿菌科（Odoribacteraceae），厚壁菌門（Firmicutes）中的鏈球菌科（Streptococcaceae）為代表；而酒精處理后的模型組（M）中菌群結(jié)構(gòu)只剩擬桿菌門中普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）占優(yōu)勢(shì)；陽性對(duì)照組（Y）中以擬桿菌門中擬桿菌科（Bacteroidaceae），擬桿菌綱（Bacteroidia）擬桿菌目（Bacteroidales），以及草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）為代表，三葉青中劑量組（ST）中則以厚壁菌門中的氨基酸球菌目（Acidaminococcales）氨基酸球菌科（Acidaminococcaceae）為代表。因此，酒精造成大鼠腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)，采用陽性藥和三葉青干預(yù)在一定程度上促進(jìn)了腸道菌群多樣性及組成結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。

圖11 LEfSe 分析聚類圖Fig.11 LEfSe analysis of cluster graph

基于16S rRNA 基因測(cè)序數(shù)據(jù)使用PICRUSt 軟件預(yù)測(cè)其功能基因含量，以評(píng)估各組微生物之間潛在的功能差異，并采用kruskal test 檢驗(yàn)差異顯著性，篩選出差異顯著（P＜0.05）的代謝通路并制作熱圖。如圖12 所示，與正常對(duì)照組（CK）比較，酒精持續(xù)灌胃后多條代謝途徑出現(xiàn)了顯著差異，其中三羧酸循環(huán)（TCA cycle），氨基酸降解（Amino Acid Degradation），碳1 化合物利用及同化（C1 Compound Utilization and Assimilation）顯著升高，而氨和聚氨降解（Amine and Polyamine Degradation），發(fā)酵（Fermentation），碳水化合物降解（Carboxylate Degradation），抗生素抵抗（Antibiotic Resistance），氨基酸合成（Amino Acid Biosynthesis），呼吸途徑（Respiration）則顯著下調(diào)。同期三葉青干預(yù)后，氨和聚氨降解，發(fā)酵途徑，抗生素抵抗，呼吸途徑均得到了部分恢復(fù)。三葉青和陽性藥均上調(diào)了脂肪酸與脂質(zhì)降解，電子傳遞途徑，且陽性藥的提高幅度更大，此外，陽性對(duì)照還提高了三羧酸循環(huán)的代謝強(qiáng)度。酒精處理導(dǎo)致腸道微生物發(fā)生很大改變，尤其是厚壁菌門物種的相對(duì)豐度急劇降低，微生物多樣性下降，菌群的潛在功能也被改變。通過陽性藥和三葉青的干預(yù)，腸道菌群的部分功能得到有效恢復(fù)。

圖12 差異顯著的二級(jí)代謝途徑功能分析熱圖Fig.12 Heatmap of functional analysis of significantly different secondary metabolic pathways

3 討論與結(jié)論

酒精性肝病（ALD）是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括廣泛的肝損害，從脂肪變性到肝硬化、肝癌。細(xì)胞損傷、炎癥、氧化應(yīng)激、再生和細(xì)菌易位是酒精性肝損傷的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[22]。理想的ALD 動(dòng)物模型應(yīng)包括ALD 過程的所有方面：顯著的血清ALT、AST 濃度升高、脂肪變性、肝中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肝損傷[23]。而本課題采用連續(xù)灌胃的方式制備ALD模型大鼠，結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃8 周后，模型組大鼠血清中ALT、AST 活性明顯升高，肝組織肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)大量脂滴和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，呈脂肪性病變狀態(tài)，表明ALD 模型制備成功。

酒精性肝損傷的模式包括炎癥、不同類型的細(xì)胞死亡（主要是凋亡和壞死）、脂肪變性、纖維形成，甚至肝再生。血清ALT 和AST 水平高低常作為判定肝損傷程度的重要指標(biāo)。這兩種轉(zhuǎn)氨酶肝細(xì)胞內(nèi)的濃度比血清高1000～5000 倍，肝細(xì)胞發(fā)生炎癥病變時(shí)，引起肝細(xì)胞腫脹、壞死和肝細(xì)胞膜通透性增高等，ALT、AST 由于濃度梯度差釋放入血，使血清轉(zhuǎn)氨酶濃度升高。又由于肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活性比循環(huán)內(nèi)總活性高104 倍，只要有1%肝細(xì)胞壞死，血中轉(zhuǎn)氨酶活性增加1 倍[1,24]。本研究結(jié)果顯示，在灌胃酒精的同期，大鼠給予中劑量三葉青，血清中ALT、AST 含量均明顯降低；三葉青能明顯改善酒精所引起的肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明適宜劑量的三葉青超微粉對(duì)大鼠酒精性肝損傷具有實(shí)質(zhì)性的保護(hù)作用。

已有研究表明三葉青黃酮可通過調(diào)節(jié)Treg/Th17 免疫穩(wěn)態(tài)抑制炎癥免疫反應(yīng)，進(jìn)而改善Con A 導(dǎo)致的免疫性肝損傷[25]；三葉青可通過提高肝細(xì)胞抗氧化能力、降低膜脂質(zhì)過氧化、保護(hù)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性而改善CCl4致急性肝損傷[26]；三葉青多糖具有抗氧化應(yīng)激作用，表現(xiàn)為降低肝臟MDA 含量，恢復(fù)肝臟抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 活性[27]；三葉青乙酸乙酯提取物可通過調(diào)節(jié)HepG2 和SMMC-7721 細(xì)胞的Caspase-3、Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗增殖和促凋亡的作用[28]，且HepG2 細(xì)胞凋亡是通過線粒體-caspase 內(nèi)源性途徑介導(dǎo)的，而不是通過死亡受體/caspase-8 途徑介導(dǎo)，這有助于開發(fā)肝母細(xì)胞瘤或肝癌的藥物治療[29]。

酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中，氧化應(yīng)激和膜磷脂過氧化作用對(duì)酒精性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展起關(guān)鍵作用。長(zhǎng)期攝入酒精導(dǎo)致肝組織氧化應(yīng)激增加、脂質(zhì)過氧化和抗氧化酶活性降低[30]。丙二醛（MDA）是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性。其含量可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映體內(nèi)氧自由基生成量和活性，以及機(jī)體和細(xì)胞的受損程度[31]。本研究中，三葉青超微粉不同劑量組MDA 含量明顯降低，表明三葉青在機(jī)體對(duì)抗酒精引起的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化的過程中起到了積極作用。經(jīng)胃腸道吸收，約90%酒精在肝細(xì)胞內(nèi)氧化代謝。當(dāng)機(jī)體一次性大劑量攝入酒精后，超出了肝臟正常的解毒能力，在肝細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生大量有害自由基，耗竭肝細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD 和GSH 均是機(jī)體重要的氧自由基清除酶，是肝肺等多種組織重要的抗氧化防御因子，能夠清除活性氧自由基及其誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[32]。本研究中，大鼠給予中、高劑量三葉青超微粉，GSH、SOD 活力明顯上升，表明三葉青超微粉有助于機(jī)體清除酒精代謝過程中產(chǎn)生的自由基，進(jìn)而有效促進(jìn)機(jī)體抗氧化應(yīng)激作用，緩解肝損傷。

大量研究證明酒精性肝損傷與腸道菌群失調(diào)緊密相關(guān)。酒精引起腸道益生菌減少，致病菌過度生長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致腸道內(nèi)容物中內(nèi)毒素增加，加之腸黏膜屏障受損，腸道內(nèi)細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)隨門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，進(jìn)而導(dǎo)致肝損傷[33]。通過對(duì)酒精性肝病患者的腸道菌群進(jìn)行宏基因組分析，證實(shí)長(zhǎng)期攝入酒精會(huì)明顯降低機(jī)體厚壁菌門、乳桿菌屬豐度，而革蘭陰性菌變形菌門及革蘭陽性菌放線菌門等有害菌數(shù)量增加[34-35]；腸道菌群失調(diào)可通過與宿主免疫系統(tǒng)及其它細(xì)胞互作，影響肝性脂肪變性、炎癥及纖維化程度[36]。同時(shí)，通過調(diào)節(jié)腸道菌群來改善治療酒精性肝病得到越來越多學(xué)者的認(rèn)可，Grander[37]表示口服Akk 菌可恢復(fù)酒精誘導(dǎo)的Akk 菌損耗，進(jìn)而減少肝損傷、脂肪肝和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，防止酒精誘導(dǎo)的腸泄露，增加腸道黏液厚度和緊密連接蛋白的表達(dá)；王文成[38]首次闡明了海兔素可通過調(diào)節(jié)慢性酒精性肝損傷大鼠的腸道菌群達(dá)到保肝效果。本研究結(jié)果顯示：酒精處理會(huì)顯著降低大鼠腸道菌群多樣性，降低厚壁菌門、乳桿菌屬豐度，增加變形菌門、普雷沃菌屬豐度，三葉青中劑量和陽性藥處理均可使其得到恢復(fù)，三葉青效果更優(yōu)；在種水平上，酒精造成約氏乳桿菌豐度顯著降低，三葉青中劑量組能有效得到恢復(fù)，效果優(yōu)于陽性藥對(duì)照組；通過進(jìn)一步基于16S rRNA 測(cè)序的菌群基因預(yù)測(cè)分析，酒精導(dǎo)致大鼠腸道微生物發(fā)生很大改變，菌群的潛在功能也被改變，KEGG 二級(jí)代謝通路顯示，通過陽性藥和三葉青的干預(yù)，腸道菌群的功能可得到一定的恢復(fù)，且陽性藥對(duì)代謝通路的恢復(fù)好于三葉青，這也和相關(guān)的生理指標(biāo)表現(xiàn)一致。

目前，臨床上仍以戒酒為治療ALD 的主要手段，酒精性肝損傷的早期預(yù)防尤為重要，故需要找到能有效預(yù)防ALD 及延緩肝病發(fā)展的藥物。本實(shí)驗(yàn)觀察了三葉青超微粉對(duì)大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，三葉青可顯著降（P＜0.05） 低酒精性肝損傷誘發(fā)的血清ALT、AST、ALP 水平，可使肝組織中GSH、SOD 恢復(fù)，MDA 含量明顯下降，表明三葉青可提高機(jī)體的抗氧化能力，抑制自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生；并能有效恢復(fù)酒精導(dǎo)致的大鼠腸道菌群豐度降低，提高約氏乳桿菌等有益菌豐度。

本研究初步分析三葉青超微粉對(duì)酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用，為三葉青的進(jìn)一步開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍有一定的局限性，后期應(yīng)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，篩選三葉青有效活性成分，以期為酒精性肝損傷的研究提供借鑒意義。