頸動脈粥樣硬化差異表達基因HMGB1、CCL3、CCL3L1、CCL4和DUSP1的驗證*

陳舉海,許逢燕,張書萍,王明棟,金 欣,莫顯剛△

1.貴州醫科大學臨床醫學院,貴州貴陽 550004;2.貴陽市公共衛生救治中心內三科,貴州貴陽 550004;3.貴州醫科大學附屬醫院綜合病房,貴州貴陽 550004

動脈粥樣硬化(AS)是心血管事件發生的主要因素[1],其發病機制尚未完全闡明。AS作為一種慢性血管炎癥性疾病[1],單核細胞在其發生發展中起著關鍵作用,單核細胞相關基因可能是識別AS的關鍵[2]。利用生物信息學方法識別差異表達基因可用于診斷疾病[3]。本研究前期從GEO數據庫的GSE23746數據集下載頸AS(CAS)轉錄組數據,于MsigDB數據庫下載單核細胞相關基因,利用生物信息學方法篩選出5個單核細胞相關差異表達基因[高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、趨化因子(C-C-基元)配體3(CCL3)、趨化因子(C-C-基元)配體3樣蛋白1(CCL3L1)、趨化因子(C-C-基元)配體4(CCL4)和雙特異性磷酸酶1(DUSP1)]作為CAS的特征基因。為進一步探索CAS的診斷生物標志物,本研究通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證上述特征基因的表達譜,并進行了蛋白互作分析(PPI)調控網絡、轉錄因子(TFs)調控網絡及競爭性內源RNA(ceRNA)網絡的探索,為CAS的機制研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 特征基因表達驗證試驗采用病例對照研究方法,選取2021年1-12月在貴陽市公共衛生救治中心經頸動脈彩超確診CAS患者20例作為CAS組,其中男10例,女10例;年齡(52.10±3.82)歲;體質量指數(22.26±1.37)kg/m2;舒張壓(77.40±7.71)mmHg;收縮壓(129.10±7.63)mmHg。同期招募了20例無CAS的健康志愿者作為對照組,其中男10例,女10例;年齡(49.80±4.86)歲;體質量指數(21.36±1.21)kg/m2;舒張壓(70.40±9.25)mmHg;收縮壓(121.80±9.46)mmHg。兩組基線資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。參加試驗受試者均需簽署知情同意書,本研究獲得貴陽市公共衛生救治中心倫理委員會審查通過[批件號:2021倫審第(202151)號]。CAS組納入標準:(1)年齡40～60周歲;(2)體質量指數為18.5～24.9 kg/m2;(3)頸動脈彩超提示CAS斑塊形成;(4)血常規、肝腎功能、血脂、血糖及血壓無顯著異常。排除標準:有急慢性感染、血液系統疾病、免疫系統疾病、嚴重心肺功能不全、近期手術或創傷、腫瘤等相關疾病者。

對照組納入標準:(1)年齡40～60周歲;(2)體質量指數為18.5～24.9 kg/m2;(3)頸動脈彩超無異常;(4)血常規、肝腎功能、血脂、血糖及血壓正常。排除標準:(1)有AS家族史、吸煙、飲酒者;(2)有急慢性感染、血液系統疾病、免疫系統疾病、嚴重心肺功能不全、近期手術或創傷、腫瘤等相關疾病者。

1.2儀器與試劑 紫外分光光度計(752)(上海菁華科技儀器有限公司)、核酸電泳裝置(北京市六一儀器廠)、2720 Thermal Cycler 普通PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、CFX96實時定量熒光PCR儀(美國Bio-Rad公司)、SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit(美國GeneCopoeia公司)、BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR Mix 2.0(美國GeneCopoeia公司)、Nuclezol LS RNA Isolation Reagent(美國ABP Biosciences公司)、引物(北京擎科生物科技股份有限公司)、無RNase水(北諾博萊科技公司)、TAE緩沖液(北京索萊寶生物科技有限公司)、DL2000 DNA Marker(日本Takara公司)、核酸染料(北京百泰克生物技術有限公司)、DEPC(美國AMRESCO公司)、EasySepTMHuman Monocyte Isolation Kit/EasySepTM人單核細胞分選試劑盒(加拿大STEMCELL Technologies公司)等。

1.3方法

1.3.1采集外周血樣本及外周血單核細胞分離 采集所有受試者外周血標本10 mL,分離外周血單核細胞,取外周血單核細胞到15 mL離心管中,再向每1 mL細胞懸液中加入50 μL Isolation Cocktail試劑和50 μL RapidSpheresTM磁珠,常溫孵育5 min,加入3倍于原始樣品體積的PBS(無Mg2+、Ca2+),輕輕混勻。將流式管置于EasySepTM磁極中,常溫孵育3 min,將得到的單核細胞液倒入嶄新的離心管中,10 mL PBS清洗兩遍,250×g離心10 min。棄上清即可得到外周血單核細胞。

1.3.2總RNA的提取 收集單核細胞,加1 mL TRIzol試劑充分裂解后,提取RNA沉淀并自然干燥,向干燥完成的RNA沉淀中加入30～50 μL的無RNase水,靜置15 min,使RNA徹底溶解,取3 μL RNA用TAE緩沖液稀釋到3 mL后上分光光度儀檢測A260和A280,計算RNA純度/濃度和下述步驟的上樣量,剩余RNA立即進行逆轉錄或凍存于-80 ℃冰箱中。

1.3.3逆轉錄 mRNA的逆轉錄使用美國GeneCopoeia公司的SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit試劑盒,按上樣要求加入RNA及各個試劑和溶液至20 μL,按照下述條件在普通PCR儀上進行逆轉錄:25 ℃,5 min;42 ℃,45 min;85 ℃,5 min;4 ℃,終止。

1.3.4上機檢測 先將上述逆轉錄產物cDNA稀釋10倍(所有樣品按照同一倍數進行稀釋)再進行下述qRT-PCR。mRNA的qRT-PCR反應檢測使用廣州Genecopoeia公司的BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR Mix 2.0試劑盒,按順序及上樣要求加入試劑至 10 μL。短暫離心后,按下列條件在CFX96實時定量熒光PCR儀進行20～40個循環的反應:預變性95 ℃,30 s;變性95 ℃,10 s;退火60 ℃,20 s;延伸72 ℃,30 s。采集記錄熒光,制作擴增曲線和溶解曲線,讀取Ct值。相關引物由擎科生物公司合成,引物序列見表1。

表1 特征基因引物序列

1.3.5結果分析 讀取Ct值后,用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量,具體為:第一步計算ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參基因);ΔΔCt=ΔCt(CAS組)-ΔCt(對照組);最后計算2-ΔΔCt值,用Graphpad Prism 6計算P值。

1.3.6特征基因的PPI調控網絡探索、TFs調控網絡和ceRNA機制探索 本研究使用STRING(https://www.string-db.org/)對CAS組與對照組的特征基因進行PPI。使用NetworkAnalyst (http://www.networkanalyst.ca)中的ChIP-seq數據,ENCODE數據庫預測了特征基因的潛在TFs。使用miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)數據庫完成基于特征基因的ceRNA機制預測。具體來說,從miRWalk數據庫中預測靶向特征基因的微小RNA(miRNA),從StarBase數據庫中預測靶向特征基因的miRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNA)關系對。

2 結 果

2.1特征基因mRNA的相對表達量 與對照組比較,HMGB1 mRNA相對表達量在CAS組中高表達(P<0.05),CCL3、CCL3L1、CCL4和DUSP1 mRNA相對表達量在CAS組中均低表達(P<0.01)。見表2。

表2 特征基因mRNA相對表達量對比

2.2特征基因的TFs調控網絡及lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡探索 本研究使用NetworkAnalysis來預測5個特征基因的TFs,結果CCL4、CCL3、DUSP1和HMGB1均預測到TFs,但CCL3L1沒有預測到TFs。通過NetworkAnalyst在線平臺和R包Cytoscape構建一個包含142個TFs和4個特征基因的網絡(CCL4、CCL3、DUSP1和HMGB1)。具體來說,9個TFs與CCL3相關;5個TFs與CCL4相關;129個TFs與DUSP1相關;12個TFs與HMGB1相關。在這些TFs中,EBF1是CCL3、CCL4和DUSP1共享的TF;CEBPB是CCL3和DUSP1共享的TF;NFIC和SUPT5H是CCL3和CCL4共享的TF;MAZ、GTF2F1、WRNIP1、RAD21、ZFX、SMAD5、MYNN和ZNF501是DUSP1和HMGB1共享的TFs。見圖1。

圖1 特征基因的TFs調控網絡

本研究基于miRWalk和 StarBase數據庫完成了基于特征基因的ceRNA機制預測,本網絡包含66個miRNA、39個lncRNA,其中85個mRNA和lncRNA以4個特征基因(CCL3、CCL4、DUSP1和HMGB1)為中心。CCL3共存在23種ceRNA機制(16個lncRNA通過競爭性結合23個miRNA調控CCL3表達);CCL4共存在17種ceRNA機制(12種lncRNA與17種miRNA結合);DUSP1共存在20種ceRNA機制(18個lncRNA與20個miRNA競爭性結合可調控DUSP1的表達;HMGB1共有25個ceRNA機制(25個miRNA可以被6個lncRNA競爭性結合DUSP1的表達)。lncRNA AL109811.1與hsa-miR-134競爭性結合,以及lncRNA AL358472.3與hsa-miR-887-3p競爭性結合均可調控CCL4和DUSP1;lncRNA AL391244.1與hsa-miR-151b和hsa-miR-151a-5p競爭性結合可調控CCL3和DUSP1的表達;hsa-miR-1914-3p與lncRNA MIR34AHG競爭性結合可調控CCL3和CCL4的表達。見圖2。

圖2 特征基因lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡

3 討 論

CAS是一種臨床常見病,對其機制研究一直備受關注。近年來,有研究發現,單核細胞相關基因可作為識別有心力衰竭風險的急性心肌梗死的診斷標志物[3]。由于單核細胞與CAS的發生發展密切相關,故單核細胞相關基因也有作為CAS特征基因的潛力,但相關研究較少,故本研究分析單核細胞相關基因探索CAS發病的分子機制,以期為CAS的診治研究提供重要線索。

本課題組前期通過對GSE23746數據集的轉錄組數據進行生物信息學分析,篩選出5個單核細胞相關差異表達基因(CCL4、CCL3、CCL3L1、DUSP1和HMGB1)作為CAS的特征基因。其中,CCL3作為CCR5的趨化因子配體,有研究發現,將CCL3缺失的骨髓移植到LDLR缺失的小鼠體內,可抑制AS進展[4]。CCL4在AS患者中水平升高,而抑制CCL4可穩定AS并減少內皮細胞和巨噬細胞的激活[5]。趨化因子及其受體是AS病變炎癥環境中的重要效應因子,CCL3和CCL4作為CCR5的趨化因子配體,在AS斑塊中表達上調[6]。CCL3L1是CCL3的亞型,其在許多炎癥反應中發揮重要作用,包括巨噬細胞和T細胞依賴的免疫反應[7],而CCL3已知與AS的發生發展有著密切關系[4],但目前CCL3L1與AS之間相關性的研究較少。DUSP1/絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)是一種核酶,MKP-1是控制單核細胞黏附和趨化MAPK通路的反調控因子,單核細胞和巨噬細胞中的DUSP1缺失通過影響巨噬細胞自噬、增強凋亡、調節巨噬細胞極化失調來加速AS的發生[8]。HMGB1是一種DNA結合蛋白,可促進AS的發展,血清HMGB1水平是2型糖尿病患者頸動脈斑塊易感性的獨立危險因素[9]。研究表明,氧化低密度脂蛋白可上調HMGB1在人臍靜脈內皮細胞中的表達,而下調HMGB1表達可預防氧化低密度脂蛋白誘導的內皮細胞損傷,HMGB1通過介導內皮細胞損傷參與AS的發生及病變的進展[10]。目前越來越多的研究采用生物信息學分析篩選差異表達基因作為某些疾病的診斷標志物,而本研究發現的這組差異表達的單核細胞相關基因未來或許可作為CAS的生物標志物,但仍需未來的基礎及臨床研究進行證實。

研究表明,TFs的改變可影響血管病理生理變化[11]。故本研究使用NetworkAnalysy預測了5個特征基因的TFs,結果顯示,CCL4、CCL3、DUSP1和HMGB1均預測到TFs,其中EBF1是CCL3、CCL4和DUSP1共享的TF;CEBPB是CCL3和DUSP1共享的TF;NFIC和SUPT5H是CCL3和CCL4共享的TF;MAZ、GTF2F1、WRNIP1、RAD21、ZFX、SMAD5、MYNN和ZNF501是DUSP1和HMGB1共享的TFs。YAMADA等[12]的研究發現,EBF1在AS斑塊中存在明顯低甲基化,這些低甲基化基因的過表達可能導致各種AS相關基因的表達發生明顯變化。CEBPD可促進血管病變處M1巨噬細胞內脂質積累[13]。對TF及其相互作用因子的功能研究對了解它們在信號級聯反應中的作用至關重要,可為CAS的基礎研究及生產應用提供理論依據。除此之外,有證據表明,miRNA和lncRNA參與了人類許多病理生理過程,包括AS[14-15]。故本研究在miRWalk和StarBase數據庫的基礎上,構建了一個ceRNA網絡,結果發現,lncRNA AL109811.1-hsa-miR-134和lncRNA AL358472.3-hsa-miR-887-3p競爭性結合均可調控CCL4和DUSP1的表達;lncRNA AL391244.1通過競爭性結合hsa-miR-151b和hsa-miR-151a-5p可調控CCL3和DUSP1的表達;hsa-miR-1914-3p與lncRNA MIR34AHG競爭性結合,可調控CCL3和CCL4的表達。關于上述ceRNA調控網絡的研究較少,但這為未來進行CAS的相關機制研究提供了一定思路。

上述研究表明,通過生物信息學分析篩選出的5個基因參與了AS的病理生理過程[4-10]。筆者前期研究采用套索算法和支持向量機遞歸特征消除算法等生物信息學分析方法對GSE23746數據集下載的CAS轉錄組數據和MsigDB數據庫下載單核細胞相關基因數據進行分析,最終篩選出的5個差異表達的單核細胞相關基因中有4個(CCL4、CCL3、CCL3L1、DUSP1)在CAS組中呈現出mRNA相對表達量下調,僅HMGB1 mRNA相對表達量上調[16]。為了證實生物信息學分析的結果,本研究收集了CAS組和對照組外周血單核細胞進行qRT-PCR驗證,結果保持一致。李戈銳等[17]的研究也發現,在CAS和冠狀動脈粥樣硬化患者與健康者的外周血單核細胞中分別篩選出16個和153個差異表達基因,且其表達均顯著下調,其中包括CCL3L1、CCL4,可能提示外周血單核細胞的炎癥信號受到抑制。然而這與既往研究顯示的促炎因子(如CCL3、CCL4)在AS斑塊中呈高表達的結論不一致[6]。針對外周單核細胞中CCL3、CCL4等基因與動脈粥樣硬化斑塊中表達不一致的這一現象,有研究提出,在AS患者的動脈中,巨噬細胞的炎癥反應呈過度激活,而機體可能存在負反饋機制來抑制外周血單核細胞的炎癥反應[18]。除此之外,有學者研究了人外周血和自體動脈粥樣硬化斑塊的趨化因子基因表達譜,結果顯示CCL2、CCL3和CCL4在外周血中低表達,在自體動脈粥樣硬化斑塊中高表達[19]。雖然有上述的解釋和推測,但仍缺乏直接的令人信服的證據。本研究所有數據均基于基因mRNA的相對表達量,未進行蛋白水平的檢測及分子機制的探索。鑒于此,未來可能需要更多的體內外實驗對其機制進行研究。

綜上所述,CCL4、CCL3、CCL3L1、DUSP1和HMGB1組成的5個單核細胞差異表達基因可作為CAS的特征基因,但仍需未來進一步的機制探索和分子驗證加以證實。