宮頸癌患者血清lncRNA XIST的表達及其意義*

朱慧婧,張 敏,張小霞,顧益鳳,鞠少卿,顧建美▲

1.南通大學附屬腫瘤醫院檢驗科,江蘇南通 226361;2.南通大學附屬醫院檢驗科,江蘇南通 226006

宮頸癌(CC)一直危害著女性的健康,是全世界女性最致命的惡性腫瘤[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染宮頸區域,侵及黏膜鱗狀上皮細胞,病變由宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅰ至CINⅢ逐漸發展,最終突破基底膜,發展為侵襲性CC[2]。雖然HPV疫苗的開發和應用減輕了該疾病在全球一定范圍內的負擔,但在許多國家和地區,特別是在疫苗覆蓋率較低的發展中國家,它依舊是一個重大的公共衛生問題[3-5]。在中國,CC的發病率以2%～3%的速度增加,并且越來越年輕化,每年新增的病例占全球新增病例的1/3左右[6]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)長度大于200 nt,因為缺少重要的開放讀碼框架[7],從而不具備蛋白質編碼的功能。LncRNA已被證明在基因表達中具有重要的調控作用[8]。既往研究表明,lncRNA與CC存在著一定的病理聯系[9]。而且,有證據表明lncRNA可能為CC的治療提供新方法[10]。LncRNA可直接在血漿或血清標本中檢出,并具有高靈敏度、高特異度、簡單快速、微創等優點,這也為其用于臨床研究,作為一種新型生物學標志物和治療靶點提供了可能性。LncRNA XIST是哺乳動物中發現的第1個lncRNA[11],以前關于lncRNA XIST的研究多集中在發育胚胎中啟動激活的作用上,后來研究發現lncRNA XIST表達不當被認為是腫瘤發生的潛在機制,這可能與異染色質穩定性改變導致的基因表達變化有關[12]。LncRNA XIST已被廣泛應用于多種高發腫瘤的研究中。在結直腸癌中,YANG等[13]發現lncRNA XIST通過調控miR-93-5p/HIF-1A/AXL信號通路促進結直腸癌的發生。SHI等[14]發現,lncRNA XIST通過海綿miR-148a-3p的相互作用,促進喉部鱗狀細胞癌的進展。TIAN等[15]發現,黑色素瘤組織和細胞中lncRNA XIST相對表達水平升高,lncRNA XIST可作為miR-139-5p的分子海綿發揮促癌作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年12月至2019年12月南通大學附屬腫瘤醫院的92例初診CC患者作為CC組,年齡28～86歲,平均(48.5±3.5)歲;60例CIN患者作為CIN組,年齡29～74歲,平均(48.0±4.5)歲;38例子宮良性病變患者(包括子宮肌瘤和宮頸炎)作為良性病變組,年齡30～56歲,平均(43.5±13.5)歲;54例體檢健康者作為對照組,年齡28～74歲,平均(54.0±5.0)歲。各組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。CC及CIN患者均經細胞學或病理組織學證實,入院前無任何手術及治療。本研究經南通大學附屬腫瘤醫院倫理委員會許可,所有受試者均獲知情同意。

1.2方法

1.2.1標本采集及血清總RNA的提取 真空管采集各研究對象空腹靜脈血5 mL,自然凝固后3 400 r/min離心10 min,吸取上層血清于RNase-free EP管內,唯一標識編號于-80 ℃冰箱保存。使用北京BioTake有限公司提供的提取試劑盒從300 μL血清中提取總RNA,其純度由美國Thermo Fisher公司的超微量分光光度計檢測,檢測合格后逆轉錄為cDNA。

1.2.2血清總RNA逆轉錄為互補cDNA 使用美國Thermo Fisher公司提供的逆轉錄試劑盒,按使用說明書將總RNA逆轉錄為互補cDNA。逆轉錄反應體系:11 μL總RNA,5×RT buffer 4 μL,dNTP 2 μL,OligoDT primer 1 μL,Ribolock Rnase Inhibitor 1 μL,Reverse Transcriptase 1 μL,總共20 μL。設置逆轉錄反應程序:42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,4 ℃ ∞,上機逆轉錄停止后取出,可放于-20 ℃待用。

1.2.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 qRT-PCR反系包括SYBR Green Ⅰ Master mix(Rox)10 μL,cDNA 3 μL,上游引物和下游引物各0.5 μL,無核酸酶水6 μL共20 μL。18S作為內參照,整個過程都需要避光,lncRNA XIST分子和18S內參各做3個復孔。引物序列見表1。反應程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s;45個循環。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA XIST的相對表達水平。SYBR Green Ⅰ染料來自南京諾唯贊生物科技有限公司,lncRNA XIST引物和18S引物分別由廣州銳博生物科技和上海生工生物工程股份有限公司提供。qRT-PCR擴增儀7500來自美國ABI公司。

表1 引物序列

1.3統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件、Graphpad Prism7繪圖軟件進行數據處理及統計分析。各實驗組血清中lncRNA XIST相對表達水平用M(P25,P75)表示;兩兩比較采用非參數Mann-WhitneyU檢驗,多個獨立樣本之間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。相關性分析采用非參數Spearman相關分析。采用受試者工作特征(ROC)曲線評價各檢測指標在CC輔助診斷中的價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1線性范圍 取CC組3份混合血清的cDNA標本,將其按照(1、10、100、1 000、10 000)倍數進行梯度稀釋,并對lncRNA XIST分子與18S分別進行qRT-PCR檢測。根據測定的Ct值和稀釋倍數之間的關系繪制標準曲線,并計算其擴增效率。橫坐標為稀釋倍數(log),縱坐標為所測得的Ct 值,所得線性方程為:Y=-3.095X+27.366,擴增效率E=1.10(E=10-1/slope-1),相關系數R2= 0.995。18S的方程為:Y=-3.069X+18.892,擴增效率E=1.12(E=10-1/slope-1),相關系數R2=0.993。梯度稀釋后qRT-PCR檢測血清lncRNA XIST與18S的擴增曲線(見圖1A、1B)。說明該方法線性良好,qRT-PCR可用于檢測不同濃度的血清lncRNA XIST相對表達水平。取6份健康血清混合后分裝在EP管內,取出5份分別置于室溫下0、6、12、18、24 h,另外5份-80 ℃冷凍,解凍0、1、3、5、7次,檢測lncRNA XIST相對表達水平,結果見圖1C、1D。lncRNA XIST在不同室溫放置時間及不同凍融循環次數環境下保持穩定,結果比較差異無統計學意義(P>0.05)。

注:A、B為梯度稀釋后qRT-PCR檢測血清lncRNA XIST與18S的擴增曲線;C、D為lncRNA XIST在不同室溫放置時間及不同凍融循環次數環境的相對表達水平。

2.2CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平與CA125、SCCAg的相關性 CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平與CA125(P=0.736,r2<0.001 7)、SCCAg(P=0.852,r2=0.000 5)均無相關性(P>0.05)。見圖2。

注:A、B分別為CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平與CA125、SCCAg的相關性散點圖。

2.3各組血清lncRNA XIST相對表達水平比較 CC、CIN、子宮良性病變患者和健康者血清lncRNA XIST相對表達水平分別為1.840(1.389,2.095)、1.543(1.143,1.857)、1.336(0.998,1.818)、1.000(0.852,1.101)。其中CC組、CIN組、良性病變組lncRNA XIST相對表達水平高于對照組(P<0.01);CC組lncRNA XIST相對表達水平高于CIN組及良性病變組(P<0.01);CIN組與良性病變組lncRNA XIST相對表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 血清lncRNA XIST在CC、CIN、良性病變及對照組中的相對表達水平

2.4CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平與臨床病理參數間的關系 不同年齡、絕經狀態、腫瘤FIGO分期、淋巴結轉移CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平差異有統計學意義(P<0.05),不同腫瘤最大徑CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平與臨床病理參數的關系[M(P25,P75)]

2.5ROC曲線分析 鑒別CC患者與健康者的ROC曲線分析結果顯示,當lncRNA XIST相對表達水平以1.158為最佳截斷值時,其曲線下面積(AUC)為0.910(95%CI:0.861～0.960);SCCAg以2.250 ng/mL為最佳截斷值時,其AUC為0.882(95%CI:0.829～0.936);CA125以23.315 U/mL為最佳截斷值時,其AUC為0.698(95%CI:0.613～0.782),lncRNA XIST鑒別CC患者與健康者的AUC最大,說明其鑒別CC患者與健康者的診斷效能最好,見圖4。通過ROC曲線得到的最佳截斷值,分別計算lncRNA XIST、SCCAg、CA125單獨及聯合檢測的靈敏度、特異度、準確度、陽性及陰性預測值,結果顯示,lncRNA XIST鑒別CC患者與健康者的靈敏度達90.21%,優于SCCAg與CA125單項檢測,兩兩聯合和三者聯合時靈敏度均得到提高,三者聯合時最高達98.91%。見表3。

圖4 鑒別CC患者與健康者的ROC曲線

表3 各指標鑒別CC患者與健康者的診斷效能

鑒別CC患者與CIN及子宮良性病變患者的ROC曲線分析結果顯示,當lncRNA XIST相對表達水平以1.859為最佳截斷值時,其AUC為0.675(95%CI:0.600～0.751);SCCAg以2.95 ng/mL為最佳截斷值時,其AUC為0.826(95%CI:0.769～0.884);CA125以23.76 U/mL為最佳截斷值時,其AUC為0.567(95%CI:0.485～0.649),結果表明,lncRNA XIST的AUC低于SCCAg,但高于CA125,見圖5。鑒別CC患者與CIN及子宮良性病變患者時,3個指標檢測靈敏度都不是很高,但三者聯合檢測靈敏度得到大幅度提高,達到90.22%,見表4。

圖5 鑒別CC患者與CIN及子宮良性病變患者的ROC曲線

表4 各指標鑒別CC患者與CIN及子宮良性病變患者的診斷效能

3 討 論

有報道顯示,早期CC患者治愈率很高,可達到80%,甚至90%,而晚期患者的治愈率僅為60%[16]。因此做好CC的早期診斷及治療對患者的長期生存極其重要。HPV和薄層液基細胞學(TCT)檢查作為臨床常用的CC早期篩查項目,存在很多影響因素。TCT檢查是一種形態學檢查,其最終的診斷結果不僅與取樣質量、制片技術有關,還受閱片醫師水平等因素的影響。而HPV的感染陽性率雖然很高,但很多人是一過性感染,自身免疫系統可以將其清除,還有很多患者因開始只表現為宮頸炎的癥狀而容易被臨床漏診。臨床傳統用于CC輔助診斷的腫瘤標志物為CA125和SCCAg,但其靈敏度和特異度不高,因此迫切需要探索更加高效的生物學標志物用于CC的早期篩查。

有研究發現,lncRNA是人類癌癥中有前途的生物學靶點[17]。LncRNA的失調與癌癥發生發展有關[18],QI等[19]研究發現,lncRNA的失調與CC的發生發展有關。LncRNA XIST是研究較多的長鏈分子,從TCGA數據庫中得知lncRNA XIST在CC中的突變頻率很高。有研究證明,CC及CIN發生的主要原因是高危型HPV的持續感染,但它并不是CC發生的唯一因素,基因改變更是CC發生發展重要的影響因素[20]。因此,本研究推測lncRNA XIST的變化可能與CC密切相關。

CC在分子水平上的相關研究引起了很多學者的關注,本研究結果發現,CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平升高,與LIU等[21]在CC組織中的研究結果一致。CC患者血清lncRNA XIST相對表達水平高于CIN、子宮良性病變患者及健康者,表明血清lncRNA XIST對CC輔助診斷有一定意義。本研究根據測定的Ct值和稀釋倍數繪制的標準曲線顯示該分子檢測范圍寬;在不同環境下lncRNA XIST相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05),說明該分子穩定性好;ROC曲線結果顯示,lncRNA XIST鑒別CC患者與健康者的AUC達到0.910,說明其診斷效能較好,且其靈敏度高于其他兩個指標,聯合檢測時靈敏度得到提高,達到98.91%。LncRNA XIST鑒別CC患者及CIN與子宮良性病變患者的AUC為0.675,低于SCCAg,三者單獨檢測靈敏度均不高,但聯合檢測時靈敏度得到大幅提高,達到90.22%,提示三者聯合檢測有助于CC與CIN及子宮良性病變的輔助診斷。LncRNA XIST相對表達水平與CA125、SCCAg水平均無相關性,表明其可用于CC患者的獨立檢測。血清學檢測因其取材方便、創傷小,適用于大多數的臨床檢測項目,因此具有更廣闊的應用前景。本研究發現,lncRNA XIST與CC患者的FIGO分期及淋巴結轉移有關,筆者猜測lncRNA XIST參與癌細胞的遷移、生長和侵襲,并影響癌癥的發生和發展,這與CHEN等[22]在CC組織中發現lncRNA XIST通過miR-140-5p和ORC1促進CC的進展研究結果一致。CIN與子宮良性病變患者lncRNA XIST相對表達水平低于CC患者,但高于健康者,表明lncRNA XIST對CIN與子宮良性病變也有一定的診斷價值。

綜上所述,血清lncRNA XIST有望成為CC新的輔助診斷標志物,并可作為鑒別CC與CIN及子宮良性病變的輔助指標。然而,lncRNA XIST在CC發生發展中的作用機制有待進一步深入研究。