IGFALS基因多態(tài)性與特發(fā)性矮小癥患兒rHGH治療效果及血清IGF-1水平的關(guān)系*

彭麗琨,何大可,張翠香,楊巨品,嚴(yán)家威,董宇瑩,江 泳,黃張楊,段麗梅

1.大理白族自治州人民醫(yī)院兒科三病區(qū),云南大理 671000;2.上海交通大學(xué)附屬新華兒童醫(yī)院小兒神經(jīng)內(nèi)科,上海 200127

特發(fā)性矮小癥(ISS)是指一種生長(zhǎng)激素正常,不伴有潛在病理狀態(tài)的身材矮小,約占兒童矮小癥的60%～80%[1]。目前ISS發(fā)病機(jī)制尚不明確,可能與遺傳、營(yíng)養(yǎng)不良、對(duì)生長(zhǎng)激素不敏感等多種因素有關(guān)。重組人生長(zhǎng)激素(rHGH)是可促進(jìn)骨骼肌肉生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素水平的藥物,目前在ISS治療中取得了一定效果[2]。但rHGH療效在不同患兒中差異較大,提高rHGH治療敏感性一直是臨床醫(yī)師關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。相關(guān)研究顯示,rHGH治療效果可能與治療時(shí)間、初始身高、骨齡等臨床特征有關(guān)[3]。隨著分子生物學(xué)及檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,基因多態(tài)性與ISS相關(guān)性報(bào)道逐漸增多。胰島素樣生長(zhǎng)因子不穩(wěn)定亞單位(IGFALS)基因位于人體16號(hào)染色體上,其表型變化可引發(fā)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,還有研究顯示,IGFALS基因突變可表現(xiàn)為血清胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)的表達(dá)異常[4-5]。目前關(guān)于IGFALS基因多態(tài)性在ISS發(fā)病及療效中研究較少,本次通過(guò)分析120例ISS患兒IGFALS基因多態(tài)性與rHGH療效、血清IGF-1表達(dá)的關(guān)系,為探討ISS發(fā)病機(jī)制和指導(dǎo)個(gè)體化治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2021年1月至2022年8月大理白族自治州人民醫(yī)院收治的120例ISS患兒作為ISS組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)確診為ISS,參考第7版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》[6],患兒身高在性別、年齡、種族等基本特征相似的情況下低于均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差;(2)年齡6～14歲;(3)患兒及家長(zhǎng)能配合進(jìn)行治療和研究,rHGH治療時(shí)間在12個(gè)月以上;(4)父母簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩、早產(chǎn)或先天畸形;(2)合并先天性心臟病、染色體疾病、內(nèi)分泌失調(diào)、佝僂癥、骨和軟骨發(fā)育不全、情感障礙、營(yíng)養(yǎng)不良等影響生長(zhǎng)發(fā)育疾病或因素;(3)頭顱MRI檢查顯示存在占位性病變。另選同期大理白族自治州人民醫(yī)院體檢健康兒童120例作為對(duì)照組,身高在相同年齡、性別、種族兒童的均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi),體質(zhì)量處于正常范圍,無(wú)相關(guān)影響生長(zhǎng)發(fā)育疾病。ISS組中,男67例,女53例;年齡6～14歲,平均(9.72±0.84)歲。對(duì)照組中,男62例,女58例;年齡6～13歲,平均(9.54±1.06)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)大理白族自治州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2基因測(cè)序方法 采集ISS組和對(duì)照組兒童空腹靜脈血2 mL于抗凝管中,采用人全血DNA提取試劑盒(美國(guó)默克公司)提取總DNA后于-20 ℃?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增IGFALS基因rs767089671位點(diǎn)(上游:5′-TTGCCGCTGCAGACGTGGGCGATTT-3′,下游:3′-GCTGGGCTGGGGGAGTCTCTCATTA-5′),以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:95 ℃ 5 min預(yù)變性,94 ℃ 30 s變性,60 ℃ 30 s退火,65 ℃ 1 min(26個(gè)循環(huán))延伸,65 ℃ 10 min,4 ℃保持。取出產(chǎn)物加入限制性內(nèi)切酶在55 ℃保溫箱中消化3 h,隨后采用8%非變性SDS-PAGE進(jìn)行電泳,硝酸銀染色觀察各區(qū)帶基因分型結(jié)果。

1.3rHGH治療 ISS組患兒均由父母或本人經(jīng)過(guò)規(guī)范化培訓(xùn)在家中治療,每晚睡覺(jué)前按患兒體質(zhì)量在腹部、大腿或上臂注射0.1 U/kg rHGH,1次/天,連續(xù)治療12個(gè)月。

1.4指標(biāo)評(píng)價(jià) 收集兩組兒童一般臨床資料,包括性別、年齡、體質(zhì)量、身高、遺傳靶身高、骨齡,計(jì)算治療前及治療12個(gè)月后生長(zhǎng)速率(GV)、骨齡(BV)。遺傳靶身高=(父母身高均值-6)±4[7]。年齡對(duì)應(yīng)身高標(biāo)準(zhǔn)差積分(HtSDS)=(測(cè)得身高-同性別年齡種族平均身高)/同性別年齡種族平均身高標(biāo)準(zhǔn)差[8];ΔHtSDS=治療后HtSDS-治療前HtSDS。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)治療前后患者血清胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)及IGF-1水平,試劑盒均購(gòu)自武漢賽培生物科技有限公司。

2 結(jié) 果

2.1兩組IGFALS基因多態(tài)性分布比較 ISS組和對(duì)照組IGFALS基因rs767089671位點(diǎn)的基因分型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),可反映一般兒童情況。ISS組IGFALS基因rs767089671(c.1310C>T)位點(diǎn)基因分型及C/T等位基因分布頻率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1、圖1。

圖1 患兒IGFALS基因rs767089671位點(diǎn)測(cè)序圖

表1 兩組IGFALS基因多態(tài)性分布比較(n)

2.2不同基因分型ISS患兒治療前臨床指標(biāo)比較 治療前IGFALS基因 rs767089671位點(diǎn)不同基因分型患兒性別、年齡、體質(zhì)量、身高、遺傳靶身高、骨齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 ISS患兒治療前臨床指標(biāo)比較(n/n或

2.3不同基因分型ISS患兒rHGH治療效果 治療前IGFALS基因 rs767089671位點(diǎn)不同基因分型患兒GV、HtSDS比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療后不同基因分型患兒GV、HtSDS均升高,且CC型患兒GV、HtSDS變化更明顯(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 不同基因分型ISS患兒rHGH治療效果

2.4不同基因分型ISS患兒rHGH治療前后血清IGFBP-3、IGF-1比較 治療前IGFALS基因 rs767089671位點(diǎn)不同基因分型患兒血清IGFBP-3、IGF-1水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療后不同基因分型患兒血清IGFBP-3、IGF-1水平均升高,且CC型患兒IGFBP-3、IGF-1水平變化更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同基因分型ISS患兒rHGH治療前后血清IGFBP-3、IGF-1水平比較

2.5血清IGF-1、IGFALS基因多態(tài)性與rHGH治療效果關(guān)系 Spearman相關(guān)性分析顯示,ISS患兒治療前血清IGF-1、IGFALS基因多態(tài)性與ΔHtSDS均呈正相關(guān)(r=0.932、0.576,P<0.05)。

3 討 論

ISS是一種未明確原因的體格發(fā)育遲緩,臨床上未見(jiàn)明顯生長(zhǎng)激素(GH)不足或其他病理性變化,推測(cè)其發(fā)病可能是內(nèi)外環(huán)境多種因素共同影響的復(fù)雜過(guò)程[9]。IGFALS是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的基因,其編碼的糖蛋白能與體內(nèi)IGF-1和IGFBP-3形成的二聚體結(jié)合,形成IGF系統(tǒng);而IGFALS基因突變可導(dǎo)致IGF三聚體形成障礙,IGF-1和IGFBP-3被過(guò)快清除,GH無(wú)法正常發(fā)揮作用,最終導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩[10-11]。有學(xué)者在1 034例ISS患兒中檢出IGFALS基因突變的概率為9.6%～10.1%,而IGFALS對(duì)身高的影響與其能發(fā)生各種形式突變(錯(cuò)義、無(wú)義、缺失、重復(fù)、插入等)有關(guān)[12]。還有研究顯示,IGFALS基因缺陷能通過(guò)影響IGF系統(tǒng)成分導(dǎo)致機(jī)體對(duì)GH敏感性下降,引發(fā)rHGH治療效果不佳[13]。探究IGFALS基因突變與rHGH治療效果對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

本次研究檢測(cè)了120例ISS患兒和健康兒童IGFALS基因p.S410L(rs767089671位點(diǎn))表型突變情況,發(fā)現(xiàn)ISS組IGFALS基因rs767089671(c.1310C>T)位點(diǎn)基因分型及C/T等位基因分布頻率與對(duì)照組比較存在明顯差異,ISS患兒以CC型占比為主,TT型占比最低,與相關(guān)研究結(jié)果相符[14]。有學(xué)者檢測(cè)了129例ISS患兒和131例身高正常健康兒童IGFALS外顯子2基因多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)其中存在大量同義突變和非同義突變,其中同義突變頻率在兩組中無(wú)明顯差異,而包括rs767089671位點(diǎn)在內(nèi)的非同義突變?cè)贗SS患兒中發(fā)生頻率更高,提示該位點(diǎn)突變可能是誘發(fā)ISS發(fā)病的原因之一[15]。治療12個(gè)月后,各基因分型患兒GV、HtSDS均明顯改善,且CC型患兒變化更明顯,提示rHGH療效與IGFALS基因多態(tài)性有關(guān)。

IGF系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)人體胚胎早期發(fā)育、生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程,IGFALS表達(dá)量及表型正常是IGF-1和IGFBP-3在血液中水平升高的前提條件,也是維持IGF系統(tǒng)成分和滿足人體生長(zhǎng)潛能的重要保證。有研究顯示,ISS患兒中血清IGF-1和IGFBP-3水平下降,提示血液中IGF-1和IGFBP-3累積不足與ISS發(fā)病有關(guān)[16]。IGF-1參與的GH-IGF-1調(diào)節(jié)軸是調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要途徑,其主要通過(guò)提高機(jī)體能量代謝水平并作用于GH來(lái)影響機(jī)體生長(zhǎng)[17]。還有研究顯示,敲除IGFALS基因會(huì)下調(diào)IGF-1在血清中的表達(dá),最終引發(fā)骨獲得障礙和生長(zhǎng)遲緩,提示IGFALS基因表達(dá)與IGF-1表達(dá)密切相關(guān)[18]。本次研究結(jié)果顯示,不同IGFALS基因分型ISS患兒rHGH治療效果存在差異,推測(cè)IGFALS基因突變可能引發(fā)血清IGF-1水平下降,從而影響rHGH療效。而治療后不同基因分型血清IGF-1水平變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。有學(xué)者納入21例GH不敏感患兒,結(jié)果證實(shí)有2例存在IGFALS基因p.S410L雜合變異,且其發(fā)生概率較健康對(duì)照兒童高,提示IGFALS基因突變?nèi)毕菘赡軈⑴c兒童GH不敏感和ISS發(fā)病過(guò)程[19]。也有研究顯示,GH不敏感是引發(fā)IGF-1缺乏的重要原因,提示兒童生長(zhǎng)發(fā)育不良與IGFALS基因缺陷和IGF-1表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)[20]。Spearman相關(guān)性分析顯示,患兒治療前血清IGF-1、IGFALS基因多態(tài)性與治療前后ΔHtSDS呈正相關(guān),證實(shí)rHGH療效與IGFALS基因突變和治療前IGF-1水平有關(guān),同時(shí)也提示ISS治療時(shí)間越早,基礎(chǔ)IGF-1水平越高,療效越好。而臨床工作中也可通過(guò)調(diào)整GH-IGF-1軸來(lái)改善rHGH治療效果。

綜上所述,ISS患兒IGFALS基因rs767089671位點(diǎn)基因突變與rHGH治療效果及血清IGF-1表達(dá)有關(guān),且CT和TT基因分型患兒rHGH治療后GV增加沒(méi)有CC基因分型患兒明顯可能與血清IGF-1水平增加不足有關(guān),該位點(diǎn)突變可作為評(píng)估rHGH治療效果的參考指標(biāo),對(duì)臨床治療具有一定指導(dǎo)意義。