急性淋巴細(xì)胞白血病患者miR-377和SMYD3表達(dá)水平與臨床預(yù)后意義

徐丹丹,劉 洋

中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇一醫(yī)院檢驗(yàn)科,安徽合肥 230031

急性淋巴細(xì)胞白血病是一種以骨髓、外周血原始及幼稚淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的血液系統(tǒng)疾病,同時(shí)也是兒童及青少年高發(fā)的腫瘤疾病[1-2]。近年來(lái)雖隨著我國(guó)醫(yī)療技術(shù)地不斷進(jìn)步,急性淋巴細(xì)胞白血病患者臨床治療效果已得到有效改善,但仍有部分患者預(yù)后較差[3]。因此,探尋有效的診斷和預(yù)后標(biāo)志物為臨床早期選擇最佳治療方案提供依據(jù)至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)由內(nèi)源基因編碼,目前廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡等多個(gè)生物過(guò)程[4]。miR-377是一種非編碼miRNA,已有研究發(fā)現(xiàn)miR-377在其他腫瘤疾病中異常表達(dá),并且與疾病預(yù)后密切有關(guān)[5]。而SET及MYND結(jié)構(gòu)域包含蛋白3(SMYD3)是新發(fā)現(xiàn)的一種能夠參與組蛋白甲基化修飾的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶[6],既往研究發(fā)現(xiàn),SMYD3在多種疾病中高表達(dá),并且與患者預(yù)后密切相關(guān)[7]。但目前miR-377和SMYD3與急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病及預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。因此,本研究擬探討急性淋巴細(xì)胞白血病患者miR-377和SMYD3表達(dá)水平及其臨床預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2016年3月至2020年6月收治的135例急性淋巴細(xì)胞白血病患者作為觀察組,其中男80例,女55例;年齡20～59歲,平均(40.69±2.36)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)觀察組均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)所有納入患者及家屬對(duì)本研究知情同意;(3)年齡20～60歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)肝、腎、心等重要臟器存在功能不全或衰竭者;(2)合并嚴(yán)重感染者;(3)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病、成熟淋巴細(xì)胞白血病等其他類型白血病者;(4)接受化療耐藥治療者;(5)精神病史者;(6)臨床資料不完整或中途退出者。同時(shí)選擇同期120例體檢健康者作為對(duì)照組,其中男70例,女50例;年齡21～60歲,平均(40.88±2.87)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2方法 樣本收集:抽取患者入院及健康者體檢時(shí)清晨外周靜脈血樣本8 mL,每份樣本液4 mL,隨后加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液,并在室溫下以2 000×g離心10 min,然后將離心管中白霧狀層轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管中,用Hank液清洗兩遍后,將單核細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/mL,在無(wú)菌1.5 mL PE管中加入100 μL單核細(xì)胞懸液,分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的HLR-DR抗體,經(jīng)4 ℃培養(yǎng)30 min,存放至-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

RNA提取:從-80 ℃冰箱取出樣本后按照3倍體積比例加入提取試劑Trizol后充分搖勻,室溫下靜置15 min,隨后4 ℃下2 000 r/min離心15 min,使用EP管吸取上部液體血清,提取總miRNA。具體方法參照miRNA試劑盒。

檢測(cè)方法:采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)外周血miR-377、SMYD3表達(dá)水平,反應(yīng)條件為:94 ℃、5 min,94 ℃、30 s,60 ℃、35 s,72 ℃、10 s,共35個(gè)循環(huán)。miR-377引物:上游5′-ATCACACAAAGGCAAC-3′,下游5′-GTGCAGG GTCCGAGG-3′;U6引物:上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,下游5′-GGA ACGTTCAGAATTTA-3′。SMYD3引物:上游5′-TGAATGTGACTGTTTCCGTTGC-3′,下游5′-ATTGCTGCTTATGATCGCCTGG-3′;U6引物:上游5′-GAACGGTGAAGGTGACAG-3′,下游5′-TAGAGAGAAGTGGGGTGG-3′。利用CFX manager 3.0軟件對(duì)Cq值進(jìn)行分析,再通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-377、SMYD3表達(dá)水平。

1.3觀察指標(biāo) 觀察記錄各組患者年齡、性別、免疫分型、危險(xiǎn)度分型、骨髓原幼細(xì)胞比例,以及入院時(shí)、入院1月后血紅蛋白(Hb)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、乳酸脫氫酶(LDH)等臨床資料。

療效標(biāo)準(zhǔn)[9]:完全緩解(CR)表示臨床癥狀消失,原始細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞比例<5%;部分緩解(PR)表示臨床癥狀緩解,骨髓中原始細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞比例為5%～20%;未緩解(NR)表示臨床癥狀未緩解,骨髓中原始細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞比例>20%。

隨訪:本研究所有患者均隨訪2年,截止時(shí)間為2022年6月,并記錄miR-377、SMYD3水平低表達(dá)和高表達(dá)患者的生存情況。

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-377、SMYD3表達(dá)水平比較 觀察組miR-377表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05),SMYD3表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組miR-377、SMYD3表達(dá)水平比較

2.2miR-377、SMYD3表達(dá)水平與急性淋巴細(xì)胞白血病患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 本研究根據(jù)均數(shù)將外周血miR-377、SMYD3表達(dá)水平分為高表達(dá)和低表達(dá)。miR-377>3.65為高表達(dá)組(75例),miR-377≤3.65為低表達(dá)組(60例),SMYD3>4.11為高表達(dá)組(62例),SMYD3≤4.11為低表達(dá)組(73例)。miR-377高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的年齡,性別,免疫分型,Hb(入院時(shí)、入院1月后),PLT(入院時(shí)、入院1月后)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-377高表達(dá)組的危險(xiǎn)度分型,WBC(入院時(shí)、入院1月后),LDH(入院時(shí)、入院1月后),骨髓原幼細(xì)胞比例均明顯低于miR-377低表達(dá)組(P<0.05)。SMYD3高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的年齡,性別,免疫分型,Hb(入院時(shí)、入院1月后),PLT(入院時(shí)、入院1月后)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),SMYD3高表達(dá)組的危險(xiǎn)度分型,WBC(入院時(shí)、入院1月后),LDH(入院時(shí)、入院1月后),骨髓原幼細(xì)胞比例均明顯高于SMYD3低表達(dá)組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miR-377、SMYD3表達(dá)水平與急性淋巴細(xì)胞白血病患者臨床指標(biāo)的關(guān)系(n或

2.3急性淋巴細(xì)胞白血病miR-377和SMYD3表達(dá)水平與臨床療效的關(guān)系 本研究根據(jù)臨床療效將觀察組患者分為CR組(44例)、PR組(60例)、NR組(30例)。CR組miR-377、SMYD3表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);miR-377表達(dá)水平從低到高依次為NR組、PR組、CR組、對(duì)照組(P<0.05),SMYD3表達(dá)水平從高到低依次為NR組、PR組、CR組、對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miR-377、SMYD3表達(dá)水平與急性淋巴細(xì)胞白血病患者臨床療效的關(guān)系

2.4急性淋巴細(xì)胞白血病miR-377、SMYD3表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系 本研究隨訪患者2年,記錄了所有患者的生存時(shí)間,經(jīng)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn),miR-377高表達(dá)組總生存率(65.33%,49/75)明顯高于miR-377低表達(dá)組(41.67%,25/60)(P<0.05),見(jiàn)圖1;SMYD3高表達(dá)組總生存率(41.94%,26/62)明顯低于SMYD3低表達(dá)組(65.75%,48/73)(P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖1 miR-377表達(dá)水平與患者生存關(guān)系圖

圖2 SMYD3表達(dá)水平與患者生存關(guān)系圖

2.5影響急性淋巴細(xì)胞白血病患者預(yù)后的多因素Cox回歸模型分析 本研究將表2單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的因素設(shè)為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸模型分析,結(jié)果顯示,危險(xiǎn)度分型、WBC、LDH、骨髓原幼細(xì)胞比例、miR-377、SMYD3均為影響急性淋巴細(xì)胞白血病患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 急性淋巴細(xì)胞白血病患者預(yù)后的多因素Cox回歸模型分析

3 討 論

急性淋巴細(xì)胞白血病作為血液系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病率占急性白血病的70%以上[10]。雖目前臨床治療水平有一定提升,但仍有部分患者臨床預(yù)后較差,因此為進(jìn)一步改善患者預(yù)后,早期評(píng)估預(yù)后具有重要意義。因此,本研究擬探討急性淋巴細(xì)胞白血病患者miR-377和SMYD3表達(dá)水平與臨床預(yù)后意義。

miRNA是一類長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,可通過(guò)序列部分互補(bǔ)結(jié)合抑制目的基因的表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)控分化、增殖、凋亡、遷移等細(xì)胞行為[11]。既往已有相關(guān)研究顯示,miRNA異常表達(dá)在許多腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及抑制凋亡等作用[12]。既往研究發(fā)現(xiàn),miR-377在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中表達(dá)下調(diào),且可預(yù)測(cè)不良預(yù)后[13]。而本研究結(jié)果顯示,觀察組miR-377表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明miR-377在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中表達(dá)下調(diào),與以上研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn),miR-377高表達(dá)組患者的危險(xiǎn)度分型,WBC(入院時(shí)、入院1月后),LDH(入院時(shí)、入院1月后),骨髓原幼細(xì)胞比例均明顯低于miR-377低表達(dá)組(P<0.05),即miR-377低表達(dá)患者骨髓原幼細(xì)胞比例異常增加,危險(xiǎn)分級(jí)上升,WBC與LDH升高,表示miR-377低表達(dá)可能與患者病情進(jìn)展相關(guān),并且能夠在一定程度反映患者疾病程度。有研究發(fā)現(xiàn),miR-377表達(dá)水平降低可導(dǎo)致癌細(xì)胞異常增殖[14]。本研究通過(guò)分析miR-377與療效的關(guān)系發(fā)現(xiàn),NR組miR-377表達(dá)水平明顯低于PR組、CR組、對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明miR-377低表達(dá)水平可使患者更不易治愈,進(jìn)而可影響患者預(yù)后。本研究生存分析發(fā)現(xiàn),miR-377高表達(dá)組總生存率明顯高于miR-377低表達(dá)組(P<0.05),多因素Cox回歸模型分析結(jié)果顯示,miR-377是影響急性淋巴細(xì)胞白血病患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05),進(jìn)一步證實(shí)miR-377表達(dá)水平與急性淋巴細(xì)胞白血病預(yù)后密切相關(guān),臨床可通過(guò)檢測(cè)miR-377表達(dá)水平及時(shí)評(píng)估患者預(yù)后狀況,從而為提高臨床療效提供參考依據(jù)。既往研究顯示,miR-377在膠質(zhì)瘤中表達(dá)失調(diào),且上調(diào)miR-377可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與侵襲[15]。因此miR-377表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病患者細(xì)胞增殖,進(jìn)而影響治療效果及預(yù)后。

SMYD3屬于SET和MYND結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員之一,具有通過(guò)催化H3K4甲基化調(diào)控基因表達(dá)的作用,并且在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示,觀察組SMYD3表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05),提示SMYD3可能參與疾病發(fā)生,與劉方[18]研究結(jié)果一致。另外本研究發(fā)現(xiàn),SSMYD3高表達(dá)組患者的危險(xiǎn)度分型,WBC(入院時(shí)、入院1月后),LDH(入院時(shí)、入院1月后),骨髓原幼細(xì)胞比例均明顯高于SMYD3低表達(dá)組(P<0.05)。既往研究發(fā)現(xiàn),SMYD表達(dá)水平降低可導(dǎo)致癌細(xì)胞遷移和侵襲受到明顯抑制[19],說(shuō)明SMYD高表達(dá)可使病情加重,參與疾病進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示,NR組SMYD3表達(dá)水平明顯高于PR組、CR組、對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明SMYD表達(dá)與臨床療效有關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn),SMYD3高表達(dá)組總生存率明顯低于SMYD3低表達(dá)組(P<0.05),提示SMYD3表達(dá)水平可為患者預(yù)后的預(yù)測(cè)提供參考。多因素Cox回歸模型分析顯示,SMYD3是影響急性淋巴細(xì)胞白血病患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05),證實(shí)SMYD3高表達(dá)參與患者病情進(jìn)展及預(yù)后。既往研究發(fā)現(xiàn),SMYD3高表達(dá)上皮性卵巢癌患者的中位生存期更低[20]。可能是由于SMYD3可通過(guò)活化下游癌基因,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,當(dāng)SMYD3表達(dá)上調(diào)時(shí)能夠影響下游癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖增加,因此促使患者預(yù)后不良。

綜上所述,急性淋巴細(xì)胞白血病患者miR-377呈低表達(dá)水平,SMYD3呈高表達(dá)水平,且其表達(dá)水平與患者臨床特征、療效及預(yù)后生存率均密切相關(guān),因此可作為評(píng)估患者臨床預(yù)后的有效指標(biāo)。但是由于本次研究為單中心分析,因此在今后研究中可需加大樣本量進(jìn)一步分析miR-377、SMYD3在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中的作用機(jī)制,以期為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。