RNA m6A修飾在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展和診療評估中的研究現(xiàn)狀*

朱杏緣,林怡忻,謝晉燁 綜述,陳 康 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東湛江 524023

子宮內(nèi)膜癌(EC)是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中最常見的一種,其發(fā)病率在女性所有腫瘤類型中排名第2,死亡率排名第3[1]。外科手術(shù)是EC的主要治療方法,并根據(jù)FIGO等臨床分級和分子分型進(jìn)行化療。早期階段EC手術(shù)治療的5年生存率可以達(dá)到95%,而晚期治療的5年生存率不到20%,且復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者的治療效果更差[2],說明早期預(yù)防和診斷對EC患者預(yù)后具有重要意義。有研究表明,胰島素抵抗、高血糖和肥胖癥等代謝綜合征是EC的高危因素[3],而肥胖相關(guān)蛋白(FTO)[4]與多種惡性腫瘤,如膀胱癌[5]、乳腺癌[6]、食管癌[7]和卵巢癌[8]有著密切的關(guān)聯(lián)。N6-甲基腺苷(m6A)是高等生物信使RNA(mRNA)和非編碼RNA(ncRNA)上最為普遍的修飾。有研究表明,FTO可以使mRNA m6A修飾的堿基發(fā)生去甲基化,參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制[9]。然而,相比肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌,包括FTO在內(nèi)的m6A修飾蛋白在EC中的調(diào)控機(jī)制研究較少。本文對近年來RNA m6A修飾蛋白參與EC發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥的分子機(jī)制,以及RNA m6A修飾蛋白在EC的診斷預(yù)后中的作用進(jìn)行了綜述研究,以期對EC預(yù)防、早期診斷和治療方法提供新的思路。

1 RNA m6A修飾調(diào)控及檢測方法

RNA m6A修飾是一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾類型,促癌基因和抑癌基因RNA m6A修飾異常[10]及其引起的相關(guān)信號通路變化,可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。RNA m6A修飾主要由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物動態(tài)可逆地調(diào)控RNA腺苷酸的第6個氮原子上的甲基化水平,不僅參與mRNA可變剪接、出核、定位、穩(wěn)定性及翻譯等轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控[11],還可以通過對ncRNA的調(diào)控影響下游表達(dá),包括調(diào)控mRNA前體(pri-mRNA)加工、影響長鏈非編碼RNA(lncRNA)結(jié)合微小RNA(miRNA)等廣泛影響機(jī)體正常生理及疾病的機(jī)制和進(jìn)展。RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物包括甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基識別蛋白這3類蛋白[12]。

RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶,又稱為寫入蛋白,能以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,催化RNA上的m6A修飾形成。目前認(rèn)為RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3/14(METTL 3/14)、Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白(WTAP)、RNA結(jié)合基序蛋白15/15B(RBM15/15B)、病毒樣m6A轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(VIRMA)、CCCH型鋅指蛋白13(ZC3H13)等。其中METTL3是RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心,起主要催化作用,而其他蛋白起募集和穩(wěn)定甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的功能[13-15]。

RNA m6A去甲基酶,也被稱為擦除蛋白,主要由人源Alkbh5蛋白(ALKBH5)和FTO[11]組成。FTO為首個發(fā)現(xiàn)具有RNA m6A去甲基化功能的蛋白,能與甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物共定位,拮抗METTL3的作用,是實(shí)現(xiàn)動態(tài)可逆調(diào)控RNA m6A修飾的關(guān)鍵蛋白[16]。ALKBH5幾乎表達(dá)于所有組織細(xì)胞中,與METTL3的甲基化作用相反,可以直接去除RNA m6A甲基化基團(tuán),該基因缺失可阻礙mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn),影響基因的表達(dá)。

甲基識別蛋白,也被稱為閱讀蛋白,其通過連接m6A修飾RNA和核RNA輸出因子、剪接因子、翻譯起始因子、去腺苷化酶和脫帽酶復(fù)合物等,調(diào)控RNA的出核、成熟、翻譯和降解過程,是m6A修飾影響靶RNA命運(yùn)的主要調(diào)控分子,主要包括YTH結(jié)合蛋白1-3(YTHDF1-3)、YTH結(jié)構(gòu)域蛋白1-2(YTHDC1-2)及胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(IGF2BPs)等[12]。

RNA m6A修飾穩(wěn)態(tài)調(diào)控,在生長、發(fā)育、代謝、免疫、抗炎等正常生理和病理過程中起關(guān)鍵作用;異常的RNA m6A修飾則會導(dǎo)致腫瘤、自身免疫病、代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展[17]。因此,檢測RNA m6A修飾水平的改變,以及特定靶RNA m6A修飾的異常,在疾病的診療評估中具有關(guān)鍵的指示作用。目前RNA m6A修飾水平的檢測主要包括色譜法、印跡法和比色法,可從整體水平上判斷RNA m6A修飾水平在疾病發(fā)生發(fā)展和治療前后的差異,以對疾病預(yù)防和預(yù)后評估做出判斷,但無法鑒定出m6A修飾的具體RNA和位點(diǎn)。RNA甲基化免疫沉淀測序[18-19](MeRIP-Seq)使用RNA m6A高特異性抗體分離m6A修飾的RNA片段,再通過高通量測序繪制轉(zhuǎn)錄組的RNA m6A圖譜。MeRIP-Seq可以篩選出不同疾病、不同階段中m6A修飾異常的RNA及其位點(diǎn),更有利于疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。RNA免疫共沉淀技術(shù)(RIP)通過上述特定RNA m6A修飾相關(guān)蛋白抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,再對與靶蛋白結(jié)合的RNA進(jìn)行分析,該方法可用于對MeRIP-Seq的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。同樣,也可通過一些可用的數(shù)據(jù)庫對RNA m6A修飾進(jìn)行分析,包括WHISTLE、BGRU、PseDNC、MeT-DB、m6AViewer等不同的計(jì)算方法來關(guān)聯(lián)現(xiàn)有的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)、RNA甲基化、疾病或細(xì)胞系數(shù)據(jù)庫,從而預(yù)測和分析不同基因、細(xì)胞系或疾病的RNA m6A修飾位點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、RNA結(jié)合蛋白(RBP)和RNA剪接模式[20-24]。

2 RNA m6A修飾在EC中的生物學(xué)作用

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RNA m6A修飾蛋白通過改變靶基因或者mRNA的m6A修飾及激活異常信號通路促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性生物活性,其在EC發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥過程中發(fā)揮重要作用,關(guān)于在EC中,RNA m6A修飾相關(guān)蛋白的變化總結(jié)見表1,下文將從RNA m6A與EC發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥的相關(guān)分子機(jī)制及其作為診斷預(yù)后標(biāo)志物等方面進(jìn)行總結(jié)和介紹。

表1 RNA m6A修飾相關(guān)蛋白在EC中的作用

2.1RNA m6A修飾與EC發(fā)生和轉(zhuǎn)移 EC的發(fā)生涉及增殖信號通路、激素、代謝和炎癥紊亂等復(fù)雜過程,目前研究表明RNA m6A修飾相關(guān)蛋白表達(dá)差異和功能異常參與EC微環(huán)境紊亂和增殖信號的異常活化。

有研究發(fā)現(xiàn),去甲基化酶FTO在EC中表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致核內(nèi)信號分子TCF4/β-catenin拮抗分子同源域轉(zhuǎn)錄因子HOXB13的mRNA m6A甲基化水平降低,與閱讀蛋白YTHDF2結(jié)合減少,HOXB13 mRNA發(fā)生明顯降解,誘發(fā)Wnt信號通路的過度激活,促進(jìn)EC發(fā)生發(fā)展[25]。而肥胖與長期暴露于雌激素水平較高的環(huán)境中可能通過上調(diào)FTO的表達(dá),增加患EC的風(fēng)險(xiǎn)[26]。ZHANG等[27]的研究指出,雌二醇可能通過與雌激素受體結(jié)合,活化PI3K/AKT和MAPK信號通道,從而使FTO表達(dá)上調(diào),促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP)-2、MMP-9和細(xì)胞周期蛋白D(cyclinD)表達(dá),從而刺激EC細(xì)胞的增殖。ZHU等[28]進(jìn)一步確定雌激素誘導(dǎo)FTO發(fā)生ERα依賴性的核定位與增強(qiáng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性有關(guān)。

此外,也有報(bào)道發(fā)現(xiàn),去甲基化酶ALKBH5在EC組織中顯著上調(diào)。一方面,在正常子宮內(nèi)膜中,胰島素樣生長因子1(IGF-1)在絕經(jīng)前子宮內(nèi)膜增生期、分泌期和月經(jīng)期的轉(zhuǎn)變中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,其高表達(dá)被認(rèn)為是影響腫瘤進(jìn)展的重要預(yù)后因素,而ALKBH5使IGF-1R轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾去甲基化,抑制IGF-1R mRNA降解,從而上調(diào)IGF-1軸的促增殖作用,促進(jìn)EC細(xì)胞的生成和轉(zhuǎn)移[29]。另一方面,缺氧是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的動力,缺氧會促進(jìn)腫瘤血管新生及增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞自我更新能力,SOX2是一項(xiàng)重要的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,不僅維持、調(diào)控組織和器官的發(fā)育,也可以調(diào)控癌癥的發(fā)生與發(fā)展。研究指出,EC細(xì)胞在缺氧條件下ALKBH5表達(dá)上調(diào),通過降低轉(zhuǎn)錄因子SOX2的mRNA m6A修飾,抑制其降解,從而上調(diào)SOX2表達(dá)促進(jìn)EC干細(xì)胞的自我更新和轉(zhuǎn)移[30-31]。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是一種重要的信號傳導(dǎo)機(jī)制,它可以激活絲裂原信號,從而促進(jìn)細(xì)胞周期、增殖、代謝和運(yùn)動,從而影響生物體的功能[32]。LIU等[33]的研究發(fā)現(xiàn),RNA m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL14功能喪失性突變或METTL3低表達(dá)介導(dǎo)的RNA m6A水平降低,與ECPI3K/AKT/mTOR持續(xù)活化相關(guān)。其中,AKT信號的負(fù)調(diào)控因子PHLPP2蛋白水平在METTL14突變、敲低和METTL13敲低的情況下降低,而mTOR的mRNA水平和蛋白水平均上調(diào),說明不同基因mRNA的m6A修飾改變可產(chǎn)生不同的調(diào)控結(jié)果。該研究者進(jìn)一步干擾m6A閱讀蛋白YTHDF1和YTHDF2,結(jié)果發(fā)現(xiàn)YTHDF1可與RNA m6A修飾的PHLPP2 mRNA結(jié)合并促進(jìn)其翻譯,YTHDF2可以與RNA m6A修飾的mTOR基因mRNA結(jié)合并促進(jìn)其降解。然而,在EC細(xì)胞中YTHDF1和YTHDF2的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異,提示METTL3和METTL14異常打破了PHLPP2和mTOR mRNA m6A修飾穩(wěn)態(tài),是誘發(fā)EC發(fā)生的關(guān)鍵步驟。

然而,也有研究提示,EC組織中閱讀蛋白YTHDF2、IGF2BP1[34]、IGF2BP3[35],以及寫入蛋白WTAP的表達(dá)上調(diào),通過干擾特定基因的RNA m6A修飾穩(wěn)態(tài),促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲[36];同時也有報(bào)道稱,YTHDF2表達(dá)在EC細(xì)胞中下調(diào),減少對促癌基因表達(dá)的抑制,從而增強(qiáng)EC惡性程度[37]。造成研究之間結(jié)果差異的原因可能與檢測方法不同有關(guān),有些研究檢測m6A修飾蛋白的mRNA表達(dá)水平,有些通過組織化學(xué)染色檢測EC細(xì)胞中RNA m6A修飾蛋白的表達(dá),也有通過免疫共沉淀技術(shù)檢測特定基因RNA m6A修飾蛋白的差異。

同時,以上研究也說明,RNA m6A修飾紊亂可以誘發(fā)EC發(fā)生,而且在EC發(fā)生發(fā)展的過程中,RNA m6A修飾的進(jìn)一步變化可能是腫瘤轉(zhuǎn)歸的一個重要分子過程。因此,對EC相關(guān)RNA m6A修飾水平變化的監(jiān)測和研究,以及探討關(guān)鍵的RNA m6A修飾關(guān)鍵基因和修飾蛋白的表達(dá),可能對了解EC的發(fā)生發(fā)展和個體化差異具有重要意義,仍有待深入研究。

2.2RNA m6A修飾與EC的耐藥關(guān)系 癌癥耐藥性是癌癥治療的主要障礙,RNA m6A修飾改變癌癥關(guān)鍵基因和通路從而導(dǎo)致耐藥性。FTO在各種人類惡性腫瘤中大量表達(dá),增加癌細(xì)胞代謝,從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和化療耐藥。在EC患者中發(fā)現(xiàn),與分化良好腫瘤患者相比,在低分化腫瘤患者中檢測到更高的m6A mRNA表達(dá)水平,且與更差的臨床結(jié)果有關(guān),而FTO表達(dá)增加與EC患者生存率降低有關(guān),FTO通過HOXB13介導(dǎo)的Wnt信號激活促進(jìn)了EC的轉(zhuǎn)移性傳播[38];在宮頸癌中,FTO通過m6A去甲基化引起的β-連環(huán)蛋白表達(dá)改變來增強(qiáng)患者對化療和放療的抵抗力[39]。這也可能適用于EC,因?yàn)镕TO過表達(dá)可能導(dǎo)致放療和化療失敗,導(dǎo)致不利的臨床結(jié)果,但FTO在EC中具體的耐藥機(jī)制仍有待探究。

2.3RNA m6A修飾與EC的腫瘤免疫關(guān)系 在腫瘤進(jìn)展過程中,癌細(xì)胞可以通過各種機(jī)制逃避宿主免疫監(jiān)視并削弱免疫反應(yīng),包括降低腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)或促進(jìn)免疫炎癥微環(huán)境的形成[40]。目前發(fā)現(xiàn)RNA m6A不僅可以改變癌細(xì)胞的生物特性,還可以改變T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫相關(guān)分子調(diào)節(jié)的修飾。EC組織中ZC3H13、YTHDC1和METTL14的表達(dá)與PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān);PD-1/PD-L1通路控制腫瘤微環(huán)境中免疫耐受的誘導(dǎo)和維持,阻斷這些蛋白可能增強(qiáng)免疫治療的效果。根據(jù)CHEN等[41]研究,TIMER數(shù)據(jù)庫分析表明,METTL14、ZC3H13、YTHDC1與CD4+T淋巴細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān),ZC3H13和YTHDC1與巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)。說明RNA m6A調(diào)節(jié)蛋白與EC腫瘤免疫浸潤密切相關(guān),是潛在的免疫調(diào)控、靶向治療位點(diǎn)。目前關(guān)于RNA m6A與腫瘤免疫在EC中的研究比較少,需要進(jìn)一步研究。

2.4RNA m6A修飾水平及關(guān)鍵基因作為EC早期診斷、預(yù)后標(biāo)志物可能性 根據(jù)MA等[42]的研究,免疫組織化學(xué)結(jié)果提示ZC3H13、YTHDC1和METTL14在EC組織中的表達(dá)顯著降低,可以作為EC潛在的診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物。同樣地,根據(jù)ZHAI等[43]研究,RBM15、FTO和YTHDF1被確定為EC的預(yù)后生物標(biāo)志物,其可能參與細(xì)胞周期調(diào)控,影響RNA加工和翻譯,并與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程和EC的預(yù)后相關(guān)。然而,這些調(diào)控因子的確切機(jī)制仍有待完全闡明,需要進(jìn)一步的研究。

有研究發(fā)現(xiàn),利用主成分分析法構(gòu)建RNA m6A評分,量化每個腫瘤患者的RNA m6A修飾模式,可以預(yù)測腫瘤炎癥的分期、亞型、TME間質(zhì)活性、遺傳變異及預(yù)后,根據(jù)RNA m6A評分給患者提供顯著的治療優(yōu)勢和臨床效益[44]。據(jù)TIAN等[45]研究發(fā)現(xiàn),還有其他的轉(zhuǎn)錄組學(xué)與RNA m6A轉(zhuǎn)錄組學(xué)有串聯(lián)干擾作用,共同影響多種生物學(xué)過程。在胃癌中發(fā)現(xiàn)m5C(一種DNA修飾類型)與RNA m6A調(diào)節(jié)器有相似遺傳變化,猜測這兩種修飾模式存在互相作用,在肝癌細(xì)胞驗(yàn)證這兩種調(diào)節(jié)劑協(xié)同削弱肝癌細(xì)胞的凋亡,增強(qiáng)DNA損傷核修復(fù),促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷徙、轉(zhuǎn)移等生物性質(zhì)。進(jìn)一步開發(fā)了5Mc/m6A多組學(xué)EME打分系統(tǒng),精確預(yù)測肝癌的免疫反應(yīng)治療及潛在的藥物靶點(diǎn)。提示RNA m6A修飾水平及關(guān)鍵基因可作為EC早期診斷、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后標(biāo)志物及預(yù)測潛在藥物靶點(diǎn),但在EC中尚未有相關(guān)數(shù)據(jù)和研究的發(fā)表。

3 小結(jié)與展望

由于生活的改善,肥胖癥、高血糖和胰島素抵抗等發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高,發(fā)生EC的風(fēng)險(xiǎn)也越來越高。目前針對EC沒有特異性早期診斷標(biāo)志物,治療手段單一,晚期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移更是治療難點(diǎn)。所以,早期診斷和靶向治療EC變得日益重要。目前,研究人員正在探索RNA m6A修飾蛋白在EC發(fā)生、轉(zhuǎn)化和耐藥領(lǐng)域的更深入的分子機(jī)制,以期尋找較高特異度和靈敏度的腫瘤標(biāo)志物,以及將RNA m6A調(diào)節(jié)劑在相關(guān)通路的靶向作用應(yīng)用于實(shí)際。