預熟制處理對三疣梭子蟹凍藏品質的影響

孫仲麒，蘇蘭香，黃 濤，賈 茹，魏華茂*，楊文鴿*

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211）

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我國重要的經濟蟹類之一，其肉質鮮嫩、蛋白含量高、必需氨基酸齊全且風味獨特，深受廣大消費者喜愛[1]。據統計，2021年我國海捕蟹總產量為64.71萬 t，其中三疣梭子蟹45.45萬 t，占海捕蟹的70.24%[2]。然而，梭子蟹銷售受季節影響嚴重，供需不穩定，價格波動顯著。因此，梭子蟹除了以鮮活方式銷售外，常被凍藏保存，以解決禁漁期梭子蟹短缺的問題。凍藏可顯著延長梭子蟹的貨架期，但蟹肉的含水量高、纖維組織柔嫩且內源酶活性強，直接凍藏易導致肌肉蛋白變性、肌纖維糜化、肌肉品質劣化，進而嚴重影響其食用品質和經濟效益[3]。楊志堅[4]指出，蟹肉中冰晶隨凍藏時間的延長而逐漸增大，引起肌肉蛋白脫水變性，蛋白質溶解性降低、疏水性增加，導致解凍后再加熱熟制的蟹肉汁液流失嚴重、肉質口感下降。因此，開發梭子蟹預處理方式以減緩其貯藏過程中品質劣化速率至關重要。

近年來，隨著我國預制菜產業及水產品對外貿易的發展，預熟制水產品越來越受到消費者的青睞，其出口量也不斷上升，而預熟制蟹類產品在生產、加工以及貯藏過程中的品質是決定其經濟價值的主要因素[5]。研究表明，預熟制處理不僅可以減菌、降低酶活性、改善肌肉品質、賦予產品特殊的風味色澤、延長貨架期，還可以有效減少凍藏過程中蟹腳脫落，大幅提高產品的穩定性和安全性[6]。陳德慰[7]指出，熟制大閘蟹經檸檬酸處理后總揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量降低，貨架期顯著延長，而使用三聚磷酸鈉處理則會促進TVB-N生成，使其貨架期縮短。施祁燕等[8]將熟制的中華絨螯蟹剝殼后按照不同部位進行凍藏，發現蟹肉在240 d后仍可食用，而蟹膏、蟹黃的貨架期只有180 d。目前，預熟制技術的應用主要集中在河蟹的加工中，對三疣梭子蟹在凍藏過程中品質變化的研究鮮有報道。

鑒于此，本實驗以三疣梭子蟹為研究對象，比較新鮮與預熟制處理三疣梭子蟹在凍藏過程中pH值、TVB-N含量、菌落總數（total viable count，TVC）、持水性（water holding capacity，WHC）和色澤的變化，結合肌肉蛋白組成以及微觀結構，探究預熟制梭子蟹在凍藏過程中的品質變化規律，旨在為預熟制三疣梭子蟹的貯藏品質及其貨架期預測提供參考，以確保水產品的食用品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活三疣梭子蟹（P.trituberculatus），質量為（173.8±25.3）g，2021年12月捕撈于浙江舟山海域，2 d內在海水中暫養并運至寧波路林水產批發市場，隨后冰藏于泡沫箱中，1.5 h內運至實驗室，冰包埋致死以便后續實驗。

氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、硼酸、氧化鎂、乙醇、甲基紅、溴甲酚綠（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甘氨酸（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三(羥甲基)氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂培養基 杭州微生物試劑有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀 福斯分析儀器（蘇州）有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；ML104/02型電子天平 梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

三疣梭子蟹隨機分為3 組：1）對照組（control，C組）：梭子蟹凍藏后，冰水浴解凍2 h后取肉樣檢測；2）熟制后凍藏組（heating followed by frozen storage，H-F組）：梭子蟹置于蒸鍋中，待水沸騰后蒸12 min至完全熟透，冰上冷卻至室溫后凍藏，冰水浴解凍2 h后取肉樣檢測；3）凍藏后熟制組（frozen storage followed by heating，F-H組）：梭子蟹凍藏后，冰水浴解凍2 h后置于蒸鍋內，待水沸騰后蒸12 min至完全熟透，冰上冷卻至室溫后取肉樣檢測。取肉部位均為梭子蟹的螯足及附近肌肉。

所有梭子蟹凍結前均采用無菌塑封袋單獨封口包裝，先于?40 ℃冷凍2 h，后轉移至?20 ℃冰箱凍藏，180 d內定期對各指標進行測定。

1.3.2 色澤的測定

使用標準白板校正色差儀，再測定蟹肉色澤。白度（W）為L*（明亮度）、a*（紅綠度）和b*（黃藍度）值的綜合指標，按照公式（1）計算[9]。

1.3.3 pH值的測定

參考Fan Wenjiao等[10]方法，準確稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入9 倍體積超純水后均質，靜置30 min后取其上清液，用pH計進行測定。

1.3.4 TVB-N含量的測定

參照GB 5009.228－2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[11]的方法，準確稱取2.0 g樣品，采用自動凱氏定氮儀測定，結果以mg/100 g表示。

1.3.5 TVC的測定

參照GB 4789.2－2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[12]的方法，結果以lg（CFU/g）表示。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察

按L i a n g F e n g 等[13]方法稍加修改。將蟹肉平行于肌原纖維伸展方向進行橫切，取樣尺寸為3 mm×3 mm×1 mm，浸沒于2.5%（體積分數，下同）戊二醛中，于4 ℃冰箱內固定24 h；用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）漂洗3 次，每次15 min；依次用不同體積分數乙醇（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）洗脫，再用無水乙醇和叔丁醇以體積比3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的混合液依次洗脫，每次10 min；最后用少量叔丁醇覆蓋樣品，冷凍干燥。將冷凍干燥樣品貼于銅質樣品臺上方，噴金后用于掃描電子顯微鏡觀察，加速電壓為10 kV。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考Jia Ru等[14]的方法并略作修改。取0.5 g蟹肉，加入20 mL緩沖液（8 mol/L尿素-2% SDS-20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8），用磁力攪拌器攪拌過夜，4 ℃冷凍離心（10 000 r/min、10 min），取上清液待測。用BCA蛋白濃度試劑盒測定上清液蛋白質量濃度，并將其稀釋至2 mg/mL，加5%β-巰基乙醇（與稀釋過的蛋白溶液體積比為1∶4），隨后在沸水浴中加熱10 min，冷卻備用。

采用5%濃縮膠和12%分離膠，每孔樣品上樣量為10 μL。聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）起始電壓為80 V，樣品進入分離膠后將電壓調為100 V。電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250染色，純水煮沸脫色，最后用凝膠成像儀拍照分析。

1.3.8 WHC的測定

參考Tabilo-Munizaga等[15]的方法測定WHC。準確稱取2.0 g樣品，將其用濾紙包裹置于50 mL離心管中，4 ℃離心10 min，轉速為3 000 r/min。記錄離心前的樣品質量（m1/g）和離心后的樣品質量（m2/g），WHC按照公式（2）計算。

1.4 數據統計與分析

每項實驗重復3～5 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 28.0軟件中ANOVA對實驗數據進行Duncan方差分析，以P＜0.05表示差異顯著；用GraphPad Prism 8.0.1軟件繪圖，并用Origin 9.2軟件作相關性分析。

2 結果與分析

2.1 預熟制處理對梭子蟹在凍藏期間pH值變化的影響

pH值是水產品品質中比較簡單易測的指標之一，能反映動物死后糖原轉化為有機酸以及肌肉組分（如蛋白質和核酸）的降解情況[16]。

由圖1可以看出，凍藏期間對照組（C組）pH值呈現先下降后上升的“V”型趨勢，0 d時蟹肉pH值為6.85±0.05，與金超等[17]的結果一致，表明樣品呈現高鮮度。隨著凍藏時間的延長，梭子蟹體內糖原分解產生乳酸等有機酸，導致pH值逐漸降低，C組前30 d pH值顯著下降（P＜0.05），并達到最低值6.30±0.04，之后在微生物及內源酶的共同作用下生成堿性含氮物，導致pH值升高。對于H-F組和F-H組而言，蟹肉pH值均高于C組，主要原因是蟹殼中含有較多的堿性物質，在高溫熟制過程中逐漸滲透到肌肉中，同時加熱還會引起肌肉蛋白產生一些小分子含氮物，引起pH值的升高[18]。凍藏期間，H-F組和F-H組蟹肉的pH值均呈現出先上升后下降直至平穩的趨勢，并均在凍藏30 d時達到最高值。

圖1 凍藏期間三疣梭子蟹蟹肉pH值的變化Fig.1 Changes in pH of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.2 預熟制處理對梭子蟹在凍藏期間TVB-N含量變化的影響

TVB-N含量可以反映肉制品在微生物和內源酶作用下，蛋白質及非蛋白含氮物降解為氨、生物胺等堿性物質的情況，是評判肉品新鮮度的一個重要指標[19]。GB 2733—2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》規定海蟹的TVB-N限值為25 mg/100 g[20]。

由圖2可知，3 組樣品的TVB-N含量隨凍藏時間的延長均呈現上升趨勢，其中C組TVB-N含量在各時間均存在顯著性差異（P＜0.05）。0 d時C組蟹肉的TVB-N含量為（5.02±0.23）mg/100 g，低于加熱組（H-F組和F-H組）（（8.05±0.35）mg/100 g），主要是因為加熱可引起部分蛋白質降解，引起揮發性含氮物質含量的增加，從而導致TVB-N含量增加。凍藏期間，C組蟹肉TVB-N含量穩定增加，在凍藏30、120 d和180 d時分別為（10.97±0.20）、（18.78±0.58）、（23.45±0.35）mg/100 g，均低于GB 2733—2015限值，表明梭子蟹在貯藏180 d后仍可食用。H-F組的TVB-N含量在前10 d無顯著性變化（P＞0.05），到第30天時，H-F組TVB-N含量為（10.27±0.23）mg/100 g，F-H組為（10.87±0.37）mg/100 g。凍藏時間超過30 d后，由于蛋白質降解以及微生物滋生等因素，TVB-N含量增長速率加快。凍藏180 d時，H-F組的TVB-N含量為（21.12±0.58）mg/100 g，低于C組和F-H組。可見，預熟制可有效抑制梭子蟹在凍藏期間蛋白質的腐敗變質，延緩TVB-N含量的增加，從而達到延長貨架期的效果。

圖2 凍藏期間三疣梭子蟹蟹肉TVB-N含量的變化Fig.2 Changes in TVB-N content of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.3 預熟制處理對梭子蟹在凍藏期間TVC變化的影響

TVC是評價食品被細菌污染程度的一個常見指標[21]，根據國際食品微生物委員會（International Commission on Microbiological Specifications for Food，ICMSF）[22]和GB 10136－2015《食品安全國家標準 動物性水產制品》[23]規定，即食生制動物性水產制品TVC不得高于5.0（lg（CFU/g））。

F-H 組在指標測定前有加熱處理，故僅測定C組和H-F組的TVC變化。由圖3可以看出，與第0天相比，C 組和H-F 組其他時期的T V C 均顯著升高（P＜0.05），并且H-F組增加速率始終小于C組。凍藏初期（第0 天）C 組和H-F 組的T V C 分別為（1.77±0.07）、（1.57±0.23）（lg（CFU/g）），主要是因為熟制處理具有殺菌作用，可有效降低內源酶活性，C組凍藏120 d后的TVC為（3.87±0.07）（lg（CFU/g）），約為新鮮蟹肉的100 倍，而H-F組的TVC則在150 d時達到熟制新鮮蟹肉的100 倍；凍藏180 d后，H-F組TVC為（4.03±0.17）（lg（CFU/g）），低于C組（（4.60±0.10）（lg（CFU/g））），且兩組均低于標準限值，說明在凍藏過程中仍有微生物滋生，但熟制后凍藏有助于降低蟹肉的TVC。Lorentzen等[24]指出，熟制后的雪蟹不論是－20 ℃凍藏還是先－40 ℃處理再－20 ℃凍藏，前4 d TVC均低于1.70（lg（CFU/g）），且在凍藏第9天，96 ℃熟制148 s組雪蟹的TVC顯著低于87 ℃熟制430 s組；Sarnoski等[25]研究表明，生雪蟹初始的TVC為1.65（lg（CFU/g））。綜上所述，熟制預處理可顯著減緩梭子蟹在凍藏期間微生物的增長速率，延長貨架期，這與TVB-N含量的測定結果一致。

圖3 凍藏期間三疣梭子蟹蟹肉TVC的變化Fig.3 Changes in TVC of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.4 預熟制處理對梭子蟹在凍藏期間WHC變化的影響

WHC是反映在外力作用下，食品組織牢固束縛住自身和外加水的能力。研究表明，蟹肉的嫩度、口感、柔軟性與WHC有很大關系，新鮮狀態下蟹肉WHC良好[26]。

由圖4 可知，C 組第0 天的W H C 為（78.13±0.97）%，高于加熱組（H-F組和F-H組，（75.71±0.46）%），這是因為經過加熱處理后蛋白質變性，肌纖維和肌肉結締組織被破壞，疏水基團暴露，最終引起WHC下降[27]。3 組蟹肉的WHC均在前10 d顯著降低（P＜0.05），C組在第60天下降至（69.51±0.82）%，之后下降趨勢減緩。H-F組蟹肉的WHC始終高于F-H組，180 d時為（64.57±0.89）%，而F-H組則降為（62.50±0.60）%，這是因為凍結過程中，水分會在相變過程中轉化為冰晶，冰晶的膨脹壓力會導致肌肉組織細胞形態改變、機械損傷等，從而導致WHC下降[28]；同時，因為預熟制會使蛋白質變性聚集并形成凝膠，使得更多的水分子結合在凝膠基質中，從而提高了其WHC。Wang Wenting等[29]研究發現，熱誘導肌漿蛋白可以促使其聚集并形成凝膠，對提高肉品WHC有重要意義；Powell等[30]報道溫度升高到90 ℃以上時，肌外膜、肌束膜和肌內膜中的膠原蛋白會克服分子間力的束縛，逐漸溶解，進而凝膠化形成明膠，對肉中水分起到一定程度的保留作用。

圖4 凍藏期間三疣梭子蟹蟹肉WHC的變化Fig.4 Changes in WHC of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.5 預熟制處理對梭子蟹在凍藏期間肌肉蛋白組成的影響

如圖5所示，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）（200 kDa）和肌動蛋白（Actin）（42 kDa）為主要蛋白。隨凍藏時間延長，C組蟹肉小分子蛋白條帶逐漸增多，這與凍藏期間大分子蛋白降解有關，可能是由于凍藏期間冰晶的生成引起肌肉蛋白空間結構改變[31]以及內源性蛋白酶和微生物滋生所產生的蛋白酶引起，相似的結論也在中華絨螯蟹中被報道[32]。經熟制處理后，蟹肉的MHC條帶變淺，而其他條帶的出現表明熟制處理可引起蟹肉蛋白結構的破壞。戴妍[33]也報道經歐姆加熱的豬肉，其MHC會輕微降解，主要是在某一溫度下內源酶的高活性引起的。此外，對于F-H組而言，一方面和C組樣品一樣，隨著凍藏時間的延長其肌肉蛋白逐漸被降解；另一方面，解凍后的梭子蟹在熟制的過程中，部分肌肉蛋白也會因某一溫度下蛋白酶的高活性作用而被降解，因此相對于C組和H-F組，180 d時F-H組MHC的降解更為明顯。

圖5 凍藏期間三疣梭子蟹肌肉蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE profiles of P.trituberculatus meat proteins during frozen storage

2.6 預熟制處理對梭子蟹在凍藏期間肌肉微觀結構的影響

如圖6所示，0 d時C組蟹肌肉排列清晰、致密整齊，肌纖維明顯且粗壯，表明新鮮梭子蟹肌肉品質良好；凍藏30 d后肌纖維仍明顯粗壯、致密，肌肉結構變化不大；繼續凍藏后肌纖維結構逐漸變細小且無序，180 d后肌肉結構雜亂且模糊，此時蟹肉呈糜狀，食用品質下降。秦輝[34]報道中華絨螯蟹在－24 ℃下凍藏6 個月后，由于自身酶系的作用，肌肉纖維由清晰壯實變為模糊細短，且蛋白質網狀結構基本消失，本研究結果與之類似。本研究中可以明顯觀察到加熱組（H-F組、F-H組）肌纖維結構的變化，原因在于加熱促進了肌肉蛋白的交聯和聚集，相比H-F組，F-H組蟹肉肌纖維排列無序化程度及肌纖維孔隙較大，180 d時肌肉呈現連續的斷裂現象，說明肌節變短、蟹肉呈糜狀。由此可以說明，預熟制處理后凍藏對蟹肉的肌纖維結構有一定的保護作用，這與蟹肉WHC和肌肉蛋白組成的測定結果相印證。

圖6 凍藏期間三疣梭子蟹肌肉微觀結構的變化（×3 000）Fig.6 Changes in microstructure of P.trituberculatus meat during frozen storage (× 3 000)

2.7 預熟制處理對梭子蟹在凍藏期間肌肉色澤的影響

良好的色澤呈現有助于提高消費者對于產品的接受度，W值是衡量蟹肉品質的一個重要指標，與WHC及蛋白質的變性程度呈一定程度的正相關[35]。由表1可知，與第0天相比，加熱組（H-F組、F-H組）W值均呈下降趨勢，尤其是凍藏后期顯著降低（P＜0.05）；W值越低表明蟹肉顏色越暗，其品質越差，可能是凍藏期間水分的散失及肌肉蛋白或脂質發生氧化造成了蟹肉色澤變暗[36]。凍藏初期，C組的b*值減小，說明由肌肉顏色由黃變藍，可能是由于凍藏過程中蟹體的血藍蛋白發生氧化變成藍色，導致b*值減小[37]。與C組相比，加熱組（H-F和F-H組）經過熟制，W值都有不同程度的增加，且H-F組的W值略高于F-H組，可能是熟制時的高溫使肌紅蛋白和血藍蛋白變性，以及在凍藏過程中冰晶的形成，共同導致了肌肉結構蛋白肌纖維直徑減小、肌節收縮，進而影響了光在肌肉中的散射，最終導致了W值的下降[27]。李雙琦等[38]在研究中指出，低溫真空烹飪的鱸魚肉L*值及a*值均高于傳統沸煮的鱸魚肉；王丹青[39]則指出經低鹽度海水暫養后，中華絨螯蟹蟹殼、蟹黃a*值均提高，蟹膏L*值增加。

表1 凍藏期間三疣梭子蟹蟹肉色澤的變化Table 1 Changes in color parameters of P.trituberculatus meat during frozen storage

2.8 蟹肉品質指標的相關性分析

如圖7所示，TVB-N含量和TVC存在極顯著正相關，說明梭子蟹品質的下降伴隨著氨和胺類等堿性含氮物質的生成，以及細菌的滋生。TVB-N含量與WHC、W值分別呈顯著和極顯著負相關，主要是因為凍藏期間冰晶的生成會使蛋白質發生變性與聚集，引起蛋白質空間結構的改變，導致肌肉失水、顏色變暗，最終促使蟹肉品質劣變。綜上所述，蟹肉凍藏過程中品質變化可由TVB-N含量、TVC、WHC以及W值等指標評價。

圖7 三疣梭子蟹蟹肉pH值、TVB-N含量、TVC、WHC、W值的相關性分析Fig.7 Correlation analysis among pH, TVB-N content, TVC, WHC and whiteness of P.trituberculatus meat

3 結 論

本研究探究預熟制處理對三疣梭子蟹在凍藏過程中肌肉生化特性的影響，結果表明，加熱導致梭子蟹肌肉W值升高，而凍藏時間延長則使W值下降。經預熟制處理的梭子蟹在凍藏過程中pH值比較穩定，TVB-N含量和TVC增長較為緩慢，WHC保持較好，肌肉斷裂程度較小。說明預熟制處理可有效減緩梭子蟹在凍藏期間的品質劣化，對延長貨架期有著積極作用，本研究結果可為三疣梭子蟹預制菜的加工貯藏提供參考依據。