紫蘇醛對楊梅主要致病菌桔青霉的抑菌活性及作用機(jī)制

李瑞一，吳偉杰*，房祥軍，陳杭君，韓延超，牛 犇，陳慧芝，郜海燕*

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蔬菜采后保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建），浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310000）

楊梅（Myrica rubraSieb.et Zucc.）多成熟于6～7月高溫潮濕的梅雨季節(jié)[1]，其質(zhì)地柔軟多汁，組織形態(tài)為柱狀多肉形態(tài)，在采后運(yùn)輸、貯藏等環(huán)節(jié)極易受到機(jī)械損傷以及病原微生物的侵害[2]，不同地區(qū)造成楊梅病害的致病菌也存在些許差異[3]，桔青霉（Penicillium citrinum）侵染造成的綠霉病是楊梅采后的主要病害之一[4]。桔青霉菌落顏色主要為黃綠色，帶有白色邊緣，侵染楊梅果實(shí)后表面會遍布綠色霉菌[5]，造成果實(shí)硬度降低等變化，失去食用價值。傳統(tǒng)的化學(xué)保鮮劑雖然可有效抑制采后楊梅果實(shí)病害的發(fā)生，但是隨著人們對健康和環(huán)境保護(hù)的意識不斷增強(qiáng)，尋找一種綠色健康、安全無毒的抑制楊梅采后腐敗變質(zhì)的處理方法迫在眉睫[6-7]。

紫蘇醛是從紫蘇葉中提取出來的一種無色或淡黃色且具有特殊香氣的油狀液體[8-9]，具有良好的抑菌性[10-11]。已有研究證明，紫蘇醛作為天然防腐劑能有效抑制采后葡萄和櫻桃番茄因病原微生物侵染造成的腐敗變質(zhì)問題[12-13]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》明確規(guī)定，紫蘇醛能夠作為食用天然香料添加劑在食品中使用，具有良好的安全性[14]。因此，紫蘇醛作為一種天然的綠色安全活性成分具有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)基于紫蘇醛優(yōu)良的抑菌性和安全性能，探討紫蘇醛對桔青霉的抑菌效果及抑菌機(jī)理，為紫蘇醛對桔青霉的控制提供一定的理論依據(jù)，也為楊梅采后貯藏提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

桔青霉（Penicillium citrinum）由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所食品物流保鮮與品質(zhì)調(diào)控團(tuán)隊(duì)從采后楊梅中分離獲取，經(jīng)鑒定為桔青霉，在PDA斜面培養(yǎng)基上于4 ℃保存。

紫蘇醛 上海源葉生物科技有限公司；PDA、PDB上海盛思生物科技有限公司；ATP酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌器 日本松下健康醫(yī)療器械；MJX-160B-Z型霉菌培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；無菌超凈工作臺 江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；DDS-307型電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-9000紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；TM-3000型掃描電子顯微鏡、H7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；FTIR-1500傅里葉變換紅外光譜儀深圳市億鑫儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液制備

將桔青霉接種在PDA上，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)7 d左右后用無菌水沖洗，經(jīng)4 層200 目的無菌紗布過濾，得到孢子懸浮液。用血球計數(shù)板將孢子懸浮液濃度調(diào)整至1×106CFU/mL，備用。

1.3.2 桔青霉最小抑菌濃度測定

參考Pérez-Alfonso等[15]的方法并加以修改。將紫蘇醛和含體積分?jǐn)?shù)5%吐溫-80的無菌水按體積比1∶1進(jìn)行混合，配制成500 μL/mL的紫蘇醛母液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩４郎缇玫腜DA自然冷卻至45 ℃左右時，將不同體積的紫蘇醛母液加入其中，形成終濃度分別為0、30、60、90、120 μL/L的含有紫蘇醛的PDA平板，備用。使用打孔器在培養(yǎng)5 d左右的桔青霉菌落邊緣打取直徑6 mm左右菌餅，置于含有不同濃度紫蘇醛的PDA平板中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，每天觀察并用十字交叉法測量菌落直徑，以能完全抑制桔青霉菌落生長的最小濃度為最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。每個處理組3 個平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉孢子萌發(fā)率測定

參考Li Hua等[16]的方法并加以修改。將不同體積500 μL/mL的紫蘇醛母液分別加入到滅菌且冷卻后的PDB中，形成體積分?jǐn)?shù)分別為0、15、30、45、60 μL/L含有紫蘇醛的PDB溶液。將適量桔青霉孢子懸浮液加入PDB溶液中，調(diào)整孢子濃度為1×106CFU/mL。分別吸取50 μL含有不同濃度紫蘇醛的PDB孢子懸浮液于雙凹載玻片上，并放在直徑為200 mm的培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)15 h，9、12、15 h時觀察孢子萌發(fā)數(shù)量（Ng）（芽管生長長度大于孢子直徑視為萌發(fā)）。每個處理組 3 個平行，每次鏡檢孢子數(shù)200 個，孢子萌發(fā)率按公式（1）計算。

1.3.4 不同濃度紫蘇醛處理對桔青霉菌絲生長抑制影響的測定

參考袁康等[17]的方法并加以修改。按照1.3.3節(jié)方法制備含有不同濃度紫蘇醛（0、30、60、90、120 μL/L）的PDB溶液。加入適量孢子懸浮液，使得孢子濃度為5×105CFU/mL，置于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d，過濾收集菌絲體。60 ℃烘干箱干燥24 h，稱質(zhì)量。每個處理組3 個平行，菌絲生長抑制率按公式（2）計算。

式中：mc表示未處理組菌絲體平均質(zhì)量/g；ms表示處理組菌絲平均質(zhì)量/g。

1.3.5 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉細(xì)胞膜通透性指標(biāo)測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定：吸取適量孢子懸浮液于PDB溶液中，使得孢子濃度為5×105CFU/mL，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d。隨后分別向PDB中加入適量500 μL/mL的紫蘇醛母液，使每組PDB溶液中紫蘇醛的濃度分別為0、30、60、90、120 μL/L。連續(xù)培養(yǎng)12 h，每3 h收集培養(yǎng)液，使用硫代巴比妥酸法[18]測定MDA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

相對電導(dǎo)率測定：吸取適量孢子懸浮液于PDB溶液中，使得孢子濃度為5×105CFU/mL，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d，過濾收集菌絲體。取2.0 g菌絲體放入30 mL含有0、30、60、90、120 μL/L紫蘇醛的無菌水中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h，每3 h利用電導(dǎo)率儀測定上清液的電導(dǎo)率，最后用沸水煮沸處理10 min，冷卻至室溫，再次測定電導(dǎo)率，相對電導(dǎo)率按公式（3）計算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

式中：e0表示0 h的電導(dǎo)率/（μS/cm）；e1表示沸水處理后的電導(dǎo)率/（μS/cm）。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察不同濃度紫蘇醛處理后的桔青霉

參照He Lili等[19]的方法并加以修改，在培養(yǎng)5 d的桔青霉菌用打孔器打取直徑6 mm左右的菌餅，分別放置于含有0、60、90 μL/L紫蘇醛的PDA板中央，28 ℃培養(yǎng)6 d后收集菌絲體，經(jīng)固定、脫水、噴金處理，使用掃描電子顯微鏡觀察拍照。

1.3.7 透射電子顯微鏡觀察不同濃度紫蘇醛處理后的桔青霉形態(tài)

參考Bonora等[20]的方法并加以修改，在培養(yǎng)5 d的桔青霉菌培養(yǎng)基中用打孔器打取直徑6 mm左右的菌餅，分別放置于含有0、60、90 μL/L紫蘇醛的PDA板中央，28 ℃培養(yǎng)6 d，經(jīng)固定、脫水、切片后，使用透射電子顯微鏡拍照觀察。

1.3.8 不同濃紫蘇醛處理后桔青霉細(xì)胞內(nèi)容物泄漏量的測定

參照1.3.5節(jié)相對電導(dǎo)率測定法收集菌絲體，取2.0 g菌絲體放入30 mL含有0、30、60、90、120 μL/L紫蘇醛的無菌水中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 h，每小時吸取上清液，參考Pei Shaopei等[21]的方法進(jìn)行可溶性糖、可溶性蛋白及核酸（260 nm）泄漏量的測定。

1.3.9 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉麥角固醇含量測定

按照1.3.4節(jié)方法得到桔青霉菌絲體，參考袁康等[17]的方法并加以修改。使用無菌蒸餾水沖洗兩遍后加入5 mL 25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的氫氧化鉀-乙醇溶液。漩渦振蕩3 min，85 ℃水浴3 h，加入2 mL蒸餾水和5 mL正庚烷后振蕩3 min，收集正庚烷層溶液，測定麥角固醇含量。

1.3.10 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉線粒體ATP酶活力測定

按照1.3.4節(jié)方法得到桔青霉菌絲體，使其重懸于緩沖溶液中（含有50 mmol/L Tris（pH 7.0）、2 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L苯基甲磺酰氟，下同），振蕩3 min，10 000 r/min離心20 min，取上清液，加入2%（體積分?jǐn)?shù)）葡萄糖溶液破壞細(xì)胞得到線粒體，先2 000 r/min離心5 min，接著10 000 r/min離心30 min，棄上清液后加入1 mL緩沖液重懸后使用ATP酶試劑盒檢測桔青霉中的線粒體ATP酶活力。

1.3.11 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉幾丁質(zhì)含量測定

幾丁質(zhì)含量測定參考曾輝等[22]方法并略加修改，按照1.3.4節(jié)方法得到桔青霉菌絲體，準(zhǔn)確稱取0.3 g桔青霉菌絲體，向其中加入2 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)60% H2SO4，室溫放置1 d。加入適量蒸餾水將H2SO4濃度稀釋到1 mol/L，沸水浴1 h，冷卻到室溫后加入1 mol/L NaOH溶液中和至中性，使用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）定容至100 mL。取1 mL待測樣液（0.25 mL蒸餾水作空白），加入0.5 mL乙酰丙酮溶液后沸水浴0.5 h，冷卻至室溫后加入1 mL無水乙醇和0.5 mL對二氨基苯甲醛溶液，搖勻后加入2 mL無水乙醇，60 ℃水浴1 h，使用紫外-可見分光光度計測定495 nm波長處的吸光度。

1.3.12 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉總脂質(zhì)含量測定

按照1.3.11節(jié)方法，稱取0.1 g菌絲體于離心管中，加入0.8 mL蒸餾水、2 mL氯仿溶液、1 mL甲醇，漩渦振蕩3 min，60 ℃水浴30 min，10 000 r/min離心20 min，吸取氯仿層到新離心管中，加入0.2 mL生理鹽水，漩渦振蕩，待分層后取氯仿相至玻璃管中，加入500 μL濃硫酸后沸水浴10 min，冷卻至室溫后加入3 mL磷酸香草醛溶液，以無菌水為對照（CK），測定520 nm波長處的吸光度，以膽固醇質(zhì)量濃度（0～120 μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.13 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉傅里葉變換紅外光譜測定

按照1.3.4節(jié)方法得到桔青霉菌絲體，使用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）沖洗2～3 次后使用冷凍干燥機(jī)凍干備用。將凍干后的物質(zhì)與光譜級溴化鉀進(jìn)行混合研磨，使用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用SPSS軟件中單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05時表示差異顯著，利用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度紫蘇醛處理對桔青霉抑菌效果的影響

如圖1A、B所示，隨著紫蘇醛濃度的增大，菌落直徑顯著減小，在培養(yǎng)到第6天時，120 μL/L紫蘇醛處理的桔青霉菌落則完全不生長，初步確定紫蘇醛抑制桔青霉生長的MIC為120 μL/L。如圖1C所示，隨著紫蘇醛濃度的升高，孢子萌發(fā)率顯著下降，在培養(yǎng)15 h后，對照組（0 μL/L）孢子超過85%已經(jīng)萌發(fā)，15、30、45、60 μL/L紫蘇醛處理組的萌發(fā)率分別為69.67%、50.50%、20.83%、9.00%，表明紫蘇醛處理能夠顯著抑制桔青霉孢子的萌發(fā)。從圖1D可以看出，隨著紫蘇醛濃度的升高，桔青霉菌絲質(zhì)量呈現(xiàn)顯著降低趨勢，與對照組（0 μL/L）相比，30、60、90、120 μL/L紫蘇醛處理組中菌絲生長抑制率為15.13%、47.70%、91.42%、99.09%，抑制桔青霉菌絲體生長的效果十分明顯。綜上所述，紫蘇醛在直接接觸桔青霉菌絲及孢子的情況下，能夠有效抑制菌絲和孢子的生長，且抑制效果呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖1 不同濃度紫蘇醛對桔青霉菌絲生長（背）（A）、菌落直徑（B）、孢子萌發(fā)率（C）和菌絲質(zhì)量（D）的影響Fig.1 Effects of different concentrations of perillaldehyde on mycelial growth (dorsal) (A), colony diameter (B), spore germination rate (C) and mycelial biomass(D) of P.citrinum

2.2 不同濃度紫蘇醛處理對桔青霉細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜通透性是衡量抑菌效果的重要依據(jù)[23]。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，其含量能夠間接表征細(xì)胞膜氧化受損的程度[24]。如圖2A所示，隨著紫蘇醛濃度升高和處理時間延長，MDA含量呈現(xiàn)上升的趨勢，，處理12 h后，30、60、90、120 μL/L紫蘇醛處理組的MDA含量分別為0.74、0.85、1.04、1.24 nmol/g，對照組（0 μL/L）MDA含量顯著低于各處理組（P＜0.05）。從圖2B可以看出，隨著紫蘇醛濃度增加和處理時間延長，相對電導(dǎo)率增加，處理6 h后，30、60、90、120 μL/L紫蘇醛處理組的相對電導(dǎo)率分別為13.28%、19.56%、2 3.4 1%、3 1.4 4%，顯著高于對照組（0 μ L/L）（P＜0.05）。綜上，紫蘇醛處理能夠加劇桔青霉細(xì)胞膜脂過氧化，增加細(xì)胞膜相對電導(dǎo)率，表明紫蘇醛處理可能破壞了桔青霉的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，這和劉達(dá)照[25]的研究結(jié)果相似。

圖2 不同濃度紫蘇醛處理對桔青霉MDA含量（A）和相對電導(dǎo)率（B）的影響Fig.2 Effects of different concentrations of perillaldehyde on MDA content (A) and relative electrical conductivity (B) of P.citrinum

2.3 不同濃度紫蘇醛處理對桔青霉形態(tài)的影響

對照組（0 μL/L）桔青霉菌絲呈現(xiàn)管狀、線性的正常形態(tài)，質(zhì)地均勻、光滑，頂端為掃帚狀的分生孢子頭（圖3A1、A2）；經(jīng)60 μL/L紫蘇醛處理后的桔青霉菌絲部分出現(xiàn)斷裂，且頂端掃帚狀分生孢子頭消失（圖3B1、B2）；經(jīng)90 μL/L紫蘇醛處理后菌絲融斷現(xiàn)象嚴(yán)重，且菌絲雜亂無章地聚集到一起，頂端掃帚狀分生孢子頭完全消失，菌絲形態(tài)完全遭到破壞（圖3C1、C2）。陶能國等[26]也發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)能夠破壞青霉細(xì)胞的完整性，改變膜通透性。潘旭遲等[27]研究表明植物提取物處理的菌絲會出現(xiàn)溶解，褶皺等現(xiàn)象。綜上所述，紫蘇醛可能通過破壞膜完整性使真菌死亡，通過破壞膜的完整性，促進(jìn)胞內(nèi)水解酶泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞自融，從而改變桔青霉的形態(tài)。

圖3 紫蘇醛處理后桔青霉菌絲的掃描電子顯微鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopic images of P.citrinum mycelia treated with perillaldehyde

2.4 不同濃度紫蘇醛處理對桔青霉超微結(jié)構(gòu)的影響

從圖4A1、A2可以看出，未經(jīng)過紫蘇醛處理的桔青霉細(xì)胞壁、質(zhì)膜均具有良好的完整性，胞內(nèi)擁有完整的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞器，桔青霉細(xì)胞之間有明顯的質(zhì)膜界限，層次感分明。經(jīng)60 μL/L紫蘇醛處理的桔青霉細(xì)胞細(xì)胞壁遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，細(xì)胞質(zhì)膜模糊，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，部分出現(xiàn)輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象（圖4B1、B2）。經(jīng)90 μL/L紫蘇醛處理的桔青霉細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)降解以及大量細(xì)胞器破裂，出現(xiàn)不規(guī)則的囊泡，造成嚴(yán)重質(zhì)壁分離現(xiàn)象（圖4C1、C2）。王近近等[28]研究也發(fā)現(xiàn)精油處理能夠破壞灰葡萄孢霉細(xì)胞壁，細(xì)胞器受損，出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象。綜上所述，紫蘇醛處理可以破壞桔青霉菌絲體細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖4 紫蘇醛處理后桔青霉菌絲的透射電子顯微鏡圖（×20k）Fig.4 Transmission electron microscopic images of P.citrinum mycelia treated with perillaldehyde (× 20k)

2.5 不同濃度紫蘇醛對桔青霉細(xì)胞內(nèi)容物泄漏量的影響

細(xì)胞內(nèi)容物滲漏量是判定細(xì)胞膜損傷的重要指標(biāo)。從圖5可以看出，隨著處理時間的延長，對照組（0 μL/L）的可溶性蛋白、可溶性糖以及核酸泄漏量情況基本沒有發(fā)生變化。紫蘇醛處理組中隨著時間的延長以及紫蘇醛濃度的增加，各物質(zhì)泄漏量上升。與0 h相比，處理5 h時120 μL/L紫蘇醛處理組桔青霉可溶性蛋白、可溶性糖和核酸泄露量分別增加了71.20%、210.93%和117.31%，此時120 μL/L紫蘇醛處理組可溶性蛋白、可溶性糖以及核酸泄漏量顯著高于其他組（P＜0.05）。結(jié)果表明紫蘇醛能夠增加桔青霉細(xì)胞的通透性，推測可能是因?yàn)樽咸K醛作為脂溶性物質(zhì)，能夠與桔青霉細(xì)胞膜中磷脂雙分子層相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜的破損，進(jìn)而導(dǎo)致桔青霉細(xì)胞內(nèi)容物泄漏[21]，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換失衡，進(jìn)而誘導(dǎo)桔青霉細(xì)胞凋亡。

圖5 不同濃度紫蘇醛對桔青霉細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白（A）、可溶性糖（B）和核酸（C）泄漏量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of perillaldehyde on leakage of soluble carbohydrate (A), soluble protein (B) and nucleic acid (C) from the mycelia of P.citrinum

2.6 不同濃度紫蘇醛對桔青霉麥角固醇、幾丁質(zhì)、總脂質(zhì)水平和線粒體ATP酶活力的影響

幾丁質(zhì)和麥角固醇分別是真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中重要的組成成分，其中麥角固醇能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動性，維持細(xì)胞膜中蛋白酶的正常工作和質(zhì)膜蛋白的定位功能[29]，而幾丁質(zhì)為抗菌物質(zhì)的常用靶點(diǎn)[30]。從圖6A中可以看出，隨著紫蘇醛濃度的升高，桔青霉中麥角固醇含量呈現(xiàn)下降趨勢，0、30、60、90 μL/L紫蘇醛處理組中麥角固醇含量分別為1.70、1.12、0.56、0.34 mg/g，對照組（0 μL/L）麥角固醇含量顯著高于其他各組（P＜0.05）。由圖6B可知，隨著紫蘇醛濃度的增加，幾丁質(zhì)水平呈現(xiàn)下降的趨勢。0、30、60、90 μL/L紫蘇醛處理組幾丁質(zhì)水平分別為94.87、68.54、56.83、33.23 μg/mL，對照組幾丁質(zhì)水平顯著高于各處理組（P＜0.05）。從圖6C可以看出，隨著紫蘇醛濃度的增加，桔青霉總脂質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢，0、30、60、90 μL/L紫蘇醛處理組中總脂質(zhì)含量分別120.26、88.05、35.89、22.55 mg/g，對照組（0 μL/L）含量顯著高于其他各處理組（P＜0.05）。線粒體ATP酶作為細(xì)胞代謝中一種關(guān)鍵酶，其活力的下降會導(dǎo)致細(xì)胞中ATP酶生成量不足，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞死亡[31]，從圖6D可以看出，隨著紫蘇醛濃度的上升，桔青霉的線粒體ATP酶活力呈現(xiàn)下降趨勢。0、30、60、90 μL/L紫蘇醛處理組中ATP酶活力分別為11.50、5.21、3.08、1.45 U/mg pro，對照組顯著高于處理組（P＜0.05）。綜上，與未處理組相比，經(jīng)過90 μL/L紫蘇醛處理的桔青霉中麥角固醇、總脂質(zhì)、幾丁質(zhì)水平和線粒體ATP酶活力下降了80.00%、81.25%、64.97%和87.40%，紫蘇醛能夠破壞桔青霉細(xì)胞壁，使細(xì)胞支架遭到破壞，此外，桔青霉可能抑制桔青霉中某些膜蛋白的功能和破壞膜的完整性，抑制麥角固醇等的生成，使總脂質(zhì)含量下降，這可能會改變脂溶性和水溶性物質(zhì)的運(yùn)輸速率[32]，破壞桔青霉細(xì)胞膜的選擇透過性，從而進(jìn)一步抑制線粒體ATP酶活力，導(dǎo)致細(xì)胞消耗ATP能力降低，使桔青霉細(xì)胞死亡。

圖6 不同濃度紫蘇醛對桔青霉麥角固醇（A）、幾丁質(zhì)（B）、總脂質(zhì)（C）水平和線粒體ATP酶活力（D）的影響Fig.6 Effects of different concentrations of perillaldehyde on ergosterol content (A), chitin content (B), total lipids content (C) and mitochondrial ATPase activity (D) of P.citrinum

2.7 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉的傅里葉變換紅外光譜

從圖7可以看出，不同組桔青霉菌絲體傅里葉紅外光譜圖的特征峰出現(xiàn)的位置幾乎相同，但峰強(qiáng)度有所差異。在3 380 cm－1波數(shù)附近出現(xiàn)羥基（—OH）的伸縮振動，在2 925 cm－1波數(shù)附近出現(xiàn)了甲基（—CH3）和亞甲基（—CH2—）的伸縮振動，在1 653 cm－1波數(shù)附近出現(xiàn)芳香族骨架振動，在1 547 cm－1波數(shù)附近出現(xiàn)苯環(huán)碳骨架的振動，且隨紫蘇醛處理濃度增加，這些峰強(qiáng)度減小，推測桔青霉羥基結(jié)構(gòu)、甲基、亞甲基數(shù)量減少，脂肪組物質(zhì)、碳水化合物、木質(zhì)素等含量減少[33]。結(jié)果表明紫蘇醛處理桔青霉可能使菌絲體內(nèi)部物質(zhì)含量發(fā)生變化。

圖7 不同濃度紫蘇醛處理后桔青霉的傅里葉變換紅外光譜Fig.7 FTIR spectra of P.citrinum treated with different concentrations of perillaldehyde

3 討 論

隨著生活水平的升高，人們對貨架果蔬的品質(zhì)要求也越來越高。在果蔬保鮮過程中，化學(xué)合成的防腐劑和殺菌劑被廣泛使用，但都具有一定的安全隱患。開發(fā)綠色安全的天然抑菌劑已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，利用植物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)作為高效無毒環(huán)保的抑菌劑具有極廣闊的應(yīng)用前景。

紫蘇醛作為從紫蘇葉中提取出來的綠色天然活性成分[34]，具有良好的安全性、抗菌、抗氧化性等，能夠通過直接接觸的方式抑制楊梅主要致病菌桔青霉菌絲生長及孢子萌發(fā)。本研究結(jié)果表明，紫蘇醛能夠破壞桔青霉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致幾丁質(zhì)和麥角固醇含量下降，該結(jié)果與紫蘇醛導(dǎo)致甘薯黑斑病菌細(xì)胞膜中麥角固醇含量降低、破壞甘薯黑斑病菌細(xì)胞膜流動性和完整性的研究結(jié)果[10]相似。本研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇醛處理能夠加劇桔青霉細(xì)胞膜脂過氧化，提高細(xì)胞膜的相對電導(dǎo)率，降低總脂質(zhì)含量，從而會改變細(xì)胞膜的選擇通過性，進(jìn)一步抑制線粒體ATP酶活力，促使細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降，干擾細(xì)胞內(nèi)能量代謝過程，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，與袁康等[17]研究的紫蘇精油抑制灰綠曲霉的活性和機(jī)理相似。此外，紫蘇醛處理導(dǎo)致桔青霉蛋白質(zhì)、碳水化合物和核酸等物質(zhì)流失，破壞了蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抑制桔青霉的效果[35-36]，由此推測紫蘇醛的抑菌機(jī)理可能與其擁有較強(qiáng)極性和穿透力的理化性質(zhì)相關(guān)[37]，紫蘇醛擁有極強(qiáng)的親脂性，能夠和桔青霉細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致其細(xì)胞膜的特性發(fā)生改變從而影響菌絲體生長，隨后進(jìn)一步穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，干擾細(xì)胞能量代謝等過程，從而降低桔青霉細(xì)胞整體的活性，達(dá)到抑菌效果。

本研究結(jié)果表明，紫蘇醛可以破壞桔青霉的菌絲形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其通透性、擾亂能量代謝過程、影響生物大分子合成、破壞蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抑菌作用。因此，紫蘇醛作為植物源抑菌物質(zhì)具有一定的研究和開發(fā)價值，本實(shí)驗(yàn)可為綠色安全的天然保鮮劑研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。