預冷方式對甜櫻桃采后耐貯性及新橙皮苷代謝的影響

馮雅蓉，杜俊杰*

（山西農業大學園藝學院，山西 晉中 030801）

甜櫻桃作為一種高檔精品水果，素有“春果第一枝”的美譽，其口感酸甜，不僅對豐富、調節水果市場供應具有特殊作用，而且富含鐵、VA和有機酸等營養物質，深受消費者喜愛[1-3]。然而甜櫻桃采后貯藏和貨架時間較短，易出現果肉褐變、軟化、風味變淡、腐爛等品質劣變現象[4-5]。預冷作為果蔬采后冷鏈物流的首要環節，可有效去除果蔬田間熱，降低其采后生理代謝速率，延緩其營養成分降解，抑制腐敗變質，對提高甜櫻桃耐貯性和減少采后損失具有重要意義。不同預冷技術對果蔬采后品質的影響存在明顯差異[6-8]，趙安琪等[9]發現真空預冷聯合微酸性電解水處理可有效延緩采后雞毛菜的黃化衰老進程，并維持其組織較好的商品特性；李燕等[10]發現壓差預冷處理對長棗貯藏穩定性的提升效果明顯優于真空預冷和冷庫預冷；時文林等[11]發現流態冰預冷處理可明顯延緩甜玉米品質劣變，其效果優于冷庫預冷和壓差預冷。這些研究已證實適宜的采后預冷方式對緩解果蔬采后貯藏品質的劣變和降低腐爛率具有重要意義。然而針對甜櫻桃目前已有的相關研究主要集中在預冷方式對甜櫻桃貨架品質[12]、氣調包裝保鮮效果[13]、貯藏期間糖酸含量變化[14]、冷藏期間真菌多樣性[15]及預冷技術參數優化[16-17]等方面，不同預冷方式對甜櫻桃采后耐貯性的影響還不清楚。

新橙皮苷作為一種查耳酮衍生物，因其甜度是蔗糖1 100 倍（以質量計），被認為是一種天然的、可用于食品添加劑的新型甜味劑；同時，其具有良好的抗過敏、抗氧化和調節糖脂代謝等作用[18-20]，近年來在食品和醫藥領域引起了廣泛關注。目前研究者已從柑橘類水果、陳皮、枳殼、橄欖仁紅皮、釀酒葡萄等[18,21]中檢測到了新橙皮苷的存在，并研究了其提取工藝和檢測技術，且為解決提取工藝繁瑣、成本高的問題，還有研究者探究了其化學合成工藝[22-23]，為新橙皮苷的商品化應用奠定了基礎。本課題組前期通過代謝物高通量檢測技術證實了甜櫻桃可合成新橙皮苷，而且發現不同預冷技術下的甜櫻桃新橙皮苷含量存在一定差異（文章未發表）。目前，甜櫻桃酸甜偏酸型口感與近年來消費者口感變甜之間的沖突愈發明顯，而高甜度品種又難以滿足糖尿病和高血糖患者的需求，因此，明確甜櫻桃中新橙皮苷的合成代謝機制，從而通過提高新橙皮苷含量來改善其口感并滿足高血糖患者甜型口感需求具有重要意義。因此，本研究以‘紅瑪瑙’甜櫻桃為材料，探究不同預冷方式對其耐貯性和貯藏期間新橙皮苷含量變化的影響，并從黃酮生物合成途徑（map00941）中新橙皮苷合成通路探究預冷方式對新橙皮苷合成相關基因表達量的影響，以期篩選出可有效提升甜櫻桃耐貯性的適宜預冷方式，降低采后損失，明確其對甜櫻桃貯藏期間新橙皮苷代謝的影響，為基于新橙皮苷甜味作用的甜櫻桃品種和口感改良技術的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜櫻桃供試品種為‘紅瑪瑙’，于2020年5月8日在山西省晉中市太谷縣種植區選擇深紅色、大小均勻、色澤相近、約9 成熟果實進行采收，置于可掀蓋泡沫盒（20 cm×10 cm×12 cm）中，每盒約2 kg，2 h內采用低溫周轉箱運回實驗室，剔除具有機械損傷、病蟲害及色澤差異較大的果實后，進行后續實驗。

愈創木酚、Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4·H2O、聚乙烯吡咯烷酮、2,6-二氯酚靛酚鈉鹽、碳酸氫鈉、抗壞血酸（VC）、丙酮 天津市光復精細化工研究所；草酸 天津市風船化學試劑科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉 天津市申泰化學試劑有限公司；氫氧化鈉北京化工廠；甲酸 天津市東麗化工廠；過氧化物酶（peroxisome，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）、脂氧合酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酰輔酶A連接酶、肉桂醇脫氫酶試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；新橙皮苷（CAS：13241-33-3） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TRIzol、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒 日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

單元式差壓預冷箱由山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所研制，規格為1 700 mm×1 370 mm×550 mm，由靜壓箱、卷簾苫布、控制系統等組成，配置有額定功率2.2 kW的軸流風機1 臺，風量18 000 m3/h。

KDC-140HR高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；752N紫外-可見分光光度計 上海精科上海精密科學儀器有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴裝置 天津市泰斯特儀器有限公司；GC-14C型氣相色譜儀 日本島津公司；F-920便攜式氧氣和二氧化碳分析儀 美國Felix公司；HD-YT-3G便攜式臭氧發生器北京環都亞泰環保科技有限公司；ERUN-SP-O3手持式水質臭氧分析儀 西安贏潤環保科技集團有限公司；FT-327型果實硬度計 意大利TR公司；U3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國Thermo Fisher公司；QuantStudioTM3實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀美國ABI公司；電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 預冷處理

將120 kg甜櫻桃隨機分成4 組，每個處理組5 kg、重復6 次，隨后進行預冷處理，設置預冷終溫度為2 ℃（果心溫度）。第1組采用冷庫風冷處理：將甜櫻桃用0.03 mm聚乙烯（polyethylene，PE）保鮮袋包裝，置于39 cm×26 cm×16 cm的塑料框中，0～2 ℃冷庫敞口通風預冷12 h，風速1.5 m/s；第2組采用壓差預冷處理：將甜櫻桃參照焦旋等[24]的方法擺放，預冷參數為溫度0～2 ℃，風速9.3 m/s，預冷時間0.5～1 h；第3、4組分別采用冰水預冷和臭氧冰水預冷處理：將甜櫻桃分別放入（1.0±0.5）℃冰水（采用pH 7.28自來水，部分存入冷庫，部分冷凍制成冰塊，混合制得（1.0±0.5）℃冰水）和含臭氧質量濃度為（2.0±0.1）mg/L的臭氧冰水中（采用便攜式臭氧發生器制備臭氧；采用手持式水質臭氧分析儀檢測臭氧質量濃度），預冷45 min。預冷完成后，立即將4 組甜櫻桃使用0.03 mm PE保鮮袋包裝，置于39 cm×26 cm×16 cm的塑料框中，于（0.0±0.5）℃冷庫貯藏30 d，期間每5 d測定一次樣品品質和酶活力指標。

1.3.2 甜櫻桃耐貯性生理生化指標測定

1.3.2.1 感官品質

病情、褐變指數：參照張立新等[25]的方法，統計各處理組果實腐爛等級、果肉褐變等級，并計算病情指數和褐變指數。

枯梗率：以果梗干枯、干縮或枯黃為評判標準，統計各處理組果實果梗干枯數量，并按式（1）計算枯梗率。

果實硬度：隨機選擇10 個果實，利用FT-327型果實硬度計測定甜櫻桃果實赤道部位硬度，單位為kg/cm2。

1.3.2.2 營養指標

隨機選擇10 個果實，將果肉切成0.5 cm×0.5 cm小塊混合均勻后，稱取10 g，分別采用苯酚-硫酸法[26]、酸堿滴定法[27]、2,6-二氯酚靛酚滴定法[28]、福林-酚法[29]測定可溶性糖含量、可滴定酸質量分數、VC含量和總酚含量；果實花青素含量參照劉仁道等[30]的方法測定。以上結果均以鮮質量計。

1.3.2.3 乙烯釋放速率

參照張立新等[25]的方法進行環境氣體收集和乙烯含量檢測。

1.3.2.4 呼吸強度

固定選擇1 kg經不同預冷方式處理后的甜櫻桃果實，置于體積為3 L（V1）的玻璃樣本瓶中，分別于0 ℃貯藏0、5、10、15、20、25 d和30 d，使用F-920便攜式氧氣和二氧化碳分析儀測定瓶內CO2體積分數；使用浸水法測定1 kg甜櫻桃果實體積，記錄為V2/L。按照式（2）計算呼吸速率。

式中：φ（CO2）為CO2體積分數/%；m為樣品鮮質量/kg；t為密閉時間/h。

1.3.3 甜櫻桃抗病相關酶活力測定

1.3.3.1 樣品前處理

隨機選取甜櫻桃果實5 個，冰浴下將果肉切成0.5 cm×0.5 cm小塊混合均勻后，稱取10 g置于玻璃研缽，加入0.1 g聚乙烯吡咯烷酮K30和10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8），冰浴研磨，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液用于各種酶活力測定，重復3 次。

1.3.3.2 酶活力測定

按照試劑盒說明書測定各處理組SOD、POD、CAT、PPO、脂氧合酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酰輔酶A連接酶、肉桂醇脫氫酶活力。以上結果中，SOD、POD、CAT、PPO活力以鮮質量計，其他酶活力以蛋白質量計。

1.3.4 甜櫻桃新橙皮苷含量測定

1.3.4.1 標準曲線繪制

精密稱取10 mg新橙皮苷標準品，先用10 mL甲醇溶解，再用甲醇分別稀釋成質量濃度為400、300、200、100、50 μg/mL和10 μg/mL的新橙皮苷標準溶液。

1.3.4.2 HPLC檢測條件

以甲醇和水為流動相，以C18反相柱（Accucore C18，80 ?，150 mm×2.1 mm，2.6 μm）為固定相，于285 nm波長處對各標準品溶液進行線性洗脫檢測，并利用新橙皮苷質量濃度和峰面積繪制標準曲線（圖1A）。洗脫程序：甲醇20%～50%（磷酸調節至pH 3），線性洗脫20 min；甲醇洗脫20 min。通過HPLC檢測可知該條件下新橙皮苷出峰時間為27.94 min（圖1B）；貯藏30 d樣品的新橙皮苷提取液經同樣條件檢測后在28.69 min處有明顯吸收峰，與標準品出峰時間接近，且峰型與標準品相似（圖1C），說明甜櫻桃中存在新橙皮苷，且檢測條件可滿足實驗要求。

圖1 新橙皮苷質量濃度與峰面積線性關系（A）、新橙皮苷標準品（B）和樣品（C）吸收曲線Fig.1 Linear relationship between neohesperidin content and peak area (A), and HPLC chromatograms of neohesperidin standard (B)and sample (C)

1.3.4.3 甜櫻桃新橙皮苷的提取

稱取甜櫻桃果實10 g于250 mL藍蓋試劑瓶中，加入甲醇150 mL，記錄其質量；于55 ℃超聲提取40 min，并在提取結束后使用甲醇補充至初始質量，濾紙過濾收集上清液；上清液經旋轉濃縮至近干，以甲醇定容至25 mL，即為新橙皮苷提取液。

1.3.4.4 甜櫻桃新橙皮苷含量測定

取新橙皮苷提取液100 μL，參照標準品檢測方法對各處理組樣品中的新橙皮苷含量進行檢測，并依據繪制的標準曲線按式（3）計算樣品中新橙皮苷含量，結果以鮮質量計。

式中：ρ為依據標準曲線計算出的新橙皮苷質量濃度/（μg/mL）；V為定容體積/mL；m為樣品質量/g；1 000為換算系數。

1.3.5 預冷方式對甜櫻桃新橙皮苷合成通路相關基因表達的影響

1.3.5.1 基因篩選與引物設計

依據黃酮類生物合成途徑（map00941）中的新橙皮苷合成通路，選擇新橙皮苷合成關鍵酶和前體物質調控基因，并通過Primer Express3.0.1軟件設計qPCR引物（表1），用于后續分析。

1.3.5.2 樣品RNA提取及反轉錄

選擇‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏期間新橙皮苷含量存在明顯差異的貯藏時間點采集甜櫻桃樣品，并用TRIzol按照說明書對不同處理組‘紅瑪瑙’甜櫻桃的RNA進行提取，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄獲得cDNA，于－20 ℃保存用于后續實驗。

1.3.5.3 qPCR反應體系與擴增程序

參照熒光定量試劑盒說明書配制20 μL反應體系；擴增程序為：95 ℃ 30s；95 ℃ 5s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，循環40 次；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 1 s。內參基因為CYP2[31]。

1.3.6 預冷方式影響甜櫻桃新橙皮苷合成的關鍵調控基因篩選

利用邁維代謝云平臺（https://cloud.metware.cn）對‘紅瑪瑙’甜櫻桃新橙皮苷含量與相關基因表達量進行共表達網絡分析，進而篩選出與‘紅瑪瑙’甜櫻桃新橙皮苷代謝密切相關的關鍵調控基因。

1.4 數據處理與分析

所有數據利用SPSS 17.0軟件采用Duncan法進行組間差異顯著性分析，采用Sigmaplot 10.0軟件繪制折線圖，采用Origin 2018軟件繪制柱形圖，采用TBtools軟件繪制熱圖，所有實驗數據重復3 次，圖中以實驗數據的平均值±標準差表示。不同指標互作相關性分析通過邁維代謝云平臺（https://cloud.metware.cn）完成；預冷方式與不同指標之間的互作關系采用Canoco 5.0軟件和SPSS 17.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 預冷方式對甜櫻桃采后貯藏感官品質的影響

感官品質不僅與甜櫻桃商品價值密切相關，而且是判斷其貯藏保鮮效果及耐貯性的重要依據。對經不同方式預冷、0 ℃商業貯藏條件下的‘紅瑪瑙’甜櫻桃感官品質進行分析發現：不同預冷方式對甜櫻桃貯藏期間感官品質變化的影響存在一定差異，且其差異隨貯藏時間延長而增大。同商業預冷方式（冷庫風冷）相比，壓差預冷在維持果實硬度和降低病情指數、果肉褐變指數和枯梗率方面效果顯著（圖2）；臭氧冰水預冷雖可有效降低甜櫻桃貯藏期間病情指數和果肉褐變指數，但貯藏15 d后果實硬度明顯降低（圖2A～C）；冰水預冷處理的甜櫻桃貯藏期間病情指數最高，硬度在貯藏10 d后明顯降低，但褐變指數和枯梗率與冷庫風冷處理差異不顯著（圖2）。

圖2 不同預冷方式對‘紅瑪瑙’甜櫻桃采后貯藏感官品質的影響Fig.2 Effects of different precooling methods on sensory quality of‘Red Agate’ sweet cherries during postharvest storage

2.2 預冷方式對甜櫻桃采后貯藏營養品質的影響

由圖3可知，‘紅瑪瑙’甜櫻桃經不同預冷方式處理后，貯藏期間VC含量、總酚含量和可滴定酸質量分數均呈現逐漸下降趨勢，但可溶性糖和花青素含量卻呈現逐漸增加趨勢。甜櫻桃經不同預冷方式處理后，VC含量均在貯藏5 d后開始出現明顯下降，且同冷庫風冷處理組相比，冰水預冷處理組下降程度更大，而差壓預冷和臭氧冰水預冷處理對VC的保護效果優于冷庫風冷處理；總酚含量和可滴定酸質量分數均在貯藏15 d后出現明顯下降，且以冰水預冷和臭氧冰水預冷處理組下降程度更大；可溶性糖和花青素含量均在貯藏20 d時出現明顯增加，但可溶性糖含量以壓差預冷處理組增加較為明顯，而花青素含量以冰水預冷處理組增加較為明顯。貯藏30 d后，商業預冷（冷庫風冷）處理組除VC和可溶性糖含量顯著低于壓差預冷處理組外，其余品質指標均與壓差預冷處理組差異不顯著；冰水預冷和臭氧冰水預冷處理組的花青素含量高于冷庫風冷處理組，但可溶性糖含量顯著低于冷庫風冷處理組。

圖3 不同預冷方式對‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏期間營養品質影響熱圖Fig.3 Heatmap showing the effects of different precooling methods on the nutritional quality of ‘Red Agate’ sweet cherries during storage

2.3 預冷方式對甜櫻桃采后貯藏呼吸強度和乙烯釋放速率的影響

如圖4所示，同冷庫風冷處理組相比，壓差預冷處理可有效降低甜櫻桃貯藏期間的呼吸速率和乙烯釋放速率；冰水預冷處理則顯著提高了甜櫻桃貯藏期間的呼吸速率，且未起到降低乙烯釋放速率的目的；臭氧冰水預冷處理組的甜櫻桃貯藏期間呼吸速率和乙烯釋放速率與冷庫風冷組處理組相比差異不顯著。

圖4 不同預冷方式對‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏期間呼吸速率（A）和乙烯釋放速率（B）的影響Fig.4 Effects of different precooling methods on respiration rate (A) and ethylene release rate (B) during storage of ‘Red Agate’ sweet cherries

2.4 預冷方式對甜櫻桃采后貯藏抗病相關酶活力的影響

如圖5所示，甜櫻桃經不同預冷方式處理后，0 ℃貯藏期間POD、SOD、CAT、肉桂酸-4-羥化酶和肉桂醇脫氫酶活力均呈現先升高后下降趨勢，但不同處理組不同酶活力最高時的貯藏時間點存在一定差異。貯藏期間各處理組PPO活力均以貯藏5 d和15 d時較高；4-香豆酰輔酶A連接酶活力均呈現逐漸下降趨勢；脂氧合酶活力在貯藏5～10 d期間下降（除壓差預冷處理組），其他貯藏時間均呈現上升趨勢。同冷庫風冷處理組相比，壓差預冷處理的甜櫻桃貯藏期間POD、SOD、CAT、肉桂醇脫氫酶、肉桂酸-4-羥化酶活力均顯著升高，但脂氧合酶和PPO活力卻較低，且4-香豆酰輔酶A連接酶活力同冷庫風冷處理組相比差異不顯著；臭氧冰水預冷和冰水預冷可有效提高甜櫻桃貯藏期間SOD、POD、CAT和肉桂醇脫氫酶活力，但會降低PPO、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酰輔酶A連接酶活力。

圖5 不同預冷方式對‘紅瑪瑙’甜櫻桃采后貯藏期間抗病相關酶活力的影響Fig.5 Effects of different precooling methods on the activities of enzymes related to disease resistance during postharvest storage of‘Red Agate’ sweet cherries

2.5 預冷方式影響甜櫻桃耐貯性的關鍵評價指標篩選分析

通過對不同指標之間互作關系、預冷方式與不同指標之間互作關系的分析可以發現，甜櫻桃貯藏期間耐貯性關鍵直觀評價指標（病情指數、枯梗率和褐變指數）與花青素含量、呼吸強度、乙烯釋放速率、PPO和脂氧合酶活力存在正相關關系，但與VC含量，POD、SOD、CAT、肉桂酸-4-羥化酶、肉桂醇脫氫酶和4-香豆酰輔酶A連接酶活力存在負相關關系（圖6）；甜櫻桃果實硬度與花青素含量、呼吸強度、乙烯釋放速率、PPO和脂氧合酶活力存在負相關關系。此外，苯丙烷代謝途徑抗病相關酶（肉桂酸-4-羥化酶、肉桂醇脫氫酶和4-香豆酰輔酶A連接酶）活力與花青素合成、PPO和脂氧合酶活力之間存在競爭關系，但與POD、SOD、CAT活力之間存在一定正相關關系，說明提高POD、SOD、CAT、肉桂酸-4-羥化酶、肉桂醇脫氫酶、4-香豆酰輔酶A連接酶活力和降低PPO及脂氧合酶活力、呼吸強度、乙烯釋放速率及抑制花青素合成可有效提高‘紅瑪瑙’甜櫻桃耐貯性，且苯丙烷代謝途徑抗病相關酶活力、VC含量、SOD活力、PPO活力和脂氧合酶活力可作為評價甜櫻桃耐貯性的關鍵評價指標。

圖6 不同預冷方式下‘紅瑪瑙’甜櫻桃不同指標之間的相關性Fig.6 Correlation analysis between indicators of ‘Red Agate’ sweet cherries subjected to different precooling treatments

如圖7和表2所示，壓差預冷處理與硬度、可滴定酸質量分數、肉桂醇脫氫酶活力、肉桂酸-4-羥化酶活力、4-香豆酰輔酶A連接酶活力、SOD活力、POD活力、CAT活力和總酚含量之間夾角為銳角，呈現顯著正相關關系（P＜0.05），且與肉桂醇脫氫酶活力之間夾角最小，但與PPO活力和褐變指數之間呈現顯著負相關關系；冷庫風冷處理與POD、SOD、CAT和肉桂醇脫氫酶活力之間夾角為鈍角，呈現顯著負相關關系（P＜0.05），與PPO活力、花青素含量、乙烯釋放速率和呼吸強度等之間夾角為銳角，呈現正相關關系，但相關性不顯著（P＞0.05）；冰水預冷處理與病情指數、花青素含量、PPO活力之間夾角為銳角，呈現顯著正相關關系（P＜0.05），但與硬度、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酰輔酶A連接酶、肉桂醇脫氫酶活力之間夾角為鈍角，呈現顯著負相關關系（P＜0.05）；臭氧冰水預冷處理與肉桂酸-4-羥化酶活力之間夾角為鈍角，呈現顯著負相關關系（P＜0.05），但與PPO活力之間夾角為銳角，呈現顯著正相關關系（P＜0.05）。說明壓差預冷可有效提高‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏期間肉桂醇脫氫酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酰輔酶A連接酶、SOD、POD和CAT活力，進而提高甜櫻桃耐貯性。

表2 不同預冷方式與不同指標之間的Pearson相關性分析Table 2 Pearson correlation analysis between precooling methods and fruit indicators

圖7 不同預冷方式和‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏期間不同指標之間的互作關系Fig.7 Interactions between different precooling methods and indexes during storage of ‘Red Agate’ sweet cherries

2.6 預冷方式對甜櫻桃采后貯藏新橙皮苷含量變化的影響

如圖8所示，在甜櫻桃貯藏期間，壓差預冷和冰水預冷處理組的新橙皮苷含量呈現先升高后降低現象，且均在貯藏至第10天時含量最高，但臭氧冰水預冷和冷庫風冷處理組的新橙皮苷含量分別呈現先降低后升高再降低和先升高后降低再升高再降低的現象。另外，同冷庫風冷處理組相比，壓差預冷和冰水預冷處理有效提高了甜櫻桃貯藏期間新橙皮苷含量，且這2 種方式的作用效果差異不顯著，但臭氧冰水預冷處理則降低了甜櫻桃貯藏期間新橙皮苷含量，說明壓差預冷和冰水預冷處理能夠維持甜櫻桃新橙皮苷含量并延緩其分解代謝，但臭氧冰水預冷和冷庫風冷處理會顯著促進甜櫻桃新橙皮苷的分解代謝。

圖8 不同預冷方式對‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏間新橙皮苷含量變化的影響Fig.8 Effects of different precooling methods on changes of neohesperidin content in ‘Red Agate’ sweet cherries during storage

2.7 預冷方式對甜櫻桃新橙皮苷合成通路相關基因表達的影響

依據不同預冷方式處理后‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏期間新橙皮苷含量變化規律，選擇貯藏0、10 d和15 d 3 個含量變化的拐點，以商業預冷方式（冷庫風冷）為對照，采用qPCR法對不同預冷方式對‘紅瑪瑙’甜櫻桃新橙皮苷合成相關基因表達特性的影響進行分析，發現壓差預冷處理組基因LOC110760277、LOC110763545-1、LOC110751411、LOC110757814、LOC110759087、QXJJ01001021、LOC110745765和LOC110756675表達量在0～15 d內呈現明顯先升高后下降趨勢，但基因LOC110758277和LOC110771557表達量呈現先下降后升高趨勢；冰水處理組基因LOC110763545-1、LOC110751411和LOC110757814表達量呈現先升高后下降趨勢，但基因LOC110760277表達量逐漸下調，基因LOC110760269、QXJJ01001021、LOC110745765表達量逐漸上調，基因LOC110758277和LOC110771557表達量變化規律與壓差預冷處理組相似；臭氧冰水預冷處理組基因LOC110760277、LOC110760269、LOC110763545-1、LOC110763545-2、LOC110757814、QXJJ01001021、LOC110745765、LOC110756675、LOC110758277和LOC110771557表達量均呈現先升高后下降趨勢（圖9）。

圖9 不同預冷方式對‘紅瑪瑙’甜櫻桃新橙皮苷合成相關基因表達的影響Fig.9 Effects of different precooling methods on the expression of genes related to neohesperidin synthesis in ‘Red Agate’ sweet cherries

2.8 預冷方式調控甜櫻桃新橙皮苷合成的關鍵相關基因篩選

通過相關性網絡分析對貯藏0～15 d期間甜櫻桃新橙皮苷含量變化及相關基因表達量進行共表達網絡分析，發現在壓差預冷和冰水預冷處理組中，新橙皮苷含量均與基因LOC110763545-2、LOC110758277和LOC110771557表達量呈負相關關系；臭氧冰水預冷處理組中新橙皮苷含量僅與基因LOC110757812表達量呈正相關；冰水預冷處理組中新橙皮苷含量還與基因LOC110757812、LOC110756675和LOC110753331表達量存在負相關關系（圖10）。說明壓差預冷可通過抑制基因LOC110763545-2、LOC110758277和LOC110771557表達，冰水預冷可通過抑制基因LOC110763545-2、LOC110758277、LOC110771557、LOC110757812、LOC110756675和LOC110753331的表達來促進甜櫻桃新橙皮苷的合成。

圖10 不同預冷方式下‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏0～15 d期間新橙皮苷合成與相關基因表達量之間的相關性網絡分析Fig.10 Correlation network analysis between the synthesis of neohesperidin and the expression of related genes in ‘Red Agate’ sweet cherries subjected to three different precooling methods versus cold storage treatment during the storage period of up to 15 days

3 討 論

果蔬采后貯藏前均需經過預冷處理，且已有研究證實預冷方式對火龍果[32]、長棗[10]、甜玉米[11]和紅毛丹[33]等的貯藏品質具有一定影響，但有關預冷方式對甜櫻桃采后耐貯性的影響還不清楚。本研究發現不同預冷方式對甜櫻桃耐貯性的影響存在一定差異，且同冷庫風冷處理相比，壓差預冷處理效果更好，這可能與壓差預冷時間短，延緩了甜櫻桃預冷期間的衰老進程、提高了抗病相關酶活性、降低了其呼吸代謝強度有關；冰水預冷處理雖然預冷時間同樣較短，但同冷庫風冷處理相比耐貯性較差，這可能與PPO、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酰輔酶A連接酶活力較低，呼吸強度、乙烯釋放速率較高，營養物質消耗過快，及冰水處理易滋生微生物，從而加重貯藏后期腐爛關系密切。相關研究結果與鄧浩等[33]（壓差預冷后的紅毛丹貯藏品質最好，冷庫預冷效果次之，冰水預冷效果不明顯）、張怡等[34]（冰水預冷降溫最快，但瀝干殘留水分時會加速藍莓微生物的繁殖，就貯藏保鮮效果而言，強制通風預冷較冷庫預冷可以更快速地降低田間熱，有效降低藍莓爛果率、失水率、POD活性和丙二醛含量，減緩可滴定酸含量和硬度的降低）和胡花麗等[35]（風預冷可抑制李果實的呼吸速率升高，冰水預冷果實的腐爛癥狀明顯較風預冷嚴重，因此推薦風預冷方式為較好的李果實預冷方式）的結論相似，但與崔建潮等[36]（冰水預冷甜櫻桃貨架期保鮮效果優于壓差預冷）的研究結果相反，造成這種差異的原因與保鮮溫度不同關系密切。另外，本研究中甜櫻桃貯藏15 d后病情指數和褐變指數均顯著高于其他研究[1,16,25,36]，這可能與本研究采用的甜櫻桃成熟度較高和貯藏期間樣品量較多有關。

‘紅瑪瑙’甜櫻桃采后耐貯性相關評價指標測定結果表明，不同預冷方式中，壓差預冷能更好地提升‘紅瑪瑙’甜櫻桃的耐貯性，這與壓差預冷可有效提高‘紅瑪瑙’甜櫻桃貯藏期間POD、SOD、CAT、肉桂酸-4-羥化酶、肉桂醇脫氫酶和4-香豆酰輔酶A連接酶活力，降低呼吸強度，從而使甜櫻桃維持較好的營養品質有關。本研究結果與李燕等[10]（壓差預冷能夠使長棗維持更高的貯藏品質，抑制其細胞膜脂質過氧化，維持較高的抗氧化酶活性，抵御氧化脅迫，抑制褐變）、焦旋等[24]（與冷庫預冷相比，壓差預冷抑制了油桃貯藏期間呼吸強度和乙烯釋放速率的增加，推遲了呼吸高峰出現的時間，保持了其較高的硬度和營養品質，提升了其耐貯性）、鄧浩等[33]（壓差預冷是較優的紅毛丹預冷方式，且可提高紅毛丹貯藏期間好果率，但抑制了果皮苯丙氨酸解氨酶和POD活性）和時文林等[11]（流態冰預冷處理對甜玉米的呼吸強度抑制效果和營養品質保護效果明顯優于壓差預冷）存在一定差異，造成這些差異的原因與壓差預冷技術應用對象的差異密切相關，說明不同果蔬適宜的預冷方式存在一定差異。目前生產上果蔬普遍采用冷庫風冷處理，且多數果蔬的較優預冷方式尚不明確，在一定程度上導致果蔬貯藏品質較差和貯藏壽命縮短，不利于產業健康發展。另外，這些研究結果還進一步證實壓差預冷對果蔬貯藏期間的呼吸強度、營養品質和酶活性具有顯著影響，但不同果蔬對壓差預冷響應強度存在差異，因此篩選不同果蔬適宜的預冷方式、建立預冷標準化技術規程對提升果蔬耐貯性和降低采后損失具有重要意義。

預冷方式影響甜櫻桃耐貯性的關鍵評價指標篩選對其后期貯藏壽命終點判斷和貯藏特性靶向監測具有重要意義。苯丙烷代謝途徑關鍵酶（肉桂醇脫氫酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酰輔酶A連接酶）可通過促進木質素和酚類物質等抗病物質的合成來提高果蔬抗病性[37]，但目前有關貯藏期間該途徑關鍵酶與甜櫻桃耐貯性之間的互作關系還不清楚。本研究通過指標間互作分析發現，甜櫻桃感官品質指標與苯丙烷代謝途徑關鍵酶（肉桂酸-4-羥化酶、肉桂醇脫氫酶和4-香豆酰輔酶A連接酶）活力存在顯著相關性（P＜0.05），但營養品質除VC含量外其余指標均未表現出顯著相關性（P＞0.05）；SOD、PPO和脂氧合酶活力亦分別與褐變指數、病情指數、硬度表現出顯著相關性（P＜0.05），說明VC含量和苯丙烷代謝途徑關鍵酶、SOD、PPO、脂氧合酶活力可作為評價甜櫻桃耐貯性的關鍵指標。相關研究成果與梁惜雯等[38]（較高的抗氧化酶活性可減緩櫻桃衰老，延長果實的貨架期）、劉靜珂[39]（甜櫻桃貯藏期間較高的硬度、可溶性固形物含量、PPO、POD活性和較低的呼吸強度可提高其耐貯性）、周慧等[40]（降低PPO、POD活性，提高CAT、SOD活性，可以較好地保持甜櫻桃果實的品質及風味）相似，但不同的是本研究還篩選出了苯丙烷代謝途徑關鍵酶，并通過相關性分析篩選出了耐貯性關鍵評價指標。另外，雖然本研究篩選出了甜櫻桃耐貯性關鍵評價指標，但這些指標如何服務于生產以預測甜櫻桃貯藏壽命還有待進一步研究，如篩選出的耐貯性評價指標與品種之間的適配性；建立耐貯性評價指標數值與貯藏時間之間的動力學數量關系；耐貯性評價指標預測貯藏壽命結果的實踐驗證等。

黃酮生物合成途徑（mp00941）是新橙皮苷合成代謝的核心途徑，本研究發現壓差預冷和冰水預冷處理均可通過抑制該途徑基因LOC110763545-2、LOC110758277和LOC110771557的表達來促進甜櫻桃新橙皮苷的合成；壓差預冷處理后EC 2.4.1.236相關基因（LOC110760277、LOC110751411）、UDP-鼠李糖合成相關基因（LOC110757814）、EC 2.4.1.185相關基因（QXJJ01001021）和柚皮素合成相關基因（LOC110745765、LOC110756675）表達量與新橙皮苷含量的變化規律一致，說明壓差預冷可通過提高上述基因表達量來促進新橙皮苷合成，但甜櫻桃新橙皮苷合成相關基因（LOC110760277、LOC110751411、QXJJ01001021）還未在甜櫻桃基因組中得到有效注釋，后期還需通過轉錄組學、反向遺傳學手段進一步進行基因表達特性的研究及功能驗證。

綜上所述，適宜的預冷方式可有效提高‘紅瑪瑙’甜櫻桃耐貯性，促進新橙皮苷合成，提升其營養價值。相較于商業預冷方式（冷庫風冷），壓差預冷處理可有效激活‘紅瑪瑙’甜櫻桃果實中的POD、SOD、CAT、肉桂酸-4-羥化酶、肉桂醇脫氫酶和4-香豆酰輔酶A連接酶，并保持較高的果肉硬度。VC含量和苯丙烷代謝途徑關鍵酶、SOD、PPO、脂氧合酶活力與預冷方式及甜櫻桃感官品質呈現顯著相關性，可作為甜櫻桃耐貯性關鍵評價指標。此外，貯藏期間甜櫻桃新橙皮苷含量呈現波動下降趨勢，但同冷庫風冷處理組相比，壓差預冷處理可促進甜櫻桃新橙皮苷合成通路中EC 2.4.1.236（LOC110760277、LOC110751411）、EC 2.4.1.185高度相似基因（QXJJ01001021）、UDP-鼠李糖（LOC110757814）、柚皮素（LOC110745765、LOC110756675）相關調控基因表達，抑制香橙素（LOC110758277）和Apiforol（LOC110771557）相關調控基因表達，從而使甜櫻桃新橙皮苷含量保持在較高的水平。