基于AMPK/SREBP-1c分子通路的山楂原花青素調控脂質代謝機制

宓 偉，于 敏，李 寧，石塔拉，陳彩云,*

（1.濱州醫學院公共衛生與管理學院，山東 煙臺 264003；2.濱州醫學院藥學院，山東 煙臺 264003）

血脂異常俗稱高脂血癥，是一種以血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平升高，或伴有高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平降低的代謝性疾病，是誘發心腦血管疾病的主要因素[1]。2020年中國居民營養與慢性病狀況報告指出，我國成年人血脂異常的總患病率為40.40%，其中低密度脂蛋白血癥患病率最高，為33.90%，這將導致2010—2030年間我國心血管疾病患者增加約920萬 人[2]。他汀類、貝特類、煙酸類藥物等是治療高脂血癥療效確切的西藥，但肝功能異常、橫紋肌溶解癥等副作用較多[3-5]。山楂原花青素（hawthorn procyanidins，HPC）是由表兒茶素和兒茶素縮合而成的一種來源于山楂的低聚體多酚化合物，山楂鮮果中原花青素的含量高達4 mg/g，其抗氧化活性遠高于來源于葡萄籽、松樹皮等的高聚體原花青素，HPC可用乙醇溶劑萃取法、大孔吸附樹脂層析法等提取和純化，已被充分開發應用于食品、藥品和化妝品工業[6]。本課題組前期研究表明，HPC具有良好的抗腫瘤[7]、抗氧化[8]等生物活性，經體內外質量評價已明確其有效的藥效濃度范圍。

作為脂質代謝的調控中樞，經活化的AMP激活蛋白激酶（AMP-activiated protein kinase，AMPK）直接磷酸化固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c），促使甘油-3-磷酸酰基轉移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）磷酸化失活，使其下游的乙酰輔酶羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthese，FAS）表達量降低，肉毒堿棕櫚酰基轉移酶（carnitine palmitoyltransterase-1，CPT-1）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）活性增強，從而加速脂肪酸氧化分解，抑制脂質合成[9-13]。本研究采用高脂膳食誘導動物模型，以非諾貝特為陽性對照，探討HPC靶向作用于AMPK/SREBP-1c分子信號通路調控脂質代謝的機制，為高脂血癥防治、尋找靶向天然植物藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

S P F 級S D 雄性大鼠6 0 只，8 周齡，體質量240～290 g，購自山東弘立醫學動物實驗研究有限公司，生產許可證號SCKX（魯）2021-0005。在無特定病原的條件下基礎飼料適應性喂養1 周后用于實驗。本研究得到濱州醫學院動物倫理學委員會的批準（202108-005）。

基礎飼料、高脂飼料（MCD002）均由江蘇美迪森生物醫藥有限公司提供，總熱量比為23.0 kJ/g，脂肪、碳水化合物和蛋白質供能比分別為45.7%、35.8%、18.5%。

HPC（聚合度≥99%，批號：20200420） 杭州綠盛生物技術有限公司；非諾貝特膠囊（規格100 mg/粒，批號H44021454） 廣東華南藥業集團有限公司；TG、TC、LDL-C和HDL-C試劑盒（貨號分別為20200201、20200104、20200308、20200509） 南京建成生物工程研究所；高效化學發光（efficient chemiluminescence，ECL）顯色試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、RNA提取試劑盒（貨號分別為36208ES60、20201ES76、19221ES08）翌圣生物科技（上海）股份有限公司；高效RIPA裂解液、蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（貨號分別為R0010、G1120） 北京索萊寶科技有限公司；AMPK抗體、SREBP-1c抗體、GPAT1抗體、ACC抗體、FAS抗體、CPT1抗體和PGC-1α抗體（貨號分別為ab32047、ab133125、ab0059、ab185901、ab133619、ab189181、ab145641） 英國Abcam公司；phospho-AMPK（Thr172）抗體、GAPDH抗體、二抗羊抗兔IgG（貨號分別為AA393、AF006、AS118） 上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

RG2000熒光實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR） 澳大利亞Corbett公司；電泳轉膜儀 美國Bio-Rad公司；Alphalmager HP凝膠成像分析系統 美國Alpha Innotech公司；BX-26熒光顯微鏡日本Olympus公司；Varioskan LUX多功能酶標儀美國Thermo Fisher Scientific公司；TDL-40B臺式離心機、DYY-12型凝膠電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組和給藥

采用隨機數字表法將大鼠分為空白對照組（blank control group，BCG），高脂血癥模型組（hyperlipidemia m o d e l g r o u p，H M G），H P C 低、中、高劑量組（HPC-low-, medium- and high-dose groups，HPCLDG、HPC-MDG、HPC-HDG）、非諾貝特陽性對照組（fenofibrate positive group，FPG），每組10 只。非諾貝特膠囊臨用前配制成4 mg/mL藥液。根據本課題組前期研究，稱取適量HPC以無水乙醇溶解，加入0.5%（質量分數，下同）生理鹽水（normal saline，NS）分別配制成質量濃度為14、28、56 μg/mL的低、中、高劑量HPC溶液[14]。

BCG大鼠用基礎飼料（玉米73.5%（質量分數，下同）、麥麩20%、魚粉5%、谷粉1%、食鹽0.5%）喂養，其余各組用高脂飼料（普通飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油10%）喂養。BCG和HMG大鼠以0.5% NS 0.02 g/（kgmb·d）灌胃。根據人體和大鼠體表面積換算，HPC低、中、高劑量組大鼠分別以HPC溶液0.14、0.28、0.56 g/（kgmb·d）灌胃。FPG大鼠以非諾貝特藥液0.04 g/（kgmb·d）灌胃。各給藥組高脂飼料喂養的同時每天上午9∶00—9∶30灌胃給藥1 次，BCG和HMG同時間以0.5% NS灌胃1 次，連續給藥7 周。實驗期間觀察大鼠的一般情況、飲食情況和精神狀態，每周稱量大鼠體質量并記錄。給藥結束后大鼠眼眶取靜脈血分離血清，通過TG、TC、LDL-C和HDL-C水平判斷高脂血癥模型是否制備成功。

1.3.2 肝臟指數、血清及肝臟脂質濃度檢測

實驗結束后，肌肉注射3 mL/kgmb20%氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，用分析天平秤量大鼠體質量，分離肝臟并稱量肝質量，取大鼠部分肝臟，稱質量后按下式計算肝臟指數。然后于大鼠腹主動脈取血，室溫靜置30 min，離心機4 000 r/min離心10 min取上層血清；摘取大鼠肝臟，選擇距肝邊緣0.5 cm處相同部位的肝右葉組織，4 ℃下加入0.5% NS制成肝勻漿，按照試劑盒方法檢測大鼠血清和肝勻漿中TG、TC、LDL-C和HDL-C的濃度。

1.3.3 肝臟組織病理觀察

取部分肝組織，采用體積分數10%的中性甲醛溶液固定標本，常規脫水、石蠟包埋，切片機連續切3 μm切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理學變化。大鼠肝臟組織病理變化由脂肪細胞空泡所占面積與總細胞所占面積之比計算。

1.3.4 大鼠肝臟組織相關指標mRNA相對表達量檢測

取部分肝臟組織，分別裝于不同冷凍管，置于液氮中速凍后于超低溫冰箱冷凍備用。按試劑盒說明書提取肝臟組織總RNA并合成cDNA，并選擇GAPDH作為內參，通過熔解曲線分析產物的特異性。本研究自行設計的AMPK、SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS、CPT-1和PGC-1α引物序列見表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.5 大鼠肝臟相關指標蛋白相對表達量檢測（Western blot法）

取各組大鼠肝組織，用BCA法檢測RIPA裂解液提取的蛋白濃度。在提取蛋白液中加入6%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）緩沖液，沸水變性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）后濕移至聚偏二氟乙烯膜上，37 ℃封閉2 h，依次加入AMPK、p-AMPK、SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS、CPT1和PGC-1α 4 ℃過夜，漂洗后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫反應2 h，滴加ECL試劑進行檢測，并選擇GAPDH作為內參，采用Quantity One軟件掃描各條帶，獲取目的蛋白灰度值。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 23.0軟件進行數據的統計分析，用±s表示；攝食量的變化采用重復測量方差分析；兩組間比較采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析，有統計學意義的再采用兩兩比較的q檢驗，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 HPC對高脂血癥大鼠脂質代謝的影響

2.1.1 各組大鼠的一般情況

實驗中大鼠無死亡，BCG大鼠皮膚光潔，一般狀況和精神狀態良好。HMG大鼠毛色暗淡，不愛動，飲食飲水量增加，大便小便增多，體質量明顯增加。HPCMDG、HPC-HDG和FPG大鼠一般情況和精神狀態均有所改善，HPC-HDG的效果接近FPG。

如圖1所示，BCG大鼠攝食量總體趨于平穩，與BCG比較，HMG大鼠攝食量極顯著增高（P＜0.01）；與HMG比較，HPC各劑量組和FPG大鼠攝食量有所下降，且HPC-HDG和FPG大鼠攝食量極顯著下降（P＜0.01），表明高劑量HPC能有效改善高脂血癥大鼠的攝食量。

圖1 各組大鼠攝食量的變化（n＝10）Fig.1 Changes in food intake of rats from all groups (n = 10)

2.1.2 各組大鼠的體質量、肝質量和肝指數變化

如表2所示，造模7 周后，與BCG比較，HMG大鼠體質量、肝質量和肝臟指數均顯著升高（P＜0.05）。與HMG比較，HPC-MDG、HPC-HDG和FPG大鼠體質量、肝質量和肝臟指數均有不同程度降低（P＜0.05）。說明HPC能夠降低高脂血癥大鼠的體質量、肝質量和肝臟指數，高劑量HPC效果更明顯。

表2 各組大鼠體質量、肝質量和肝臟指數的比較（n＝10）Table 2 Comparison of body mass, liver mass and liver index of rats from all groups (n = 10)

2.1.3 各組大鼠血清脂質濃度的變化

如表3所示，與BCG比較，HMG大鼠血清TG、TC和LDL-C濃度均極顯著升高，HDL-C濃度極顯著下降（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠血清TG、TC和LDL-C濃度極顯著下降，HDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），且HPC對大鼠血清中脂質濃度的影響有一定的劑量依賴性，說明HPC能降低高脂血癥大鼠血清中的TG、TC、和LDL-C濃度，提高HDL-C濃度，使其各項異常指標恢復正常，改善大鼠血脂紊亂。

表3 各組大鼠血清脂質濃度的比較Table 3 Comparison of serum lipid contents of rats from all groups

2.1.4 各組大鼠肝臟勻漿脂質濃度的變化

如表4所示，與BCG比較，HMG大鼠肝臟TG、TC和LDL-C濃度均極顯著升高，HDL-C濃度極顯著下降（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠肝臟TG、TC和LDL-C濃度極顯著下降，HDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），且HPC對大鼠肝臟中脂質濃度的影響有一定的劑量依賴性，表明HPC能改善大鼠肝勻漿中異常的脂質水平，且高劑量HPC效果更明顯。

表4 各組大鼠肝臟脂質濃度的比較Table 4 Comparison of liver lipid contents of rats from all groups

2.2 各組大鼠肝臟病理學組織變化觀察

如圖2所示，BCG大鼠肝組織結構完整，肝小葉結構無異常。HMG大鼠肝臟出現重度彌漫性肝組織變性，肝小葉結構紊亂，肝細胞體積增大，胞漿疏松，出現數量、大小不一的脂肪空泡，有一定的脂肪堆積。與HMG大鼠相比，HPC各劑量組預防性干預后，隨HPC劑量增加大鼠肝細胞脂肪變性逐漸改善。FPG大鼠肝細胞脂肪變性基本恢復正常，高劑量HPC與非諾貝特干預效果接近。

圖2 各組大鼠肝臟病理組織變化Fig.2 Histopathological examination of liver tissues of rats from all groups

2.3 各組大鼠肝臟AMPK mRNA和p-AMPK蛋白的相對表達量

如圖3所示，與BCG相比，HMG大鼠肝臟AMPKm R N A 和p-A M P K 蛋白相對表達量均極顯著下降（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-MDG、HPC-HDG和FPG大鼠肝臟AMPKmRNA和p-AMPK蛋白相對表達量均極顯著上升（P＜0.01），高劑量HPC與非諾貝特效果相當，表明HPC能使AMPK轉錄增加，并使AMPK發生磷酸化。

圖3 各組大鼠肝臟AMPK mRNA和p-AMPK蛋白的相對表達量Fig.3 Relative expression of AMPK mRNA and relative expression of p-AMPK protein in liver tissues of rats from all groups

2.4 各組大鼠肝臟SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對表達量

如圖4所示，與BCG相比，HMG大鼠肝臟SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對表達量均極顯著升高（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠肝臟SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對表達量均極顯著下降（P＜0.01），HPC-HDG效果與FPG相當。結果表明經HPC作用活化的AMPK進一步通過分子通路使參與脂肪分解代謝的負調控因子SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS的轉錄和翻譯水平降低，促進脂肪氧化分解代謝，抑制脂質合成。

圖4 各組大鼠肝臟SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對表達量Fig.4 Relative expression of SREBP-1c, GPAT1, ACC and FAS mRNA and protein in liver tissues of rats from all groups

2.5 各組大鼠肝臟CPT1、PGC-1α mRNA和蛋白相對表達量

如圖5所示，與BCG相比，HMG大鼠肝臟CPT1、P G C-1 α m R N A 和蛋白相對表達量均極顯著降低（P＜0.01）。與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠肝臟CPT1、PGC-1α mRNA和蛋白相對表達量均極顯著升高（P＜0.01），高劑量HPC和非諾貝特效果相當。結果表明經HPC活化的AMPK能促進脂質分解代謝正調控因子CPT1、PGC-1α的轉錄和翻譯，加速脂肪氧化分解，且具有劑量依賴性。

3 討 論

血脂異常是動脈粥樣硬化性心臟病發病的危險因素[15]。在我國血脂異常的人群中，進行降脂治療患者的僅占14.1%，其中能達到《2021 ESC心血管疾病預防指南》要求有效控制血脂的比例為26.6%[16]。臨床實踐中，使用他汀類、貝特類等降脂藥存在不耐受情況，并會加重肝臟負擔，因此尋找并研發作用于AMPK多靶點的天然植物藥是目前研究的熱點之一。

本研究采用高脂飼料喂養大鼠建立高脂血癥動物模型，實驗結束后，HMG大鼠攝食量、體質量、肝質量和肝臟指數均顯著或極顯著高于BCG大鼠（P＜0.05、P＜0.01），HMG大鼠血脂各項指標均出現異常，造模結果與Li Hui等[17]研究結果一致；與HMG大鼠比較，HPC-HDG大鼠體質量、肝質量和肝臟指數均有不同程度的下降（P＜0.05），大鼠血清和肝臟勻漿的TG、TC、LDL-C濃度極顯著下降，而HDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），說明高劑量HPC可以明顯改善高脂血癥大鼠血脂代謝紊亂。肝臟病理學組織HE染色結果顯示，與BCG大鼠比較，HMG大鼠肝臟出現重度彌漫性肝組織變性，與HMG大鼠相比，HPC-HDG大鼠肝細胞脂肪變性基本恢復正常。

在脂質代謝過程中，AMPK對多種代謝酶及轉錄因子起關鍵調控作用。AMPK廣泛存在于真核細胞中，是由α-、β-和γ-亞基構成異源三聚體的一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[18-21]。激活的AMPK轉變成p-AMPK，直接磷酸化SREBP-1c的Ser372的識別位點使其轉錄能力下降，抑制下游FAS和TC合成酶的表達，減少脂質合成[22-24]。GPAT1是催化TG合成的一種關鍵限速酶，AMPK能促進線粒體外膜上的GPAT1磷酸化，降低其生物活性，導致脂肪酸氧化增加，減少脂質在肝細胞內的累積[25-27]。ACC有ACC1和ACC2兩種異構體，由于活化的AMPK可以使其磷酸化而失活，而失活的ACC1可抑制脂肪酸的從頭合成途徑，失活的ACC2可以提高CPT1的活性而促進線粒體中脂肪酸的β-氧化分解[28-29]。

本研究結果顯示，與HMG比較，HPC-HDG和FPG大鼠肝臟AMPKmRNA和p-AMPK蛋白相對表達量均極顯著上升（P＜0.01），SREBP-1c、GPAT1、ACC、FAS mRNA和蛋白相對表達量均極顯著下降（P＜0.01），CPT1、PGC-1α mRNA和蛋白相對表達量均極顯著升高（P＜0.01）。結果表明HPC可抑制SREBP-1c基因的轉錄和蛋白表達，從而抑制下游脂肪酸和膽固醇合成酶的表達，減少脂質合成；同時，通過下調GPAT1表達以降低GPAT1活性，減少肝細胞內脂質的積累。p-AMPK磷酸化ACC和FAS使兩者失活，而失活的ACC和FAS可阻止乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）羧化成丙二酰CoA，同時活化CPT1和PGC-1α，促進脂肪酸β-氧化，抑制脂質合成，減少肝臟脂質生成，從而達到改善脂質代謝紊亂的效果，與Zhang Zhiqin等[30]研究結果相符。

綜上所述，HPC能有效干預大鼠高脂血癥，并能在一定程度上逆轉脂質代謝紊亂的發展，其作用機制可能與通過AMPK/SREBP-1c信號通路調控脂質代謝、改善線粒體功能，從而減輕肝臟損傷密切相關。