大豆主要致敏蛋白及其檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

邢玉飛，布冠好*，陳復(fù)生，常永鋒，王美月

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)及多種人體必需氨基酸，是一種重要的植物性蛋白資源，常被加工成各種食品，如醬油、豆豉和豆?jié){等[1]。同時(shí)，大豆還可以作為保健品及醫(yī)藥制品的原料[2]。然而，大豆在部分國(guó)家是優(yōu)先過(guò)敏原[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大豆過(guò)敏影響了大約0.2%～0.4%的人群[4-5]，其在兒童中的過(guò)敏率高達(dá)13%[6]。隨著植物基食品種類(lèi)及大豆副產(chǎn)品的逐漸增加，大豆過(guò)敏的發(fā)病率也在不斷上升[7]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，引發(fā)大豆過(guò)敏反應(yīng)的閾值水平在0.001 3～500 mg[8]。現(xiàn)階段，食物過(guò)敏是第四大公共衛(wèi)生問(wèn)題[8-9]，而大豆過(guò)敏是一種重要的食物過(guò)敏反應(yīng)。食物過(guò)敏大多是由免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E介導(dǎo)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，當(dāng)過(guò)敏性人群二次接觸過(guò)敏原時(shí)，會(huì)刺激人體產(chǎn)生一系列免疫性反應(yīng)，其機(jī)理為過(guò)敏原特異性IgE與肥大細(xì)胞表面上的高親和力IgE受體（receptor I for the Fc fragment of IgE，F(xiàn)cεRI）相交聯(lián)[10]，使細(xì)胞內(nèi)已有的或新合成的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-3、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子釋放，并通過(guò)刺激嗜堿性粒細(xì)胞等其他炎癥細(xì)胞激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。由此引發(fā)皮膚、呼吸道及消化道癥狀，如皮疹、蕁麻疹、哮喘、腹瀉、腹痛等[11]，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致過(guò)敏性休克[12]。

由于食品工業(yè)的高速發(fā)展及食品加工程度的不斷深化，食物中的組分越來(lái)越復(fù)雜，其中微量過(guò)敏原成分的存在使得食物過(guò)敏的發(fā)生率不斷增加。食物過(guò)敏主要發(fā)生在工業(yè)化國(guó)家[13]，多數(shù)工業(yè)化國(guó)家均強(qiáng)制性要求商家將大豆、花生、牛奶、雞蛋等主要食品過(guò)敏原在食品標(biāo)簽中有所顯示[14]。目前，除對(duì)麩質(zhì)的含量進(jìn)行規(guī)范外，大多數(shù)過(guò)敏原的標(biāo)識(shí)僅存在于定性階段，即標(biāo)明了“含有”或者“可能含有”[15]。當(dāng)前，由于缺少對(duì)食品過(guò)敏的有效治療手段，所以敏感人群要嚴(yán)格避免攝入含有一種或多種過(guò)敏原的食物。然而，大豆及其副產(chǎn)品廣泛添加于許多素食和肉類(lèi)食品中，通過(guò)飲食避免食物過(guò)敏變得較為困難。因此，對(duì)于大豆致敏蛋白特性的深入了解及研究快速、精確和標(biāo)準(zhǔn)化的過(guò)敏原檢測(cè)方法具有重要的實(shí)際意義。

1 大豆主要致敏蛋白及結(jié)構(gòu)特性

根據(jù)超速離心分類(lèi)法，大豆蛋白可分為4 種主要蛋白質(zhì)，分別為2S、7S、11S及15S球蛋白組分[15]。大豆中已有38 種過(guò)敏原被識(shí)別[16-18]，根據(jù)致敏蛋白的組分含量及其致敏能力的差異，β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K被列為主要致敏成分[19]。

1.1 β-伴大豆球蛋白

β-伴大豆球蛋白屬于貯藏蛋白，其含量約占大豆總蛋白的30%[20]，分子質(zhì)量約為210 ku，屬于7S球蛋白。由α’（～71 ku）、α（～67 ku）和β（～50 ku）3 種亞基通過(guò)疏水相互作用及靜電相互作用連接形成三聚體糖蛋白[21]。亞基α和α’由延伸區(qū)和核心區(qū)組成，其延伸區(qū)的氨基酸數(shù)量分別為125及141。而β亞基僅有一個(gè)核心區(qū)[15,22]，其氨基酸數(shù)量為418。3 種亞基隨機(jī)組合形成3 種同三聚體（如α3、α’3、β3）和7 種異三聚體（如αα’2、α2α’、αα’α2、α’2β、α’β2、α2β、αβ2），其中β3的立體圖如圖1所示[23]。研究發(fā)現(xiàn)這3 種亞基都有不同程度的致敏性，其中β-伴大豆球蛋白的α亞基能被23%的患者血清識(shí)別，并且這3 種亞基之間具有較高的同源性[24]。其中，對(duì)于核心區(qū)，α與α’的同源性為90.4%，α與β的同源性為76.2%，α’與β的同源性為75.5%[16-17]；而α和α’之間的延伸區(qū)具有57.3%的序列同一性[25]。

圖1 β-伴大豆球蛋白β3的透視圖[23]Fig.1 Ribbon diagrams of β-conglycinin β3[23]

1.2 大豆球蛋白

大豆球蛋白也是一種貯藏蛋白，約占大豆總蛋白含量的19.5%～23.1%[18-19]，其分子質(zhì)量約為360 ku，屬于11S球蛋白。大豆球蛋白由氫鍵連接的5 個(gè)主要亞基對(duì)組成，其主要亞基對(duì)根據(jù)氨基酸序列可以分為兩組（組1包括A1aB1b、A1bB2、A2B1a；組2包括A3B4、A5A4B3）[26]，每個(gè)亞基對(duì)的分子質(zhì)量約60 ku。目前已知的大豆球蛋白酸性多肽鏈有6 種：A1a、A1b、A2、A3、A4和A5，其分子質(zhì)量為35～40 ku；堿性多肽鏈有5種：B1a、B1b、B2、B3和B4，其分子質(zhì)量均為22 ku。除了A5A4B3以外，其他亞基對(duì)均由1 個(gè)酸性A肽鏈和1 個(gè)堿性B肽鏈通過(guò)二硫鍵組成A-S-S-B單體形式[27]。研究表明，酸性多肽鏈與堿性多肽鏈的結(jié)合并不是隨機(jī)的，而是形成獨(dú)特的酸性-堿性對(duì)[28]。Badley等[29]利用電子顯微鏡和X射線散射技術(shù)，首次揭示了大豆球蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)，闡明大豆球蛋白的物理形狀是一個(gè)低扁圓柱體，其尺寸為11.0 nm×11.0 nm×7.5 nm，其中兩個(gè)三聚體位于另一個(gè)三聚體之上，從而形成大豆球蛋白六聚體。同時(shí)兩個(gè)三聚體通過(guò)靜電作用相互連接，而三聚體中的亞單元?jiǎng)t主要通過(guò)疏水力結(jié)合。迄今為止，僅有含A3B4亞單位的大豆球蛋白同型六聚體被確定了晶體結(jié)構(gòu)，如圖2所示[30]。在不同的離子強(qiáng)度、pH環(huán)境及熱處理?xiàng)l件下，大豆球蛋白可被解離為亞基、成分多肽和半分子形式，但是天然狀態(tài)下大豆球蛋白的分子結(jié)構(gòu)十分緊密，一般難以被酶解和催化[31]。針對(duì)致敏性而言，大豆球蛋白的致敏性弱于β-伴大豆球蛋白[24-25]，其中大豆球蛋白堿性多肽鏈的致敏性較弱，而酸性多肽鏈的致敏性較強(qiáng)，原因是酸性多肽鏈與IgE、IgM、IgA有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

圖2 大豆球蛋白A3B4的透視圖[30]Fig.2 Ribbon diagrams of glycinin A3B4[30]

1.3 Gly m Bd 30K

Gly m Bd 30K，又稱P34，是一種半胱氨酸蛋白酶，廣泛存在于大豆細(xì)胞液泡中[32]。Gly m Bd 30K是單體蛋白，其氨基酸數(shù)量為379 個(gè)，分子質(zhì)量為34 ku，屬于7S球蛋白，約占大豆總蛋白含量的1%[18]，其結(jié)構(gòu)如圖3所示[33]。研究發(fā)現(xiàn)，66.5%的大豆過(guò)敏患者對(duì)Gly m Bd 30K識(shí)別并產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，因此認(rèn)為其屬于大豆中的主要致敏蛋白[19,34]。同時(shí)，Gly m Bd 30K是一種糖蛋白，其N(xiāo)端170位氨基酸處是一個(gè)多糖鏈結(jié)合位點(diǎn)。研究表明，蛋白質(zhì)的糖基化位置在其致敏性方面發(fā)揮重要作用[35-36]，因此Gly m Bd 30K存在一定致敏性。

圖3 Gly m Bd 30K的透視圖[33]Fig.3 Ribbon diagram of Gly m Bd 30K[33]

1.4 Gly m Bd 28K

Gly m Bd 28 K是由473 個(gè)氨基酸殘基組成的糖蛋白[27-28]，其分子質(zhì)量為26 ku，等電點(diǎn)為6.1，主要存在于7S球蛋白中，約占大豆總蛋白含量的0.5%[37]，其蛋白結(jié)構(gòu)如圖4所示[38]。23%的大豆過(guò)敏患者可以對(duì)Gly m Bd 28K產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)[34]，其致敏表位最主要反映在其N(xiāo)端氨基酸序列：FHDDEGGDKKSPKSLFLMSSTR[19,38]，其多糖結(jié)合位點(diǎn)位于多肽鏈20位天冬酰胺處，該多糖由甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、木糖及海藻糖以物質(zhì)的量比3∶2∶1∶1組成[39]。研究表明，去糖基化后Gly m Bd 28K的致敏性完全消失[18]。

圖4 Gly m Bd 28K的透視圖[38]Fig.4 Ribbon diagram of Gly m Bd 28K[38]

2 檢測(cè)技術(shù)

根據(jù)識(shí)別物質(zhì)的不同，目前食品過(guò)敏原的檢測(cè)技術(shù)可分為基于蛋白水平和基于核酸水平的檢測(cè)技術(shù)。基于蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、免疫印跡法（Western blotting）、免疫層析法、質(zhì)譜法及生物傳感器法；基于核酸水平的檢測(cè)技術(shù)有實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)。本文主要介紹當(dāng)前大豆過(guò)敏原檢測(cè)方法的基本原理、優(yōu)缺點(diǎn)及實(shí)際應(yīng)用，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

2.1 基于蛋白水平的檢測(cè)技術(shù)

2.1.1 ELISA

ELISA基于抗原-抗體的特異性結(jié)合對(duì)過(guò)敏原進(jìn)行免疫測(cè)定，通過(guò)間接指標(biāo)對(duì)過(guò)敏原含量進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，不需要復(fù)雜或昂貴的設(shè)備[40]。ELISA作為常見(jiàn)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于大豆中主要抗原蛋白的檢測(cè)[41]。ELISA根據(jù)固定抗原方法的不同，可分為直接法和間接法，其中間接法包括夾心法及競(jìng)爭(zhēng)法，不同ELISA方法的原理示意圖如圖5所示。Xi Jun等[42]建立了一種基于自制的重組蛋白Gly m Bd 28K及單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定食品樣品中的Gly m Bd 28K，其檢測(cè)限為0.235 μg/L，平均回收率為96.73%。Ma Xi等[43]基于自制的單克隆抗體4B2，建立了競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)大豆球蛋白，其檢測(cè)限為0.3 ng/mL，定量線性范圍為0.3～11.2 ng/mL。Segura-Gil等[44]開(kāi)發(fā)出可檢測(cè)β-伴大豆球蛋白的兩種檢測(cè)方法，結(jié)果顯示間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法及夾心ELISA法的檢測(cè)限分別為30 ng/mL及0.90 ng/mL，定量線性范圍分別為10～3 000 ng/mL及2～15 ng/mL。Smirnova等[45]建立了檢測(cè)食品中大豆原料的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法，以大豆胰蛋白酶抑制劑為識(shí)別物質(zhì)，該方法的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為60 min，檢測(cè)限為3.5 ng/mL，定量線性范圍為7.7～110 ng/mL，研究結(jié)果證明該方法可用于檢測(cè)肉類(lèi)食品中的大豆過(guò)敏成分。夾心ELISA法檢測(cè)靈敏度明顯高于競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法，但更適合于未加工大豆蛋白的檢測(cè)，而競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法則更適合檢測(cè)加工后的大豆制品[46]。基于單克隆抗體所建立的ELISA法檢測(cè)精準(zhǔn)度高于基于多克隆抗體的ELISA法[47]。

圖5 ELISA的檢測(cè)原理Fig.5 Principle of enzyme-linked immunosorbent assay

2.1.2 免疫印跡法

免疫印跡法又稱蛋白質(zhì)印跡法，是基于抗體的特異性來(lái)鑒定抗原的有效檢測(cè)方法。首先進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），隨后將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)樣品電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上。利用一抗作為“探針”，用標(biāo)記的二抗進(jìn)行“顯色”，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)與分析[48]，免疫印跡法的具體步驟及原理如圖6所示。Matsuo等[49]基于免疫印跡法，以IgE結(jié)合能力為指標(biāo)，對(duì)比了轉(zhuǎn)基因大豆及非轉(zhuǎn)基因大豆的過(guò)敏原性，結(jié)果顯示這兩種大豆之間并無(wú)致敏性差異。免疫印跡法兼具電泳的高分辨力及免疫測(cè)定法的高特異性及敏感性等優(yōu)點(diǎn)，可用于抗原的定性和半定量檢測(cè)[50]。相比于ELISA，免疫印跡法的靈敏度較低，對(duì)檢測(cè)樣品中的大豆過(guò)敏原僅能進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)，但是其可以追蹤不同食物加工階段產(chǎn)物中所有蛋白和肽段圖譜。此外，免疫印跡法可以有效避免由于蛋白抑制劑的存在導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果假陰性現(xiàn)象[50]。

圖6 免疫印跡法的檢測(cè)原理Fig.6 Principle of Western blotting

2.1.3 免疫層析法

免疫層析法基于抗原-抗體的特異性結(jié)合，首先將抗體預(yù)包被于硝化纖維素（nitrocellulose，NC）膜上，待測(cè)樣品通過(guò)毛細(xì)作用涌動(dòng)到預(yù)包被抗體區(qū)域時(shí)被捕獲，使用酶標(biāo)或膠體金作為檢測(cè)標(biāo)志物，從而得到可視化結(jié)果，以纖維素膜上顯色條帶及其顏色的深淺等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)過(guò)敏原的定性或定量檢測(cè)[48]，檢測(cè)原理如圖7所示。Wang Yao等[51]建立了膠體金標(biāo)記的試紙條并應(yīng)用于奶粉中大豆球蛋白的檢測(cè)，利用自制的多克隆抗體及膠體金標(biāo)記的多克隆抗體，成功組裝了可精準(zhǔn)檢測(cè)大豆球蛋白的試紙條，最低檢測(cè)限為46.1 ng/mL，定量線性范圍為50～3 200 ng/mL。Wang Yao等[52]利用膠體金標(biāo)記的小鼠抗β-伴大豆球蛋白單克隆抗體和兔抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗體，建立了基于夾心法的快速側(cè)向流動(dòng)膠體金免疫分析試紙條，以專門(mén)鑒定大豆過(guò)敏原β-伴大豆球蛋白，檢測(cè)時(shí)間為10 min，檢測(cè)限為1.66 mg/kg。該檢測(cè)方法顯示出對(duì)β-伴大豆球蛋白的高特異性，并且與其他食品過(guò)敏原沒(méi)有交叉反應(yīng)。該檢測(cè)試紙條對(duì)奶粉樣品中β-伴大豆球蛋白的檢測(cè)范圍在80.8%～89.2%之間。相比于ELISA法，免疫層析法雖然檢測(cè)時(shí)間較短，但是其精準(zhǔn)度較低。免疫層析法操作簡(jiǎn)單、用時(shí)較短，通過(guò)增加檢測(cè)線（T線）可以進(jìn)行高通量檢測(cè)。為了有效提高免疫層析法的靈敏度，未來(lái)可以將單克隆抗體與新型材料標(biāo)志物如熒光量子點(diǎn)相結(jié)合。

圖7 免疫層析法的檢測(cè)原理Fig.7 Principle of immunochromatograpgy

2.1.4 生物傳感器

生物傳感器通過(guò)生物識(shí)別元件識(shí)別并響應(yīng)食物中的過(guò)敏原，再由換能器將其轉(zhuǎn)化為定量的光電信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)[53]，其工作原理如圖8所示。根據(jù)換能器的不同，生物傳感器可以分為光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器及壓電傳感器三類(lèi)。作為一類(lèi)新的檢測(cè)方法，它具有快速、靈敏度高、自動(dòng)化程度高、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于食物過(guò)敏原方面的檢測(cè)。Sundhoro等[54]將分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）固定到絲網(wǎng)印刷電極上，并將其與電化學(xué)生物傳感器相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大豆球蛋白精準(zhǔn)、高效的檢測(cè)，其檢測(cè)限為0.1 mg/L。Wang Wei等[55]開(kāi)發(fā)出無(wú)標(biāo)記的芯片，用以檢測(cè)Gly m Bd 30K在食品基質(zhì)中的含量，其可在15 min內(nèi)檢測(cè)出1 mg/mL的Gly m Bd 30K。生物傳感器技術(shù)兼具免疫檢測(cè)技術(shù)及光電技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，在大豆過(guò)敏原檢測(cè)中，選用最佳生物傳感器并擴(kuò)大檢測(cè)范圍是未來(lái)的發(fā)展熱點(diǎn)之一。此外，為了更好地檢測(cè)大豆過(guò)敏原，高靈敏度、集成化、微型化及商業(yè)化的生物傳感器也是未來(lái)研究的主要方向之一。

圖8 生物傳感器的檢測(cè)原理Fig.8 Principle of biosensor

2.1.5 質(zhì)譜法

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法檢測(cè)的基本原理是樣品通過(guò)離子源從而被電離成不同帶電粒子，利用加速電場(chǎng)使帶電粒子進(jìn)入質(zhì)量分析器，接著在電場(chǎng)及磁場(chǎng)的雙重作用下，將不同質(zhì)荷比（m/z）的離子分離并計(jì)算其分子質(zhì)量，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行鑒定分析[39-40]，其工作原理如圖9所示。Chen Shimin等[56]成功建立質(zhì)譜法，篩選出大豆中11 種過(guò)敏原的特征標(biāo)識(shí)肽段，為食品中大豆過(guò)敏原的檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。Montowska等[57]基于LC-MS/MS法檢測(cè)壽司中的大豆、牛奶及雞蛋清3 種食物中過(guò)敏原的含量，結(jié)果顯示大豆及雞蛋清中過(guò)敏原的檢測(cè)限為0.45%（m/m），牛奶中過(guò)敏原的檢測(cè)限為0.14%（m/m）。Gu Shuqing等[58]成功建立了LC-MS/MS檢測(cè)方法，對(duì)巧克力基質(zhì)中含有的8 種過(guò)敏原進(jìn)行多重檢測(cè)，對(duì)牛奶、大豆、花生、堅(jiān)果的檢測(cè)限分別為0.2～0.4、1.0～4、2.5～4、1～3 μg/g，并且其加標(biāo)回收率為60.1%～92.4%，表明所建立的檢測(cè)方法有效且精準(zhǔn)。質(zhì)譜方法雖然克服了免疫學(xué)技術(shù)遇到的問(wèn)題，即在食品加工處理后導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化后，無(wú)法有效、精準(zhǔn)地檢測(cè)過(guò)敏原，但其需要使用昂貴的設(shè)備，維護(hù)成本很高，而且需要由訓(xùn)練有素的人員操作[58]。現(xiàn)階段，由于質(zhì)譜法具有檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)用量少及可進(jìn)行分離鑒定等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于大豆過(guò)敏的檢測(cè)中。

圖9 LC-MS/MS的檢測(cè)原理Fig.9 Principle of liquid chromatography-tandem mass spectrometry

2.2 基于核酸水平的檢測(cè)技術(shù)

2.2.1 qPCR

PCR技術(shù)是一種在體外將少量初始樣品中的目的基因進(jìn)行大量擴(kuò)增的核酸合成技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，qPCR技術(shù)也開(kāi)始在過(guò)敏原檢測(cè)中有所應(yīng)用[59-60]。隨著熒光化學(xué)物質(zhì)的發(fā)展，基于其熒光特性實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程即為qPCR技術(shù)，其利用體外大量擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行樣品檢測(cè)。可在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)變化來(lái)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)過(guò)程[46]。qPCR是在食品過(guò)敏原檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的一項(xiàng)基因水平檢測(cè)技術(shù)。qPCR的特異性和靈敏度均優(yōu)于普通PCR，在進(jìn)行定性分析的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了在復(fù)雜食品基質(zhì)中對(duì)多重過(guò)敏原的定量分析。蘭海鷗[61]成功建立了qPCR方法，可精準(zhǔn)檢測(cè)出大豆、核桃及花生的過(guò)敏成分，其最低檢測(cè)限均為0.01 ng/μL。張舒亞等[62]以大豆主要過(guò)敏蛋白P34為靶標(biāo)，建立并優(yōu)化了特異性強(qiáng)、靈敏度高的qPCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限為10 mg/kg。Ladenburger等[63]成功研發(fā)出兩種可應(yīng)用于定量檢測(cè)花生及大豆的競(jìng)爭(zhēng)性qPCR檢測(cè)方法，建立了針對(duì)其線粒體DNA序列的PCR引物及探針，其定量檢測(cè)范圍是1～100 mg/L，該檢測(cè)方法可定量檢測(cè)商業(yè)食品中微量的花生和大豆。然而利用PCR檢測(cè)大豆過(guò)敏原容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，因此PCR在大豆過(guò)敏原檢測(cè)中的應(yīng)用有所局限。

2.2.2 LAMP技術(shù)

LAMP技術(shù)是根據(jù)6～8 種不同的靶基因DNA序列開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)出4～6 種特異性引物，60～65 ℃恒溫下在鏈置換DNA聚合酶作用下進(jìn)行大量擴(kuò)增，短時(shí)間內(nèi)可實(shí)現(xiàn)靶基因的特異性顯著擴(kuò)增[64]。LAMP的分析檢測(cè)結(jié)果通過(guò)反應(yīng)體系中樣品顏色等變化進(jìn)行評(píng)估。與傳統(tǒng)的PCR和qPCR檢測(cè)方法相比，LAMP具有許多優(yōu)點(diǎn)，如恒溫?cái)U(kuò)增、反應(yīng)時(shí)間短、檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)肉眼判斷等。該方法最主要的難點(diǎn)在于引物的設(shè)計(jì)，其直接決定了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性[49]。張舒亞等[65]成功設(shè)計(jì)6 條引物，建立了LAMP檢測(cè)方法，可在60 ℃、40 min內(nèi)成功檢出大豆過(guò)敏原成分，靈敏度可達(dá)0.01%。Allg?wer等[66]利用多拷貝基因ORF160b的循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，結(jié)合側(cè)向流動(dòng)免疫法評(píng)估LAMP在復(fù)雜食品基質(zhì)中檢測(cè)大豆成分的精準(zhǔn)度，并且與基于抗體的側(cè)向流動(dòng)免疫法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，LAMP-側(cè)向流動(dòng)免疫法可精準(zhǔn)、重復(fù)地檢測(cè)出3 種代表性基質(zhì)（煮熟的香腸、巧克力、速溶番茄湯）中10 mg/kg的大豆成分，然而兩種商業(yè)側(cè)向流動(dòng)免疫法陽(yáng)性檢測(cè)線的清晰顯示需大豆成分含量在10～102 mg/kg之間，且可見(jiàn)度可能會(huì)受到食品基質(zhì)的影響。因此，基于DNA的LAMP-側(cè)向流動(dòng)免疫法是一種操作簡(jiǎn)單的大豆致敏原檢測(cè)方法，其顯示出比商業(yè)側(cè)向流動(dòng)免疫法更高的靈敏度及特異性。

2.3 不同檢測(cè)方法的對(duì)比

隨著全球范圍內(nèi)食品多樣性的增加，食品中可能含有的過(guò)敏原含量及種類(lèi)不斷上升，檢測(cè)難度不斷升高，總結(jié)和認(rèn)識(shí)現(xiàn)有檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)與不足（表1），對(duì)于食品中不同過(guò)敏原的快速精準(zhǔn)檢測(cè)具有重要作用。

3 結(jié) 語(yǔ)

在全球范圍內(nèi)，食物過(guò)敏尚無(wú)特效療法，但大豆過(guò)敏患者人數(shù)逐年升高。由于大豆具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及良好的功能特性，且其在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，所以明確大豆中的主要致敏蛋白及其結(jié)構(gòu)，建立靈敏、高效的檢測(cè)方法對(duì)于預(yù)防大豆過(guò)敏相當(dāng)重要。目前應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)中，ELISA、質(zhì)譜技術(shù)及qPCR檢測(cè)方法應(yīng)用最為廣泛，但是檢測(cè)結(jié)果容易受到食品加工技術(shù)及食品基質(zhì)的影響。此外，食品加工過(guò)程中過(guò)敏原的分子結(jié)構(gòu)變化、樣品前處理中的有機(jī)溶劑殘留等因素均會(huì)影響抗原-抗體的特異性結(jié)合，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。由于食品在加工、包裝、運(yùn)輸過(guò)程中可能發(fā)生交叉污染，所以精準(zhǔn)檢測(cè)復(fù)雜食品基質(zhì)中的隱藏過(guò)敏原成分極為重要。隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，研究高通量且可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法十分必要。在現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用新型生物傳感器及納米材料開(kāi)發(fā)出便捷、高效、精準(zhǔn)的過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)極具實(shí)際意義。