光譜學技術應用于肉類腐敗檢測的研究進展

劉慶森，羅 欣，董鵬程，郝劍剛，毛衍偉,*，成海建，張一敏,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.國家肉牛牦牛產業技術體系烏拉蓋試驗站，內蒙古 烏拉蓋 026321；3.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東 濟南 250000）

我國2021年全年豬牛羊禽肉產量8 990萬 t[1]。如此巨大產量的肉類不可避免地會受到微生物、添加劑、獸藥、非法添加等污染，其中超過25%的肉類不合格率是由微生物引起的[2-3]。在肉的貯藏過程中，由微生物生長及其代謝活動而引起的腐敗是造成肉浪費的最主要原因之一，給肉類產業造成巨大的經濟損失。肉在腐敗過程會產生異味、肉色變暗、表面發黏的現象，使消費者無法接受。一旦微生物總數或某種致病菌超過一定數量，食用后還會給人體帶來健康隱患[4]。

傳統的微生物檢測過程是先通過微生物富集，再進行生化分析確認，最常用的方法為平板培養計數法。雖然該方法具有目的性強、成熟可靠等優點，但其周期長、勞動強度大、會對被測物造成破壞等缺點不容忽視[5]。現代食品質量與安全檢測方法要求更加方便、快捷，這也迫切需要引入新型的檢測技術，而光譜學技術在快速無損、實時在線等需求方面表現出巨大優勢[6]。已有學者對拉曼光譜預測肉色、pH值、嫩度、剪切力等肉類品質指標進行綜述[7]，雖然涉及肉類腐敗預測，但對相關文獻總結不夠全面。此外，Khaled等[8]對肉類品質和安全的快速檢測技術進行了綜述，但主要針對食源性致病菌的檢測。目前，缺乏關于光譜學技術檢測肉類腐敗微生物的綜述。

本文在分析肉源腐敗微生物致腐機理及其預測模型建立過程的基礎上，對拉曼光譜、紅外光譜和光譜成像技術的原理及研究和應用情況進行闡述，以期為光譜學技術在肉類腐敗微生物檢測中的應用和進一步研究提供思路和理論指導。

1 肉中的腐敗微生物及代謝活動

1.1 初始腐敗微生物及優勢腐敗菌

肉中的初始微生物水平對其貨架期具有至關重要的影響，較為常見的腐敗微生物有莫拉氏菌、假單胞菌、嗜冷桿菌、肉毒桿菌、沙雷氏菌、索絲菌、埃希氏菌、不動桿菌等[9-10]。在肉類貯藏及流通過程中，不同包裝方式（如托盤包裝、真空包裝以及氣調包裝（modified atmosphere packaging，MAP））所提供的環境會篩選出特定種類的優勢腐敗菌[11-12]。

肉在有氧環境中貯藏時，優勢腐敗菌通常為假單胞菌、熱死環絲菌[11-12]。而在無氧條件下，肉中的優勢腐敗菌主要為乳酸菌、腐敗希瓦氏菌、腸桿菌[11-12]。通常情況下，優勢腐敗菌數量大，提供的信息足以滿足快速預測技術實現測定的需求。但要實現對肉類微生物菌群結構的預測，對非優勢腐敗菌的快速檢測變得非常重要。

1.2 腐敗微生物的代謝活動

在肉的貯藏和流通過程中，微生物會利用碳水化合物（主要利用糖原分解產生的葡萄糖）、蛋白質、脂肪等營養物質產生氨、硫化物、酮和醛等一系列代謝物，最終導致肉的腐敗[13-14]。大多數腐敗微生物首先利用肉中殘存的葡萄糖產生乙酸、乙偶姻、乙丁酸和3-甲基丁醇等異味物質[15-16]。當微生物繁殖到一定數量，葡萄糖被利用殆盡。腐敗微生物開始利用胞外酶將蛋白質降解為氨基酸，氨基酸進一步被分解為胺、氨、硫化物等，而脂肪及脂肪酸會被微生物來源的脂肪酶分解為甘油、醛、酮等化合物，產生難聞的腐敗氣味[13-14]。

不同的腐敗微生物會利用不同的營養物質，并產生特定的代謝產物。假單胞菌是低溫有氧貯藏肉中的優勢腐敗菌，它們優先利用葡萄糖，而后利用氨基酸并產生硫化物、二甲基硫等物質，使肉發生腐敗[17]。但假單胞菌在無氧條件下可利用丙酮酸、葡萄糖酸鹽、氨基酸進行生長繁殖，產生乙酯、二甲基硫化物[18]。腸桿菌、乳酸菌、熱死環絲菌同樣是導致肉類腐敗的常見微生物，在利用完葡萄糖和葡萄糖酸鹽-6-磷酸之后，選擇性利用乳酸、葡萄糖酸、丙酮酸、氨基酸、甘油等[19]。乳酸菌、熱死環絲菌多產生乙偶姻、乳酸等最終產物，腸桿菌則多與硫化氨類化合物的產生有關[20-21]。

微生物生長代謝導致肉類發生腐敗的過程中，以肉為主體的“生態體系”會同時發生許多復雜變化，主要是肉中蛋白質二級結構（α-螺旋、β-折疊）的變化、氨基酸的合成和分解、微生物數量的增加（圖1），此類變化是判斷肉類腐敗的重要信息。葡萄糖是腐敗微生物生長繁殖的重要營養物質，可作為微生物快速檢測的內標物質，而氨水平的上升同樣可成為判定肉類腐敗的重要信息。不同的優勢腐敗菌在生長代謝過程中會產生復雜的代謝副產物，如何尋找優勢腐敗菌的特異性代謝產物成為實現肉類腐敗快速檢測的重點及難點。

圖1 肉類腐敗快速檢測的物質基礎Fig.1 Material basis for the rapid detection of meat spoilage

2 光譜學技術在肉類腐敗檢測中的應用

2.1 光譜數據處理及模型建立

光譜學技術可以結合化學計量學方法，利用被測物質分子獨特的結構及組成成分，將生物學差異信號轉變成可視化物理信號數據[22]，并進一步建立腐敗微生物快速預測模型（圖2）。原始光譜既包含目標信息，同時也存在大量的干擾信息。這些噪音主要來源于環境中的雜光、熒光效應、電荷耦合元件（charge coupled device，CCD）檢測器噪音、固體顆粒散射等[23]。所以建立預測模型的第一步為降噪處理，方法通常包括基線校正、平滑處理、一階導數、二階導數、多元散射校正、標準正太化、去趨勢化處理等[24-25]。為進一步篩選目標信息和減少信息的冗雜程度，需要進行特征波段的篩選，例如，競爭性自適應重加權算法（competitive adaptive reweighting algorithm，CARS）[26]可以通過偏最小二乘法（partial least squares，PLS）篩選出與預測目標高度相關的變量并組成新的子集，進而提高模型的運行速度和準確性。主成分分析（principal component analysis，PCA）可以解決變量之間的多重線性相關問題，進而降低數據維度。最后，通過人工神經網絡、支持向量機（support vector machines，SVMs）、隨機森林、偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）等機器學習方法[27-28]建立預測模型。通常，按照3∶1劃分訓練集和驗證集，模型性能的評價指標以決定系數（R2）、相關系數（r）和均方根誤差（root mean standard error，RMSE）為主。由于人工神經網絡初始權重的隨機性、SVMs可配置不同的核函數和懲罰因子等，往往使模型運行結果具有不唯一性，可通過結合遺傳算法（genetic algorithm，GA）、連續投影算法和蟻群算法找到機器學習方法的最優解以解決上述問題。隨著研究的不斷深入，研究人員開始將單個或多個傳感器提供的特征波段與實驗數據進行分析，如以紅外光譜和拉曼光譜所提供的信息互為補充。

圖2 利用光譜技術建立預測模型一般步驟Fig.2 General steps for establishing a prediction model using spectroscopic techniques

2.2 拉曼光譜基本原理及其在肉類腐敗檢測中的應用

2.2.1 拉曼光譜原理及特征峰

拉曼光譜是分子散射光譜，當待測物中的分子被激發光照射時，分子吸收能量從原始基態躍遷到不穩定的虛態，虛態的分子會釋放能量回到基態。如果此時的基態是原始基態，則為瑞利散射；若基態與原始基態存在能級差，則為拉曼散射[29]。拉曼光譜鑒定肉的腐敗主要是根據微生物數量和菌群結構的變化、微生物產生的特異性代謝產物以及微生物導致肉本身結構和成分發生的改變。這些變化又導致肉中化學鍵發生不同的振動，從而使光譜中出現不同的特征峰。例如，酰胺I帶（1 645～1 685 cm－1）、酰胺III帶（1 200～1 235 cm－1）常常與肉類品質有關。而酰胺I帶可反映α-螺旋（1 650～1 658 cm－1）、β-折疊（1 665～1 680 cm－1）、β-轉角（1 680 cm－1）和無規卷曲（1 660～1 665 cm－1）信息[30]。

表1總結了部分可用于分析肉類腐敗的拉曼特征峰。肉在貯藏過程中，蛋白質的α-螺旋和β-折疊等變化會伴隨著C＝O、C—N伸縮振動及N—H彎曲振動，拉曼光譜技術可以根據此類化學鍵的變化來檢測肉類腐敗。此外，苯丙氨酸（1 002、1 205 cm－1）、色氨酸（755、1 551 cm－1）、酪氨酸（826、855 cm－1）等芳香族氨基酸的拉曼位移峰可作為分析肉類腐敗的補充信息[31]。除1 700～500 cm－1所提供的特征峰之外，水和脂類的O—H伸縮振動（3 397～3 309 cm－1）、氨基酸和蛋白質及胺類的N—H伸縮振動（3 303～3 291 cm－1）、過氧酸的O—H伸縮振動（3 284～3 250 cm－1）以及游離氨基酸的NH3＋（2 141～1 997 cm－1）也被用于構建腐敗微生物的預測模型。

表1 與肉類腐敗相關的拉曼光譜特征峰Table 1 Characteristic peaks in Raman spectra associated with meat spoilage

2.2.2 拉曼光譜在肉類腐敗檢測中的應用

已有學者探究了拉曼光譜技術分析肉類腐敗的能力。不同狀態雞胸肉的拉曼光譜可以通過PCA進行區分，進而達到判斷新鮮腐敗的目的[39]。肉在貯藏過程中會發生變化，進而引起拉曼光譜的改變，尋找與腐敗微生物相關的特征峰對預測肉品貨架期具有重要意義。Sowoid nich 等[31]通過拉曼光譜結合PCA，并根據1 651 cm－1處的酰胺I帶、902 cm－1和935 cm－1處的C—C伸縮振動以及833 cm－1和860 cm－1處的酪氨酸帶振動等變化，成功對豬背最長肌和腰大肌的新鮮度進行了判別。僅依靠PCA等方法進行定性分析是遠遠不夠的，開發并建立微生物的定性定量預測模型是關鍵。

Argyri等[40]嘗試利用GA優化人工神經網絡預測人工感官評分結果，優化后總體分類精確度達到83.08%。此外，Argyri等[40]利用支持向量回歸、PLSR、遺傳編程和神經網絡對菌落總數（total viable count，TVC）、乳酸菌數量、腸桿菌數量進行定量預測，發現R2集中在0.6～0.8（個別方法R2＜0.5），對TVC的預測效果總體好于單菌屬[40]。上述結果表明，肉類表面復雜的微生物種類會對單一菌屬的預測產生影響。

此前的研究目標多以肉糜為主，而對于大塊肉排的研究較少。Yang Hongbo等[41]利用拉曼光譜結合PLSR對生鮮牛排的TVC、假單胞菌、乳酸菌、熱死環絲菌進行預測，結果表明，檢測細菌分類越精確，拉曼光譜對單菌屬數量預測效果相對較差。雖然拉曼光譜結合化學計量學方法能夠判別新鮮肉和腐敗肉，并能較好地預測TVC，但對于實現精準、實時在線預測肉類剩余貨架期及優勢腐敗菌（種、屬）還存在一定的距離。Lu Weilai等[42]利用人工智能結合共聚焦顯微拉曼光譜分析了14 種單細胞微生物的不同生長狀態，并得到（95.64±5.46）%的分類正確率。在未來的研究中，拉曼光譜可以結合更加合適的人工智能方法分析肉類表面不同微生物的生長狀態從而實現更加準確的檢測效果。

拉曼光譜在肉類腐敗檢測中的應用匯總如表2所示。

表2 拉曼光譜在肉類腐敗檢測中的應用Table 2 Application of Raman spectroscopy in meat spoilage detection

2.3 紅外光譜在肉類腐敗檢測中的應用

紅外光主要分為近紅外光（780～2 500 nm）、中紅外光（2 5 0 0 ～2 5 0 0 0 n m）和遠紅外光（25 000～1 000 000 nm）。近紅外光可激發物質分子中的泛音和諧波振動，而中紅外光對物質分子的基礎振動和相關旋轉-振動結構更為敏感，因此多將近紅外光譜法和中紅外光譜應用于肉類的品質檢測[44]。同拉曼光譜法相似，紅外光譜法檢測肉源細菌主要利用其物質化學鍵的特征吸收峰（表3）。酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）和酰胺II帶（1 600～1 500 cm－1）所提供的蛋白質及氨基酸信息是預測微生物的關鍵，脂肪酸區（3 000～2 800 cm－1）和碳水化合物吸收帶（1 500～1 200 cm－1）也可以作為預測模型的主成分。

表3 與細菌相關的紅外光譜吸收區Table 3 Infrared absorption regions associated with bacteria

2.3.1 以腐敗細菌數量為預測指標的研究進展

自2001年起就有學者利用紅外光譜法預測肉糜的腐敗，主要研究對象為牛肉和禽肉，并初步對TVC進行定量分析[49-50]。隨著研究的進一步深入，研究人員開始建立腐敗細菌（屬、種）的紅外光譜定性預測模型。

如表4所示，紅外光譜和肉中腐敗微生物具有較好的相關性。有學者利用近紅外光譜結合PCA成功區分接菌和未接菌的雞胸肉，但未能成功區分表面接種的英諾克李斯特菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、門多薩假單胞菌和大腸埃希氏菌[51]。與拉曼光譜相同，紅外光譜離實現鑒別菌種水平的腐敗微生物仍有一定距離，不斷提高光譜處理方法是提取重要信息的關鍵。Kodogiannis等[52]通過反卷積處理紅外光譜的洛倫茲寬度，發現游離氨基酸含量與雞肉腐敗程度密切相關。除定性分析外，研究人員也展開了假單胞菌、乳酸菌、腸桿菌和熱死環絲菌等優勢腐敗菌的快速定量分析，并實現了較好的預測效果[53-54]。Argyri等[50]通過不同的數據處理方法對TVC、假單胞菌、乳酸菌、熱死環絲菌進行定量分析，R2集中在0.6～0.9（個別方法R2＜0.4）。在傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）結合化學計量學方法對益生菌發酵香腸檢測微生物狀況的研究中，PLSR模型預測TVC和乳酸菌的RMSE分別為0.641和0.633[55]。目前，尚未有基于FTIR建立益生菌發酵香腸預測接種乳酸菌數量的其他模型，所以結合人工神經網絡、SVMs等方法建立預測模型可能會進一步提高該技術的性能。Spyrelli等[56]不但利用PLSR對假單胞菌進行了定量預測，還采用LDA、二次判別分析（quadratic discriminant analysis，QDA）、SVMs進行分析，結果表明QDA結合FTIR光譜預測新鮮腐敗狀態的效果最好。Spyrelli等[57]進一步通過不同機器學習方法預測雞胸肉表面的TVC和假單胞菌數量，發現選擇合適的數據處理方法對于模型性能具有至關重要的意義。綜上，選擇合適的實驗目標菌相和化學計量學方法可提高預測模型的準確度，這也使紅外光譜在肉類腐敗判別中表現出更大的潛力。目前，紅外光譜結合多元回歸法建立肉源腐敗微生物的定量預測模型仍處于探索階段。

表4 紅外光譜在肉類腐敗檢測中的應用Table 4 Application of infrared spectroscopy in meat spoilage detection

2.3.2 以揮發性鹽基氮含量作為預測肉類腐敗指標的研究進展

總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）是我國國家標準中規定的判定肉類腐敗的物質，其產生與細菌的代謝活動密切相關。姜新華[59]的研究表明TVB-N含量和TVC的皮爾遜相關系數高達0.902。如表5所示，Wu Xiaohong等[60]在擬合近紅外光譜圖與TVB-N含量的過程中發現，Adaboost算法可以顯著提高模型的判別性能，其結合非相關性判別分析（uncorrelated linear discriminant analysis，ULDA）可使分類正確率達到100%。此外，特征波段的選擇尤為重要，波段過長會出現數據冗雜、后期模型運轉速度慢等問題，但波段過短會使數據信息缺失，進而導致模型的準確度下降。Ouyang Qin等[61]使用4 種不同的特征波段選擇方法，分別建立了預測TVB-N含量的組合區間偏最小二乘法（synergy interval partial least square，Si-PLS）、變量組合總體-分析-偏最小二乘法（variable combination population analysis partial least squares，VCPA-PLS）、CARS-PLS和隨機青蛙-偏最小二乘法（random frog partial least squares，RF-PLS）模型，其中RF-PLS預測模型的性能最佳，因為RF選擇的特征波段提供了更多與—NH2相關的譜峰。

表5 紅外光譜預測肉中TVB-N含量的應用Table 5 Application of infrared spectroscopy in predicting TVB-N content in meat

在大多數的研究中，近紅外光譜多結合PLSR建立線性回歸模型，很少有研究建立非線性預測模型。Chen Yifan等[62]首先利用PCA將數據進行降維處理，然后結合BPNN建立TVB-N含量的預測模型（r＝0.96），然后采用MIV預處理方法選擇特征波段，提高了模型的預測性能（r＝0.98），說明TVB-N含量具有較強的非線性效應。利用便攜式近紅外光譜儀能夠較好地預測魚片腐敗，特別是利用GA優化BP-ANN的方法最為有效，r和RMSE分別為0.985和0.095[63]。

2.4 光譜成像在肉類腐敗檢測中的應用

2.4.1 光譜成像的分類及特點

光譜成像技術可分為多光譜成像技術、高光譜成像技術和超光譜成像技術[64]。多光譜成像技術同時包括光譜信息和圖像信息，相比于拉曼光譜和紅外光譜技術，其具有更小的波段和更加明顯的特征波段[65]。而高光譜成像技術可獲得點、線和面掃描圖像[66]，其成像方式主要有漫反射、透射和反射成像[67]3 種。超光譜成像技術的優勢在于同一時間可測試樣品整個區域內所有點的信息，光譜的分辨率也可達到一個更精確的數量級，但對其用于肉類腐敗微生物的檢測還鮮有研究。在食品微生物檢測中，光譜成像主要選用近紅外光波段和可見光波段[68]。物質分子結構的特異性決定其在近紅外光譜中存在不同的吸收帶，進而能夠通過差異性圖像光譜結合化學計量學方法實現可視化分析。

2.4.2 多光譜成像在肉類腐敗菌檢測中的應用

基于多光譜成像技術的優勢，該技術不僅可應用于肉類色澤、紋理等方面的檢測，而且在肉類腐敗微生物的檢測方面也逐漸發展起來。除對新鮮度和TVC進行預測[69]，單菌屬的預測也是光譜成像技術應用的方向。Panagou等[70]利用PLSR模型預測TVC、假單胞菌和熱死環絲菌水平，結果顯示，模型對于TVC的預測效果明顯優于假單胞菌和熱死環絲菌。與拉曼光譜和FTIR技術相似，預測目標越精確，光譜成像所提供的信息越有限。

數據處理方法對于模型的預測能力至關重要，研究不同的數據處理方法是光譜成像技術發展的前提。Alshejari等[71]研究發現，相較于自適應神經網絡模糊推理系統（adaptive neural fuzzy inference system，ANFIS）、多層神經網絡（multilayer neural networks，MLP）和PLSR模型，基于自適應模糊推理神經網絡（adaptive fuzzy inference neural network，AFINN）的非線性回歸模型對TVC具有更好的預測能力。除此之外，研究人員也將不同光譜學技術結合進行微生物預測。在進行相同數據處理的基礎上，多光譜成像結合FTIR相比單一多光譜成像能夠提供更多的TVC預測信息[72]。不同傳感器的信息融合可以提高模型的精確度，為未來光譜學技術應用于肉類的腐敗預測提供了新的研究方向。

2.4.3 高光譜成像在肉類腐敗菌檢測中的應用

相對于多光譜成像，擁有更高精確度的高光譜成像[73]結合化學計量方法在微生物檢測方面具有明顯優勢。研究表明，利用可見光和近紅外光范圍（400～1 100 nm）的高光譜成像技術能夠較好地預測牛肉、豬肉的腐敗情況[74]。Barbin等[75]利用PLSR建立TVC和嗜冷菌數（psychrotrophic plate count，PPC）的預測模型，得到預測集的R2分別為0.86和0.89。魏菁[76]通過多種數據處理方法預測冷鮮羊肉的TVC，結果表明，基于極限學習機（extreme learning machine，ELM）預測模型的性能優于PLSR、SVM等，在新鮮度分級模型中，基于混沌粒子群算法（chaos particle swarm optimization，CPSO）的SVM模型的預測效果最好。姜新華[59]采用核稀疏圖嵌入典型相關分析法（kernel sparse graph embedding canonical correlation analysis，KSGECCA）對高光譜圖像數據進行提取，并通過自適反向神經網絡分類法使羊肉新鮮度的總體分類精度達到93.93%。除了預測微生物數量隨時間的變化，高光譜提供的特征值還可以用于構建關于微生物的二級生長模型。Zhou Binjing等[77]發現457、509 nm波長處的相對反射率與豬肉表面的假單胞菌數量相關性最強，以其作為特征值構建假單胞菌關于溫度的二級生長模型，R2在0.849～0.974范圍內。同樣，拉曼光譜和FTIR在未來的研究中也可以涉及微生物二級生長模型預測。

高光譜成像作為快速檢測技術研究的熱點，與FTIR等技術進行信息融合建立預測模型是未來的研究方向之一。相比于單一傳感器，多傳感器融合特征波段的信息可以提高預測模型的精確度[78]。

光譜成像在肉類腐敗檢測中的應用研究匯總如表6所示。

表6 光譜成像在肉類腐敗檢測中的應用Table 6 Application of spectral imaging in meat spoilage detection

3 結 語

肉在腐敗過程中會發生很多變化，如酰胺含量的增加、C＝O雙鍵含量的減少、微生物數量的增加并伴隨著代謝物質的產生等，可通過拉曼光譜、紅外光譜和高光譜成像技術反映此類變化從而實現對肉類腐敗的快速檢測。3 種技術涉及了肉類新鮮度及其表面優勢腐敗菌的定性、定量檢測，并能夠涵蓋不同貯藏條件下的豬、牛、羊、禽、魚等多個物種的分割肉或肉制品。在數據處理上，光譜的預處理方法和機器學習的不斷優化，使得腐敗預測模型具有良好的分類和預測效果。ELM、KSGECCA法等也被應用于模型的建立中，并能夠較好地捕捉光譜中與肉的腐敗相關的信息。

雖然拉曼光譜、紅外光譜和高光譜成像技術在肉類腐敗檢測中取到了一定的發展，但依然存在較多的不足。在定量分析中，3 種技術預測肉中TVC的穩定性和精確度仍不能滿足肉類工業的實際需求；在定性分析中，3 種技術難以直接對肉中的腐敗菌屬、種進行區分。不斷改進數據處理方法和獲取大量的實驗樣本是光譜學技術解決以上不足的關鍵，并且可以以不同光譜技術的數據融合作為研究重點。隨著計算機技術和編程方法的不斷發展，相信未來的光譜學技術會融入更加先進、便捷的數據處理方法，結合光譜儀器在高準確度、低成本等方面的不斷升級，并通過系統性地建立不同場景的數據庫，最終實現應用于家庭和工業生產實時監測肉品表面微生物數量的目標。另外，通過進一步研究并確定每種腐敗微生物的光譜特征峰，光譜學技術手段有望成為快速預測微生物種群結構的實用工具。