南美白對蝦熱風干制過程蛋白質與品質變化關系分析

徐文雅，馬倩云*，王佳榮，孫劍鋒，湯軼偉，王 頡，王文秀*

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

南美白對蝦（Penaeus vannamei）是當今世界上養 殖最多的三大優 良蝦類之一，目前已成為我國 重要的養殖蝦種。根據《中國漁業統計年鑒》，2020年中國南美白對蝦養殖產量高達119.77萬 t[1]。對蝦水分含量高、組織柔嫩、結締組織少，體內酶類在常溫下活性強，因而極易發生腐敗變質，故貯藏期較短。干制后的蝦干因味道鮮美、營養豐富 而深受廣大消費 者喜愛，并且具有易貯存、方便 攜帶等優點。因此，干制已成為延長對蝦貯藏期的重要加工方式之一。

熱風干制是一種常見的海鮮干制方法，具有生產量大、操作簡便、流程簡化且易自動控制等特點[2]，因此在工業干制生產中常采用此方法。在干制過程中，受干制溫度和時間的影響，水產品中水分不斷蒸發、細胞液濃縮、化學鍵發生新生和斷裂，氨基酸多肽鏈展開，從而導致蛋白質變性并逐漸喪失生物活性[3]。作為重要的肌肉成分，蛋白質變化可以實質性地影響蝦的色澤和質構特性，因此，深入研究干制過程中對蝦蛋白質變化規律及其與品質變化的內在聯系，可為提高南美白對蝦干制品質量提供理論依據。而現階段對于對蝦干制的研究主要集中在不同加工方式和加工工藝優化對干制品理化特性、營養成分等指標的影響方面[4-5]，對引起理化品質變化的深層原因缺乏系統的研究，對干制過程中蛋白質變化規律及其與品質變化的相關關系尚不明確。

基于上述問題，本研究以南美白對蝦為原料，對其進行熱風干制加工處理，分析干制過程中色澤、質構、微觀結構等品質特性變化規律，并深入探討干制過程中蛋白質氧化降解程度、分子內價鍵、蛋白質二級結構、三級結構的變化，從分子層面揭示干制誘導的對蝦蛋白變化規律。在此基礎上，通過相關性分析解析蛋白質變化與品質的內在聯系，以期明確蛋白質變化對蝦干品質的影響，為進一步提升水產品干制品品質提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活對蝦購買于河北省保定 市南市區農大科技市場。

無水乙醇、乙酸乙酯、氯化鈉溶液等化學試劑（均為分析純） 西安三浦化學試劑 有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-914385-111電熱鼓風干燥箱 吳江德順電熱設備廠；CR-400色彩色差計 美國HunterLab公司；TMS-Pro食品物性分析儀 美國FTC公司；TGL21M臺式高速冷凍離心機 湖南易達京華儀器有限公司；F97熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；165-8001電泳儀 美國Bio-Rad公司；Tiss-24高通量組織研磨儀寧波新智生物科技有限公司；AccuRam拉曼光譜儀美國Ocean Optics公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦樣品的制備

購買單只質量約為（15±3）g的活蝦，低溫運到河北農業大學果蔬加工與創新實驗室，將其放入0 ℃冰水中直至死亡。將適量的蝦在質量分數3%的鹽水中煮沸2 min，然后取出去除表面水分，將蝦樣品置于55 ℃的恒溫鼓風干燥箱中進行干制。根據前期研究結果，干制12 h時，蝦干的口感最佳[6]，因此設定總干制處理時間為12 h，每2 h取樣一次，測定品質和蛋白質變化指標，實驗重復3 次。

1.3.2 品質指標測定

1.3.2.1 色澤測定

利用CR-400色彩色差計對蝦肉的L*、a*、b*值進行測定并計算色差?E。其中L*值表示亮度，a*值表示紅綠度，b*值表示黃藍度。測試時需進行白 板校正。

1.3.2.2 質構特性測定

將對蝦去殼進行質構特性分析（texture profile analysis，TPA），測定樣品的硬度、黏附性、彈性、膠黏性和咀嚼性。測量模式為TPA測定程序，探頭型號P/5，感應力量程為200 N，檢測速率為30 mm/min，形變量為60%，起始力為0.5 N。

1.3.2.3 微觀結構的觀察

參考王穩航等[7]的方法，采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察蝦肌肉組織的微觀結構。將樣品切成3 mm×3 mm×3 mm的正方體進行實驗。用體積分數2.5%戊二醛溶液在4 ℃中浸泡樣品24 h，然后分別用體積分數10%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液和無水乙醇進行梯度洗脫20 min，隨后真空冷凍干燥得到樣品。將試樣進行噴金操作，抽真空后進行觀察，放大倍數為1 000。

1.3.3 蛋白質指標測定

1.3.3.1 總巰基含量測定

總巰基含量測定參照 魯耀彬等[8]方法，稱取2.0 g蝦肉樣品放入50 mL離心管，加入10 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 8.0），8 500×g下勻漿2 min，再1 500×g離心10 min，取上清液1 mL并用蒸餾水制成10 倍稀釋液，再加入20 μL 2 mmol/L的5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）試劑進行渦旋混勻，25 ℃遮光處理1 h后在412 nm波長處測定吸光度。用BCA試劑盒測定蛋白質量濃度。實驗重復3 次，總巰基含量按公式（1）計算。

式中：A為吸光度；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）；ε為摩爾消光系數（13 600 L/（mol·cm））；D為稀釋倍數（10）。

1.3.3.2 蛋白羰基含量測定

蛋白羰基含量測定參考石徑[9]的方法并進行適當修改。稱取2.0 g肉樣于10 mL含0.6 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）中進行勻漿，1 500×g離心10 min，取400 μL上清液于2 mL EP管中，加入含10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）的200 μL 2 mol/L HCl，30 ℃水浴鍋中避光反應1 h。每EP管中加1 mL質量分數40%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）沉淀蛋白，靜置20 min后10 000×g離心15 min，棄去上清液，用1 mL乙酸乙酯-乙醇溶液（1∶1，V/V）洗滌沉淀以除去未反應的DNPH，重復上述步驟至上清液無色，用3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液溶解蛋白，沉淀完全溶解后在317 nm波長處測吸光度。實驗重復3 次，BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白羰基含量按公式（2）計算。

式中：A為吸光度；a為羰基分子吸光系數（22 000 L/（g·cm）；b為光程（1 cm）；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.3.3 三氯乙酸-可溶性肽含量的測定

TCA-可溶性肽含量的測定參考徐永霞等[10]的方法并作適當修改。稱取2.0 g樣品，加入18 mL預冷的5 g/100 mL TCA溶液，勻漿1 min后于4 ℃冰箱靜置1 h，4 ℃條件下10 000×g離心15 min，取上清液備用，采用雙縮脲法測定蛋白（可溶性肽）質量濃度。

1.3.3.4 化學作用力的測定

化學作用力的測定參照鄧麗[11]的方法并略加改進。取2.0 g蝦肉樣品于質量分數2.5%的NaCl中均質45 s。將處理后的樣品加10 mL 0.6 mol/L NaCl（試劑S1），4 500×g下勻漿2 min，4 ℃冷藏1 h。然后4 ℃、18 600×g離心25 min，上清液于4 ℃保存。將上述離心的沉淀加10 mL 1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液（試劑S2），后續處理相同。再將上述離心的沉淀加10 mL 8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液（試劑S3），后續處理相同。將上述沉淀加10 mL pH 7的0.5 mol/L 2-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素的混合液（試劑S4），后續處理相同。將每步離心后上清液分別加等體積質量分數20% TCA溶液，使之充分沉淀。然后經4 000×g離心15 min，棄上清液。向沉淀中加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液溶解沉淀并置于4 ℃層析柜保存，每步沉淀需對應標記清楚。實驗過程中經試劑S1、S2、S3及S4提取后的上清液中蛋白含量分別對應離子鍵、氫鍵、疏水鍵和二硫鍵含量，利用福林-酚法測定蛋白質量濃度。

1.3.3.5 蛋白質二級結構測定

采用拉曼光譜測定蛋白質二級結構。將蝦樣品去皮平鋪于載物臺上進行拉曼光譜掃描。激光波長為785 nm，拉曼位移范圍為200～2 000 cm－1，采集時間為10 s，累計2 次。每個樣品取3 個點掃描，最終拉曼光譜曲線取3 次結果的平均值。采用拉曼光譜儀配套軟件AccuRam對光譜進行基點校正和熒光背景扣除。

1.3.3.6 蛋白質三級結構測定

參考姜晴晴[12]的方法提取肌原纖維蛋白，參照Xu Yanshun等[13]的方法測定內源熒光強度。用0.6 mol/L NaCl溶液將肌原纖維蛋白溶液質量濃度稀釋至0.05 mg/mL，然后使用熒光分光光度計測定內源熒光光譜，激發波長為295 nm，掃描速率為1 000 nm/min，發射波長掃描范圍310～400 nm，激發和發射狹縫寬度均為10 nm。

1.3.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考Laemmli等[14]的方法并作適當修改。向0.1 g樣品中加入10 mL PIPA裂解液，在高通量組織研磨儀中均質，將樣品冰孵20 min，14 000×g離心10 min后獲得的上清液為肌原纖維蛋白原液。用BCA試劑盒測定蛋白質量濃度，并用PIPA裂解液將所有樣品蛋白原液質量濃度稀釋至1 500 μg/mL。將獲得的肌原纖維蛋白液與上樣緩沖液按體積比4∶1混合，并在沸水中加熱5 min。將混合液加到SDS-PAGE凝膠上樣孔中，以130 V恒壓進行電泳約100 min，然后使用SDS-PAGE染色液染色30 min后蒸餾水脫色，最后通過與蛋白質標記物（10～250 kDa）比較來確定蛋白質的分子質量。

1.4 數據處理與分析

實驗數據以平均值±標準差表示，統計學處理和圖形處理分別利用SPSS 22.0和Origin 2018軟件進行，蛋白質二級結構定量通過PeakFit V4軟件進行，采用Duncan法進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 對蝦熱風干制過程中品質的變化

2.1.1 色差

對蝦在干制過程中色澤的變化如表1所示。L*值從新鮮時的40.71增加到煮沸后的63.85，這是因為煮沸過程中熱量增加，導致蛋白質變性，最終影響蝦的亮度[15]。隨著干制時間的延長，L*值顯著降低（P＜0.05），這是由于干制過程中發生美拉德反應，導致干蝦變黑，亮度降低。Ling Jiangang等[16]在研究高壓輔助真空冷凍干制對蝦的影響時也發現美拉德反應導致蝦黑變的現象。a*和b*值在整個干制過程中具有相似的變化趨勢，與鮮蝦相比，干蝦的a*和b*值顯著增加（P＜0.05），這是由于蝦體內胡蘿卜素在加熱過程中分解，蝦青素釋放引起的顏色變化。在干制后期，a*和b*值略有下降，這可能是由于蝦青素隨著熱風干制時間的延長而略有損失。對于ΔE，干制過程中ΔE均高于12，表明干制過程中蝦的顏色與新鮮時的顏色有明顯差異。

表1 熱風干制過程對蝦色澤的變化Table 1 Changes in the color of shrimp during hot air drying

2.1.2 質構特性

質構特性包括硬度、黏附性、彈性、膠黏性、咀嚼性等指標。如表2所示，硬度隨干制時間的延長而顯著增加，到干制終點增加至344.78 N（P＜0.05），這是由于蝦肌肉纖維干制過程發生收縮，肌動蛋白和肌球蛋白被破壞，導致肌纖維結構紊亂[17]。彈性呈先升高后降低的趨勢，干制8 h時達到最高水平。彈性的變化與肌肉的收縮有關，干制過程肌肉組織因收縮而發生不可逆變形，導致彈性整體上呈降低趨勢。咀嚼性代表咀嚼固體樣品所需的能量，而膠黏性代表將食物與其接觸材料分離所需的能量，蝦樣品的膠黏性和咀嚼性隨干制時間的延長而增加，到干制終點分別增加至45.01 mJ和116.50 mJ，這是質構特性共同作用的結果。

表2 熱風干制過程對蝦質構特性的變化Table 2 Changes in the texture of shrimp during hot air drying

2.1.3 微觀結構

對蝦干制過程中微觀結構變化如圖1所示。新鮮樣品切面與表面的肌肉組織光滑細膩，幾乎沒有裂痕。干制4 h時，水分損失嚴重，從樣品的切面和表面可以看出蝦肉肌纖維束發生形變，肌纖維細胞間隙出現裂縫，干制8 h時肌肉纖維收縮更加嚴重，直到12 h肌肉纖維發生斷裂。Chang Haijun等[18]報道稱此現象可能是肌原纖維蛋白脫水、熱變性和纖維收縮共同作用的結果。肌纖維結構之所以發生變化是因為干制過程中蛋白質氧化變性，進而發生了交聯和聚集，并且肌肉的肌節可能會發生聚合或收縮，從而使間隙增大；同時在體內蛋白酶的作用下，結締組織不斷降解，導致肌纖維與肌內膜發生了脫離，也使間隙增大[19]。另外，干制前后水分含量的降低也導致肌纖維裂縫的增大，并且熱處理造成了肌肉收縮，破壞了肌纖維結構的完整性。Namsanguan等[20]的研究表明干制導致肌纖維細胞收縮，肌動蛋白結構被破壞，肌纖維間隙增大的同時蝦的硬度隨之增大，可見蝦肌肉微觀結構變化與質構特性存在密切聯系。

圖1 對蝦熱風干制過程蝦肌纖維切面與表面SEM圖（×1 000）Fig.1 Cross-sectional and surface SEM images of shrimp during hot air drying (× 1 000)

2.2 對蝦熱風干制過程中蛋白質變化分析

2.2.1 總巰基和蛋白羰基含量

總巰基的損失量和蛋白羰基的生成量可反映蛋白的氧化程度。如圖2所示，新鮮蝦中總巰基含量為2.36 μmol/g，水煮后總巰基含量降低至0.77 μmol/g，表明存在于半胱氨酸殘基中的巰基基團受到溫度和有氧環境的影響，發生變性和延伸，巰基基團暴露并轉化為二硫鍵，導致總巰基含量顯著降低。隨干制時間的延長，巰基基團繼續被氧化，干制至終點時總巰基含量為0.36 μmol/g。Ko等[21]在研究羅非魚熱處理后成分變化時發現巰基易在分子內被氧化，生成二硫化物，導致巰基含量下降。羰基是自然氧化的主要產物，在干制過程中蛋白羰基含量從0.84 nmol/mg（鮮樣）升高到2.03 nmol/mg，這是由于對蝦在干制過程中賴氨酸、精氨酸和脯氨酸的側鏈受到過渡金屬和活性氧的攻擊，肽鏈發生斷裂，導致羰基含量升高[22]。

圖2 對蝦熱風干制過程總巰基和蛋白羰基含量的變化Fig.2 Changes in total sulfhydryl group and protein carbonyl group contents in shrimp during hot air drying

2.2.2 TCA-可溶性肽含量

TCA-可溶性肽含量作為表征蛋白質降解的指標之一[23]，能夠反映對蝦所含小分子肽的含量，從而反映蛋白質的降解程度。對蝦在熱風干制過程中TCA-可溶性肽的含量變化如圖3所示。TCA-可溶性肽含量總體呈上升趨勢。新鮮蝦中TCA-可溶性肽的含量為0.56 μmol/g，水煮后降至0.43 μmol/g，之后隨干制時間的延長，又逐漸增多。Nie Xiaohua等[24]發現內源酶有助于TCA-可溶性肽的釋放，可以看出水煮過程使部分內源性蛋白酶失活，但并沒有將蝦中的內源酶完全去除，致使TCA-可溶性肽含量在干制過程中逐漸增多。干制6 h后TCA-可溶性肽含量增加更明顯，這是因干制引起蛋白質變性、保水力降低、水分流失加快所致。

圖3 對蝦熱風干制過程TCA-可溶性肽含量的變化Fig.3 Changes in TCA-soluble peptide content of shrimp during hot air drying

2.2.3 化學作用力的變化

離子鍵、氫鍵、疏水鍵、二硫鍵等 維持蛋白質分子構象的化學作用力變化可反映蛋白質的變性程度，熱風干制過程各化學作用力變化如圖4所示。離子鍵是較弱的鍵合力，在加熱過程中容易被破壞。隨干制時間的延長離子鍵的相對含量顯著降低（P＜0.05），從21.66%（鮮樣）下降到11.62%（干制12 h），表明干制過程中蝦蛋白質受溫度的影響，電子吸收熱能變得活躍，導致離子鍵不穩定而發生斷裂，促使其相對含量降低。朱孔輝等[25]研究鳊魚凝膠蛋白特性時發現離子鍵含量越高蛋白品質越好。氫鍵是指氫原子與電負性大的原子以共價鍵結合，同時與電負性大的原子Y形成X-H…Y形式的鍵，是形成蛋白質二級結構的主要作用力，對穩定蛋白質二級結構起重要作用[26]。氫鍵相對含量的變化趨勢與離子鍵相似，從19.33%（鮮樣）下降至9.23%（干制12 h），表明干制處理破壞了蛋白質多肽鏈中氨基和酰基之間形成的氫鍵，進而導致對蝦蛋白質二級結構發生改變。這與鄧麗[11]研究鮑魚蛋白質加熱過程中的化學作用力變化趨勢一致（氫鍵相對含量顯著降低（P＜0.05））。疏水鍵在穩定 蛋白質三級結構和生物膜磷 脂雙分子層結構方面起重要作用。疏水鍵相對含量的變化趨勢與離子鍵相反，從12.35%（鮮樣）上升至18.97%（干制12 h），表明干制促使蝦蛋白的疏水性殘基暴露，增加了疏水鍵的相對含量。二硫鍵在干制過程中相對含量隨干制時間的延長而顯著增加（P＜0.05），到干制終點增加至28.94%，二硫鍵含量的增加與巰基（—SH）被氧化而形成—S—S—有關，這一結果與上述總巰基含量變化結果相印證。

圖4 蝦熱風干制過程化學作用力的變化Fig.4 Changes in chemical forces in shrimp during hot air drying

2.2.4 蛋白質二級結構定量分析結果

拉曼光譜中酰胺I區（1 600～1 700 cm－1）峰的變化與蛋白質二級結構變化密切相關。酰胺I區含有C＝O、C—N和N—H伸縮振動的信息[27]。蛋白質二級結構主要包含α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲，其中α-螺旋與1 651～1 660 cm－1之間的峰有關，表征蛋白質分子的規整性；β-折疊和β-轉角分別對應1 600～1 639 cm－1和1 661～1 700 cm－1之間的峰，β-折疊和β-轉角反映蛋白質分子的松散性；無規卷曲對應1 640～1 650 cm－1之間的峰[28]。干制會使蝦的蛋白質二級結構發生變化，因此酰胺I區的峰形會隨之變化。由于表征蛋白質二級結構構象的多個振動吸收峰容易重疊，使拉曼圖譜中出現寬峰，因此常采用求二階導和曲線擬合的方法來得到單個譜帶的信息[29]。

通過PeakFit V4軟件對酰胺I區進行峰分離和曲線擬合處理，得到圖5，然后根據α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲對應的峰面積，計算出各結構的相對含量，如表3所示。新鮮對蝦的α-螺旋相對含量為32.31%，干制至終點12 h時，其相對含量為18.37%，下降了43.14%，并且可以看出從新鮮對蝦到水煮對蝦α-螺旋相對含量下降了18.97%，表明溫度的升高會顯著影響α-螺旋結構的變化。對蝦經過水煮后β-折疊相對含量顯著降低22.20%，而干制過程對蝦β-折疊相對含量從新鮮時的17.57%降至干制終點的14.67%，這是由于溫度突然升高導致蛋白分子間氫鍵斷裂，使其維持蛋白質二級結構的能力降低，導致β-折疊相對含量顯著下降（P＜0.05）。對蝦經過水煮后β-轉角相對含量顯著升高13.45%，而干制過程β-轉角含量變化不明顯。對蝦無規卷曲相對含量隨干制時間的延長呈上升趨勢，從新鮮時的15.76%上升至干制終點時的28.21%，整個干制過程發生了α-螺旋向β-折疊、β-轉角和無規卷曲的轉化，意味著干制過程蛋白質分子結構由規整向松散轉化，并且與溫度變化密切相關。蛋白質分子的加熱變性、巰基氧化、水分子–蛋白質分子間氫鍵變化，造成了蛋白質原有的二級結構和空間構象的破壞。

圖5 對蝦蛋白拉曼光譜酰胺I區分峰和迭代擬合曲線Fig.5 Segregated and iterative curve-fitted Raman bands in amide I region of proteins in raw, boiled and dried shrimps

表3 對蝦蛋白酰胺I區二級結構相對含量Table 3 Secondary structure contents from amide I band spectra of proteins in raw, boiled and dried shrimps %

2.2.5 蛋白質三級結構的變化

芳香族氨基酸的暴露程度表明蛋白質結構的展開程度，可表征蛋白質三級結構的變化[30]。相關報道顯示，肌原纖維蛋白含有色氨酸殘基，色氨酸吲哚側鏈的暴露與內源熒光強度有關[31-32]，因此，色氨酸成為最常用的內源熒光探針。對蝦在干制過程中肌原纖維蛋白的熒光光譜如圖6所示，可以看到新鮮蝦的肌原纖維蛋白在343 nm波長處顯示出最高的熒光強度，水煮后熒光強度略有降低。然而當進行熱風干制時，熒光強度大幅度降低，并且隨著干制時間的延長逐漸降低，這表明干制促進蛋白質變性，引起疏水性殘基暴露，巰基氧化形成二硫鍵，從而使分子間作用增強，蛋白質發生再聚集，導致暴露出的色氨酸殘基重新被包裹，進而導致熒光猝滅。另外，疏水鍵是表征蛋白質三級結構的重要化學作用力，其含量越高表明蛋白質的變性程度越大。如圖4所示，疏水鍵的相對含量在干制過程中逐漸上升，肌漿蛋白的構象向不穩定狀態轉變，同時證明蛋白三級結構發生了改變。

圖6 對蝦熱風干制過程內源熒光強度的變化Fig.6 Changes in endogenous fluorescence intensity of proteins in shrimp during hot air drying

2.2.6 蝦熱風干制過程肌原纖維蛋白組成的變化

肌原纖維蛋白的特征條帶包括肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）（220 kDa）、α-肌動蛋白（94 kDa）、肌鈣蛋白（75 kDa）、肌動蛋白（43 kDa）、原肌球蛋白（36 kDa）和肌球蛋白輕鏈（＜20 kDa）[33-34]。對蝦肌原纖維蛋白的分子質量在干制過程中的變化如圖7所示，鮮蝦的分子質量條帶較多，存在聚集的現象，表明未經任何處理的鮮蝦樣品中蛋白質成分較完整。當樣品進行水煮處理后，MHC條帶和α-肌動蛋白條帶消失，肌鈣蛋白和肌動蛋白條帶明顯變淺，而原肌球蛋白條帶明顯加深，并且23 kDa處出現明顯條帶，表明加熱處理使MHC和α-肌動蛋白破壞降解，肌鈣蛋白發生降解生成肌鈣蛋白I（23 kDa）。隨干制時間的延長，肌鈣蛋白和肌動蛋白條帶逐漸變淺，是因為干制使該分子質量的蛋白片段發生降解；而原肌球蛋白、肌鈣蛋白I和肌球蛋白輕鏈條帶明顯加深，是因為大分子蛋白發生降解聚集，生成了一些分子質量小的蛋白片段。隨干制時間的延長，10 kDa附近處的蛋白質條帶加深，這可能是蛋白質降解產生的小分子肽。電泳結果結合TCA-可溶性肽含量從0.56 μmol/g（鮮樣）增加至0.91 μmol/g（干燥終點）的結果綜合證明了大部分蛋白質對加熱處理都不具耐受性，熱風干制會導致對蝦中蛋白質降解。

圖7 蝦熱風干制過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE的變化Fig.7 Changes in SDS-PAGE pattern of myofibrillar in shrimp during hot air drying

2.3 蛋白質與品質變化的相關性分析

為進一步確定熱風干制過程中對蝦品質變化與蛋白質的相關關系，對蛋白質變化指標（總巰基、蛋白羰基、TCA-可溶性肽、離子鍵、氫鍵、疏水鍵、二硫鍵、α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲水平）與品質特征（L*值、a*值、b*值、硬度、黏附性、彈性、膠黏性和咀嚼性）進行了Pearson相關性分析。由圖8可知，蛋白質變化指標與色澤和質構特性存在高度相關性。其中總巰基含量與顏色（L*、a*、b*值）存在顯著負相關（P＜0.05，P＜0.01），相關系數分別為－0.91、－0.81和－0.84，氫鍵相對含量與L*、a*和b*值呈顯著負相關（P＜0.05，P＜0.01），二硫鍵相對含量與L*、a*和b*值存在顯著正相關（P＜0.01，P＜0.001），相關系數分別為0.94、0.85和0.88，同時，β-轉角相對含量與L*、a*和b*值存在顯著正相關關系（P＜0.05，P＜0.01）。干制過程中蛋白巰基基團被氧化并暴露生成二硫鍵，并且干制使肌紅蛋白發生氧化，進而導致產品顏色發生改變。并且對蝦經過熱處理和較長時間的干制，蛋白質穩定的狀態被破壞，其二級結構由較為穩定的α-螺旋向β-轉角和無規卷曲轉化，導致其理化特性和功能特性改變，造成了劇烈的體積收縮和水分流失。與此同時，蛋白質不斷降解，生成更多的多肽和氨基酸，這些降解產物能夠參與美拉德反應，伴隨著蛋白質和脂質氧化程度的加深，導致對蝦的顏色發暗、發黃。

圖8 對蝦在干制過程中蛋白質變化與品質變化相關性分析的熱圖Fig.8 Heatmap showing the correlation between changes in protein characteristics and quality changes of shrimp during drying

對蝦中富含豐富的蛋白質，其質構特性的變化很大程度上取決于蛋白質的結構狀態。由圖8可知，蛋白羰基含量與硬度、膠黏性和咀嚼性呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數分別為0.88、0.92和0.87，TCA-可溶性肽含量與硬度呈極顯著正相關（P＜0.01），離子鍵、疏水鍵、α-螺旋和無規卷曲相對含量與膠黏性的相關系數分別達到－0.85、0.88、0.85和0.84，在干制過程中蝦肌肉蛋白發生降解，蛋白質內部及蛋白質之間發生交聯，增強了肌原纖維結構，使肌肉組織硬度增加。并且干制過程導致疏水相互作用力和二硫鍵不斷增強，蛋白質二級結構發生變化，在一定程度上促進了硬度、咀嚼性的增加。Rodrigues等[35]在研究巴西淡水魚的質構特性與TCA-可溶性肽含量的相關性時也發現了類似結果。由此可見蝦在干制過程中蛋白質氧化主要影響色澤變化，蝦肉的質構特性與蛋白質降解和變性關系更密切。

3 結 論

本研究深入分析了南美白對蝦在熱風干制過程中蛋白質變化和對蝦品質的變化規律，并分析了二者的相關關系。干制過程中，蝦的L*、a*和b*值逐漸下降，干燥終點時硬度、膠黏性和咀嚼性分別明顯增加至344.78 N，45.01 mJ和116.50 mJ；表征蛋白質氧化的總巰基含量逐漸降為0.36 μmol/g，而羰基含量上升至2.03 nmol/mg，證明干制誘導蛋白質氧化變性；TCA-可溶性肽含量升至0.91 μmol/g，SDS-PAGE中MHC、α-肌動蛋白和原肌球蛋白條帶消失，肌鈣蛋白條帶明顯變淺，證明干制導致蛋白質降解；干制過程蛋白質分子構象發生改變，肌肉蛋白的空間結構變小，形成致密的網狀結構，離子鍵和氫鍵相對含量分別顯著降低至11.62%和9.23%，疏水鍵與二硫鍵相對含量分別增加至18.97%和28.94%；同時利用拉曼光譜特征峰解析蛋白二級結構變化，通過分析α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲的相對含量，驗證了α-螺旋向β-折疊、β-轉角和無規卷曲轉化，證明了干制過程蛋白質分子結構由規整向松散轉化。色氨酸的熒光強度隨干制時間的延長而減弱，反映出蛋白質三級結構變化。Pearson相關性分析結果證明蛋白質氧化與顏色變化有關，蛋白質降解變性顯著影響蝦的質構特性。綜上，本研究結果可為評價干制加工對水產品品質的影響提供理論依據，通過探究蛋白質變性規律與品質變化的關聯機制，可為提高產品質量提供理論支撐。