3D打印加工荷載綠原酸水凝膠體系的適印性和適用性

南希駿，周泉城，李婭婕，倪乙丹，郭婷婷，厲佳怡，王紅磊，韓欽碩，白海媚，盛桂華*

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

3D食品打?。?-dimensional food printing，3DFP）又被稱為食品增材制造，是最精確的食品制造加工技術之一，也是實現定制食品、精準營養的一種加工方式[1]。3DFP加工研究探究的內容包括3D打印材料的適印性（理化特性、流變特性等）和3D打印物的適用性（機械性能、結構性能和包埋率等）[2]。

水凝膠是通過物理或化學交聯形成的一種具有三維網絡結構的聚合物體系[3]，材質接近生物體組織，具備定向遞送的生理條件，與細胞有良好的相溶性，可防止營養成分物質在有機溶劑中的轉性和溶解，利于親水性物質的荷載。但其硬度、膠著性偏高，在未來食品價值鏈中應用還需進一步的研究[4]。此外，由于化學凝膠的低安全性和物理凝膠的不穩定性[5]，近年來，穩定的物理共價鍵水凝膠成為了研究的熱點。

目前，3DFP水凝膠備受科研人員青睞。相比傳統模具造型，3DFP剪切作用導致水凝膠硬度、膠著性得到改善，對人體機械刺激更小，生物吸收性更好，還可以改善水凝膠其他機械性、可降解性、生物相容性、成型性和使用方便性等[6-7]。然而，3DFP加工過程中水凝膠涉及的反應類型、機理規律、組分互作機制等卻尚不清楚，而這些問題是制約3DFP行業發展的瓶頸。3DFP加工條件、功能因子互作機制直接決定了3D打印體系運輸和控釋效果，是本領域亟需解決的關鍵性科學問題。

綠原酸（chlorogenic acid，CA）是一種多酚類物質，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血壓等作用[8]，但對于C A 的體內遞送鮮有報道。甲基纖維素（methylcellulose，MC）具有良好的生物相容性、成膠特性、水溶性、成膜性以及反向溫敏特性，可用作可食用膜以及水凝膠制備材料[9-10]。林瑩等[9]利用MC的反向溫敏特性和成膠特性成功制備了可以包埋藥物的水凝膠。但目前MC在3DFP領域研究較少。透明質酸（hyaluronic acid，HA）具有潤化、抗氧化性、延緩衰老、抗炎等生理作用[11]。但目前其在3DFP領域中的研究應用也較少。

綜上所述，MC/HA水凝膠體系在3DFP方面的研究與應用較少。故本研究旨在探究3DFP加工荷載CA的MC/HA水凝膠遞送體系的適印性和適用性，揭示3DFP加工對水凝膠運輸體系結構、物理特性、包埋率以及CA控釋等影響規律，從而為3DFP加工技術和功能因子遞送體系方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HA（333 kDa） 華熙生物科技股份有限公司；MC（4 000 MPa·s）、CA（純度≥98%）、α-淀粉酶（4 000 U/g）、豬胃蛋白酶（3 000 U/mg）、豬膽粉、胰酶（1∶4 000）、福林-酚等 上海愛純生物有限公司。

1.2 儀器與設備

FOODBOT-S食品3D打印機 杭州時印科技有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；恒溫振蕩箱 常州市萬豐儀器制造有限公司；UV759CRT紫外-可見分光光度計 青島聚創環保集團有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州丹瑞實驗儀器設備有限公司；SL-1D4精密分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶膠的制備

取不同添加量（6%、7%、8%、9%，以體系質量計，下同）MC于蒸餾水中，90 ℃下加熱攪拌至MC顆粒完全潤濕、分散均勻，隨后4 ℃保存過夜。第2天取出MC凝膠體系，加入不同添加量（0.02%、0.05%、0.10%）CA（或/和HA），攪拌10 min至完全溶解，得到MC-CA、MC-HA、MC-CA-HA均勻透明溶液，4 ℃貯存備用。

1.3.2 3D打印

將所制的水凝膠使用螺桿擠出式3 D 打印機進行樣品制樣。3 D 打印機實驗模型是長×寬×高為3.7 cm ×0.50 cm ×0.50 cm的長方體，設置相關打印參數如下：噴嘴高度4 mm、噴嘴移動速率30 mm/s、噴嘴內徑尺寸0.84 mm、打印層高0.80 mm，每種材料打印5 個樣品。打印后樣品燒杯罩上，防止水分蒸發，1 h內完成指標測定。

1.3.3 3D打印材料成型性測定

視覺直觀觀察分析3D打印物成型性，即3D打印物打印形狀、成型效果等評價指標。

1.3.4 3D打印樣品打印精度測定

游標卡尺測量3D打印物的寬度。打印的偏差量按式（1）計算。

1.3.5 質構特性測定

用TPA模式測定打印前后樣品的硬度、彈性、咀嚼度、黏附性等[12]。質構儀參數設定：測前速率5 mm/s、測試速率1 mm/s、測后速率2 mm/s、壓縮率70%、起點感應力2.50 g、兩次壓縮時間間隔7.50 s。

1.3.6 動態剪切流變性能測定

將打印前后樣品置于室溫中穩定30 min后測定動態剪切流變性能。設定溫度25 ℃、平板直徑40 mm、間隙1 mm、應變設置0.20%（線性黏彈區內）、掃描頻率0.10～10.00 Hz，測定動態流變曲線[13]。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

將凍干打印樣品固定在樣品座上，噴金，以放大倍數500 倍的掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察樣品的橫斷面和縱切面的微觀結構[14]。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜測定

打印前后凍干樣品粉末與KBr粉末以1∶100的質量比球磨研磨均勻，抽空下壓成透明薄片，4 000～600 cm－1范圍內進行傅里葉變換紅外光譜掃描，以KBr空白壓片作對照[15]。

1.3.9 X射線衍射測定

將打印前后凍干樣品粉末置于帶孔鋁片（15 mm×20 mm×1.5 mm）中，隨后壓緊，進行X射線衍射測試。測試條件：掃描范圍3°～50°；測角精度2θ≤±0.01°；角分辨率半峰全寬≤±0.1°；角度重現性±0.000 1°[16]。

1.3.10 CA包埋率的測定

1.3.10.1 CA標準曲線的繪制

采用0.2 mol/L鹽酸-甲醇溶液定容CA標準品，在329.9 nm波長處測定不同CA質量濃度標準品的吸光度，以CA質量濃度/（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性回歸方程：y＝0.008x＋0.002 5，R2＝0.995 4。

1.3.10.2 CA含量及包埋率測定

將剛打印前后的樣品分別進行稱質量，記錄各組質量。將打印后的樣品放入離心管中，向離心管中加入適量的體積分數70%乙醇溶液，在40 ℃恒溫振蕩器中溶解30 min，分別取1 mL待測溶液于試管中，以1 mL的體積分數70%乙醇溶液作空白對照。使用紫外分光光度計在329.9 nm波長處測定各試管中溶液的吸光度[17]。根據回歸方程計算提取液中的CA質量濃度/（μg/mL），并按式（2）計算CA包埋率。

1.3.11 體外模擬消化

體外模擬消化參考饒雪甜等[18]的方法進行。

1.3.11.1 模擬消化液的制備

參照Minekus等[19]的方法制備模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液。

1.3.11.2 體外模擬口腔消化

0.50 g樣品與3.50 mL模擬唾液、0.50 mL淀粉酶（酶活力為1 500 U/mL）、25 μL 0.30 mol/L CaCl2和975 μL蒸餾水混勻，37 ℃恒溫振蕩器中消化2 min后迅速放入液氮終止反應，備用。

1.3.11.3 體外模擬胃消化

將通過模擬口腔消化后殘留的3DFP樣品加入到胃消化組的50 mL離心管中。胃消化組離心管中分別添加7.50 mL的模擬胃液、1.60 mL 25 000 U/mL的豬胃蛋白酶、5 μL 0.30 mol/L CaCl2、702 μL 5 mol/L HCl和193 μL蒸餾水。以模擬胃液作為空白對照。37 ℃恒溫振蕩消化2 h，在0、24、48、72、96、120 min時取樣。

1.3.11.4 體外模擬腸消化

將模擬胃消化后殘留的3DFP樣品加入到腸消化組的50 mL離心管中。腸消化組離心管中分別添加711 mL的模擬腸液、5 mL 800 U/mL的胰酶、2.50 mL 4%的豬膽汁、40 μL 0.3 mol/L的CaCl2、460 μL 5 mol/L的NaOH和1 mL蒸餾水。以模擬腸液作為空白對照。37 ℃恒溫振蕩器消化2 h，0、24、48、72、96、120 min時取樣。

將釋放液在3 000 r/min下離心10 min，取上層清液，測定釋放液在329.90 nm波長處的吸光度[17]，按式（3）計算不同時間（t/min）CA從3D打印樣品中的累計釋放率（Q/%）[20]。

式中：mt是t時刻累計釋放的總CA質量/mg；m是初始包埋在水凝膠中的總CA質量/mg。

1.4 數據統計與分析

實驗結果分析采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析法進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；采用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 MC添加量對3D打印樣品的可打印性的影響

探究水中MC添加量對打印體系可打印性的影響，結果如表1所示，6%和7%添加量的MC水凝膠可以打印成型，而當MC添加量超過為7%時，體系因為流動性差等而無法打印。

表1 不同添加量的MC水凝膠的3D可打印性Table 1 3D printability of hydrogels with different concentrations of MC

2.2 MC、HA和CA添加量對3D打印樣品的精度和成型性的影響

如表2、圖1所示，在只添加8%的MC時，體系因為太稠無法打印。而在8% MC水凝膠中加入0.05% CA/HA或CA和HA同時加入時，均可打印成型。相較于其他配比的MC水凝膠，在添加8% MC、0.05% HA、0.05% CA（圖1D）時打印效果最好，無斷料、出料過多的現象，成型后模型與設計模型最接近，寬度偏差最小，為13.40%。這說明MC、CA、HA在3DFP中相互作用達到了最佳的效果，實現了理想的適印性和適用性。其中MC對打印的適印性起主要作用，而HA的潤濕作用以及CA和HA協同互作可以改善同添加量MC無法進行3DFP的問題，而且提高了打印精度。而在8% MC、0.05% HA、0.05% CA基礎上增加MC的添加量會導致樣品太稠而斷料，成型效果很差（圖1F）。在8% MC、0.05% HA、0.05% CA基礎上提升HA的添加量會增加水凝膠的黏彈性[21]而導致黏度過高，無法打印出目標模型（圖1J）。如圖1H所示，樣品打印成球且出料過多，成型性較差，打印精度較低，可能是因為HA比例較高導致水凝膠黏度較高[21-22]，從而破壞了CA和HA的協同互作。綜上所述，添加8% MC、0.05% HA、0.05% CA的水凝膠體系打印效果最好。

圖1 不同質量比的3D打印物圖Fig.1 Pictures of 3D printed products with different mass ratios

表2 不同質量比的3D打印材料的打印精度Table 2 Printing accuracy of 3D printing materials with different mass ratios

2.3 MC、HA和CA添加量對3D打印材料和3D打印物質構特性的影響

在質構分析中，硬度是指樣品形狀發生一定改變所需的力；彈性指樣品在第一次壓縮變形量和第二次壓縮之間能恢復的高度的比值；黏附性表示樣品表面附著于其他物體（舌、牙、口腔等）時，剝落其所需要的力；咀嚼度表示將固體樣品咀嚼成可以夠吞咽狀態所需的能量[23]。如表3所示，CA和HA的分別加入使打印材料的硬度、彈性和咀嚼性總體降低，但提升了黏附性，這是由于HA原液有潤滑保濕補水的功效[21]，推測CA可能也具有一定的潤滑保濕功效。然而，CA和HA同時加入后打印材料的硬度、彈性、咀嚼度和黏附性顯著升高，可能是因為CA與HA之間的相互作用使打印材料結構更緊密，并且兩者的加入提高了打印材料的營養價值。如表4所示，在同時添加CA和HA時，隨著MC添加量的增加，打印樣品的硬度、彈性、咀嚼性總體提升，但黏附性先升高后降低。這說明樣品的成型性得到改善，而且具備較好的彈性。對比表3、4可知，打印后樣品相比與打印前樣品具有更高的硬度、彈性以及咀嚼度，而黏附性降低，表明打印后樣品結構更加緊密。綜上所述，當樣品MC、HA、CA質量比為8∶0.05∶0.05時，硬度、彈性最高，黏附性最低，打印效果最好。

表3 不同質量比的3D打印材料的質構特性Table 3 Texture characteristics of raw materials for 3D printing with different mass ratios

表4 不同質量比的3D打印物的質構特性Table 4 Texture characteristics of 3D printed products with different mass ratios

2.4 MC、HA和CA添加量對3D打印材料和3D打印物的流變特性的影響

3D打印品的動態黏彈性與其實際應用性能直接相關。儲能模量G’能反映打印物的彈性和剛性，儲能模量越高樣品支撐性越好，不易塌陷[24]；而損耗模量G”能反映打印物的黏性[14]；tanδ反映打印物的流動性，通過tanδ可以區分材料主要表現為彈性行為還是黏性行為。儲能模量G’和損耗模量G”均對頻率呈一定的依賴性，說明頻率與水凝膠體系黏彈性有關系[24]。如圖2所示，隨著頻率增大，CA水凝膠體系的G’和G”都呈現出不同程度的上升趨勢。所有3D打印品的G’均高于G”，表明打印物在該頻率掃描區域內以彈性為主導，是具備一定硬度的網狀疑膠。

圖2 3D打印材料和3D打印物的流變性能Fig.2 Rheological properties of raw materials for 3D printing and 3D printed products

如圖2所示，所有同一體系下3D打印樣品打印后G’均比打印前高，G”均比打印前低，這是因為經過3D打印后，凝膠體系硬度、彈性均升高，而黏附性降低。添加HA或CA后，體系的G’降低，即體系彈性降低，G”升高，即黏附性升高，這是因為HA具有潤滑和增大黏附性的作用[21]。而在同時添加CA和HA且樣品MC、HA、CA配比為8∶0.05∶0.05時，CA水凝膠體系的G’較高，并且該體系下G’與G”差值較大，說明打印的樣品形成了穩定的凝膠結構，成型性較好，此時的凝膠材料更適合打印。tanδ＜1說明材料主要表現彈性為行為，意味著材料更類似于固體，流動性較差。隨頻率增加，各樣品tanδ整體呈下降趨勢，表明3D材料和打印物流動性較差，黏彈性較低，類固性較高。綜上所述，3D打印后的樣品具有更好的支撐性。若要滿足后續加工要求及產品特性，可以選擇不同組成配比，以保證產品固液體狀態，達到目標的產品型態。

綜上，MC、HA、CA配比為8∶0.05∶0.05時體系的機械性能、流變性能最好，通過MC、CA、HA在3DFP中相互作用實現了理想的適印性。后續檢測打印精度較高和添加不同成分6 組水凝膠體系（即表2中編號1、2、3、4、5、9）的微觀結構性能，通過比較選擇最佳打印體系。

2.5 不同MC、HA和CA添加量的3D打印材料和3D打印物的SEM分析

水凝膠體系微觀結構結果如圖3所示。體系添加HA后（圖3B），與原先的水-MC凝膠體系（圖3A）對比，樣品結構更為松散，疊加層數更為顯著，可能是因為HA的潤濕性造成的。從圖3C可以看出，MC中添加CA后打印的樣品具備大小不一的孔隙結構，且結構較為疏松，樣品打印出后極易坍塌，因此打印精密度低。如圖3E所示，隨著HA和CA的添加，打印樣品的孔隙結構逐漸均勻，截面更為光潔。由圖3D可知，當CA與HA的質量比為1∶1時，打印后的樣品展現出更為勻稱的孔隙結構，可以維持樣品長時間不產生塌陷形變，可能是因為HA和CA形成了共價鍵。而當HA與CA的質量比為其他配比時，打印樣品的外表粗糙度提升（圖3F），可能是打印過程中出料不均勻，出現斷料的情況，樣品變形嚴重，表面有裂紋造成。

圖3 3D打印材料和3D打印物的SEM圖Fig.3 Scanning electron micrographs of raw materials for 3D printing and 3D printed products

2.6 不同MC、HA和CA添加量的3D打印材料和3D打印物的傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜是一種研究共聚物結構的有效手段，可測定物質中的功能性基團和高極性鍵的振動，從而分析物質化學鍵的變化[25]。因此，本實驗選擇具有代表性的4 組樣品（MC、HA、CA質量比分別為8∶0∶0、8∶0.05∶0、8∶0∶0.05、8∶0.05∶0.05）用傅里葉變換紅外光譜考察3DFP加工對水凝膠體系組分的影響以及打印過程中組分間相互作用。如圖4所示，與只添加MC的水凝膠相比，添加CA后的水凝膠在3 600～3 400 cm－1處和2 960～2 940 cm－1處吸收峰強度略有增加，可能是因為CA中甲基—OH分子締合和甲基—CH3伸縮振動引起的，但并沒有新峰生成，表明CA與MC結合較差，沒有形成新的共價鍵。HA和CA同時添加時，在1 400～1 000 cm－1處有很小的新峰生成，表明添加HA與CA形成了新的共價鍵。此外，與3D打印材料相比，打印后樣品峰強度升高，沒有新峰生成且沒有影響吸收峰的位置，表明3D打印的擠壓會使其結構更加緊密。

圖4 3D打印材料和3D打印物的傅里葉變換紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectra of raw materials for 3D printing and 3D printed products

2.7 不同MC、HA和CA添加量的3DFP材料和3D打印物的X射線衍射分析

物質組成元素、官能團或結構不同，其X射線衍射圖譜的衍射峰數量、衍射角等也會不同[16]。因此可通過衍射峰的位置確定樣品微晶變化，進而確定3DFP對物質組分作用及組分間相互影響。本實驗選擇具有代表性的4 組樣品（MC、HA、CA質量比為8∶0∶0、8∶0.05∶0、8∶0∶0.05、8∶0.05∶0.05）進行X射線衍射分析，由圖5可知，所有3D打印材料和3D打印物在4.94°處均有較強的特征衍射峰，可能是多酚的特征峰。同時，各組樣品在18.79°處有特征峰，并且在HA和CA加入后，特征峰均明顯增強，可能是因為添加HA與CA產生了新的共價鍵，因此物質結合更加緊密。此外，對比打印前與打印后樣品所得的結果，打印后樣品峰強度略有升高，但沒有新峰生成且沒有影響吸收峰的位置，表明3D打印的擠壓會使其結構更加緊密，與前文研究結果相印證。

圖5 3D打印材料和3D打印物的X射線衍射Fig.5 X-ray diffraction patterns of raw materials for 3D printing and 3D printed products

綜上所述，本實驗構建了荷載CA的水凝膠體系并進行了3D打印，當MC∶HA∶CA配比為8∶0.05∶0.05時結構性能最好，實現了良好的3D打印適用性，在此基礎上測定該體系下打印前后樣品的CA包埋率以及胃腸消化模擬。

2.8 最佳體系下3D打印材料和3D打印物的CA包埋率

對最佳配比的打印前和打印后樣品進行CA包埋率測定，如表5所示，每個打印樣品的CA平均添加量為0.011 6 mg。打印后樣品的CA包埋率比打印前樣品的CA包埋率提高了22.09 個百分點，3D打印處理后提高了荷載CA水凝膠3D打印體系的包埋率，可能是因為MC具有良好的成膜性[10]，3D打印的擠壓剪切的作用力可能使樣品表面形成了一層具有良好水溶性的MC薄膜[10,26]，使打印后樣品比打印前樣品能更好地留住CA，因此在利用溶解法測定包埋率時，打印后樣品包埋率大幅升高。但是具體組分間相互作用規律、機制等方面還需進一步研究。綜上，打印后MC-HA-CA體系的包埋效果良好，包埋率大于70%，滿足了3D打印的適用性。

表5 最佳3D打印材料和3D打印物的CA包埋率Table 5 Embedding rates of CA in the best raw material for 3D printing and 3D printed product

2.9 最佳體系的3D打印材料和3D打印物的體外胃腸消化模擬分析

如圖6所示，在120 min的胃消化和120 min的腸消化過程中，打印前后樣品的CA釋放率隨著時間延長均緩慢增加，表明樣品在模擬胃液和模擬腸液中均有一定的緩釋特性，這與林瑩等[9]的研究結果相似。打印前消化終點樣品胃、腸CA累計釋放率分別為8.82%、11.38%，打印后消化終點樣品胃、腸CA累計釋放率分別為14.62%、20.01%，表明樣品在腸模擬液中CA釋放特性更好，原因可能是腸消化模擬液中的胰液和膽汁可以水解MC與CA產生反應的化學鍵，且其中部分偏中性的CA在pH 7的腸模擬液中更加穩定，因此CA可以更好釋放并不易被分解，從而被吸收，這與饒雪甜[18]、任靜[27]等的研究結果相似。同時，紅外光譜分析結果表明CA與MC結合較差，利于CA的釋放，因而CA釋放量較高，腸和胃的消化吸收效果較好。

圖6 最佳3D打印材料和3D打印物的CA釋放率Fig.6 Release rates of CA from the best raw material for 3D printing and 3D printed product

對CA體外釋放情況通常用零級動力學模型、一級動力學模型、Niebergull平方根方程模型、Weibull方程模型和Ritger-Peppas方程模型擬合[20,28-29]。本研究中利用Origin軟件對3D打印前后樣品CA體外釋放情況進行5 種模型擬合，建立打印前后樣品CA含量在模擬胃液和模擬腸液中釋放動力學方程，結果如表6所示。根據決定系數R2可知，打印前后樣品CA的體外釋放情況利用Ritger-Peppas方程模型擬合效果最好，其中lnQ＝nlnt＋k中系數n均大于0.89，釋放機制主要為骨架溶蝕作用[30]。

表6 CA的釋放動力學模型擬合Table 6 Kinetic model fitting of CA release

此外，胃腸消化模擬中打印后樣品CA釋放率均大于打印前CA釋放率，首先可能如前文所述，打印后樣品CA包埋率高于打印前樣品的CA包埋率；其次，有研究表明高黏度MC凝膠的溶解度低于低黏度MC凝膠[9]，質構特性和流變分析結果表明，3DFP前樣品黏度高于打印后樣品黏度，因此3DFP前樣品溶解度高于打印后樣品溶解度，同時由表6可知，MC/HA水凝膠釋放CA機制主要為骨架溶蝕作用，因此相比于打印前材料，打印后樣品因為溶解度較高，從而更容易溶蝕，因而有利于CA的釋放，打印后樣品釋放率更高。

3 結 論

本研究構建了一種可以荷載CA并且可以應用于3D打印的水凝膠體系，確定最佳打印條件：MC、HA、CA配比為8∶0.05∶0.05。該體系相較于其他配比體系以及打印前樣品，打印精度較高，物理性能、流變性能較好，具有理想的3D打印適印性。該體系結構緊密且孔隙均勻、支撐性較好，具有良好的CA包埋率，實現了良好的3D打印適用性。同時該體系在胃腸消化模擬中具有良好的CA釋放率以及良好的緩釋作用，體外釋放情況符合Ritger-Peppas方程模型。

MC作為形成水凝膠的增稠劑包埋其他功能性物質還有待后續深入研究。此外，MC還可以加入到果漿中，制備果漿凝膠，應用于3D打印等方面，其適印性和適用性在未來食品價值鏈應用中還需進一步的研究。