駐景丸加減方對形覺剝奪性近視小鼠線粒體動力學相關(guān)蛋白的影響

莫 亞,張海燕,馬 捷

0 引言

近視在全球范圍內(nèi)呈爆發(fā)性增長,據(jù)報道2050年全球近視人數(shù)預(yù)計超過47億,其中高度近視約占10億[1],高度近視伴隨眼軸延長會引起一系列視網(wǎng)膜病變,包括視網(wǎng)膜變性、變薄甚至脫離等,且有研究報道高度近視的并發(fā)癥已成為青年患者首要致盲原因[2-3];此外,研究已證實,視網(wǎng)膜變薄、視功能下降在軸性近視的早期就出現(xiàn)了[4],故積極尋求早期軸性近視視功能保護的方法至關(guān)重要。目前研究已經(jīng)證實線粒體動力學失衡是各種疾病發(fā)生的關(guān)鍵,維持其動態(tài)平衡是疾病治療的潛在靶點[5-6],而且對視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展也起重要作用[7],可以通過調(diào)控線粒體動力學對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells,RGCs)起到保護作用[8]。在近視豚鼠中也可以觀察到調(diào)控線粒體動力學關(guān)鍵蛋白的陽性表達[9],這提示線粒體動力學參與近視發(fā)生發(fā)展過程。線粒體動力學是線粒體為適應(yīng)細胞內(nèi)外環(huán)境的變化并維持自身功能,不斷保持分裂和融合的過程,其外膜融合主要受線粒體融合蛋白1(mitofusin 1,MFN1)調(diào)控,視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)是促進內(nèi)膜融合的關(guān)鍵蛋白,而動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein1,DRP1)是調(diào)控線粒體分裂的重要蛋白[10]。駐景丸加減方目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于近視、視神經(jīng)萎縮等眼科疾病的治療[11-12]。前期動物實驗已經(jīng)證實該方具有延緩形覺剝奪性近視(form deprivation myopia,FDM)小鼠的作用[13];臨床實踐也表明,駐景丸加減方可以提高近視和干眼患者視力[11,14],并且對中心性漿液性視網(wǎng)膜病變患者的視力及眼底情況具有改善作用[15]。但是其具體作用機制尚未闡明。因此,本研究旨在探討駐景丸加減方是否通過線粒體動力學達到干預(yù)近視及近視視網(wǎng)膜退變的目的,為駐景丸加減方的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級3周齡雄性C57BL/6J小鼠30只,許可證號:YXK(川)2019-049。動物均飼養(yǎng)室溫(24±2)℃,濕度(50±10)%,通風良好環(huán)境,12h光照明/暗交替;小鼠自由攝取食物和水。本實驗由成都中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準(備案編號:2002-22)。

1.1.2實驗試劑及儀器MFN1一抗(批號ab126575)、OPA1一抗(批號ab184247)、DRP1一抗(批號ab157457),β-actin抗體(批號AC026),二抗(批號ab6789)均購買于英國abcam——艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;Western細胞裂解液(批號P0013,Beyotim);四氧化鋨(GP18456,徠卡);戊二醛(批號GS2607)、醋酸雙氧鈾(批號GS02624)、檸檬酸鉛染液(批號GZ02616)均購買于北京中鏡科儀技術(shù)有限公司、RNA Trizol Reagent(批號BBM1144)合肥博美生物科技有限公司。A型超聲(CineScan,法國)、帶狀檢影鏡(YZ24,蘇州六六視覺科技股份有限公司)、透射電鏡(型號JEM-1400FLASH,日本電子JEOL)。垂直電泳槽(JY-SCZ4+,北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

1.1.3藥物駐景丸加減方采用根據(jù)該方制成的我院院內(nèi)制劑補精益視片0.3克/片(成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科生產(chǎn),No.20200703),主要成分為:楮實子、菟絲子、茺蔚子、五味子、枸杞子、丹參、三七等。

1.2方法

1.2.1分組和造模及給藥[16]將30只3周齡C57BL/6J小鼠隨機編號1～30,按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、中藥組,每組各10只。模型組和中藥組小鼠右眼應(yīng)用半透明眼罩進行遮蓋制備FDM動物模型,每天檢查眼罩有無脫落,以及眼部有無異常分泌物和感染,對照組正常飼養(yǎng)。形覺剝奪4wk后對小鼠進行干預(yù),中藥組給予駐景丸加減方混懸液0.546g/(kg·d)(0.2mL/d)灌胃,共4wk。對照組、模型組予等體積生理鹽水灌胃。實驗結(jié)束時,戊巴比妥鈉麻醉,處死小鼠,摘取小鼠右眼眼球放入裝有凍存液的凍存管,并置于液氮中保存,備用。

1.2.2角膜屈光度及眼軸測量實驗開始和實驗結(jié)束時,分別應(yīng)用A超、帶狀光檢影鏡檢測小鼠右眼眼軸長度和屈光度。由同一位經(jīng)驗豐富的驗光師對全部小鼠進行測量,每只眼睛重復(fù)測量3次,取平均值。測量小鼠右眼屈光度前使用0.5%復(fù)方托吡卡胺滴眼液點眼充分散瞳后檢測,5分鐘/次,共4次,每只眼睛重復(fù)測量3次,計算平均值。

1.2.3q-PCR檢測應(yīng)用q-PCR檢測小鼠右眼視網(wǎng)膜線粒體動力學相關(guān)蛋白MFN1 mRNA、DRP1 mRNA、OPA1 mRNA表達。實驗結(jié)束時,在液氮中磨碎小鼠右眼視網(wǎng)膜組織,每50～100mg組織加入1mL Trizol,使用Trizol試劑從中提取總RNA。1mL Trizol加入0.2mL氯仿,劇烈振蕩,室溫放置;2℃～8℃ 12000r/min離心15min,棄其上清。用75%乙醇洗滌RNA沉淀。使用Primer Premier引物設(shè)計軟件設(shè)計篩選各基因特異性引物(表1)。所有引物均由上海生工生物公司設(shè)計合成。結(jié)果以2-△△CT法計算目的基因相對表達水平。

表1 本次檢測所用引物及堿基序列

1.2.4Westernblot檢測應(yīng)用Western blot檢測小鼠右眼視網(wǎng)膜MFN1、DRP1、OPA1蛋白表達。滅菌剪剪碎小鼠眼球視網(wǎng)膜組織,加入RIPA裂解液,冰上裂解10min,收集裂解液,12000r/min、4℃、離心10min,取上清液。取16μg上樣、200V電泳、PVDF膜100V濕轉(zhuǎn),5%脫脂牛奶封閉2h,將PVDF膜放入MFN1(濃度1∶500)、DRP1(濃度1∶1000)、OPA1(濃度1∶1000)、β-actin(1∶100000)一抗中,4℃孵育16h,二抗(1∶5000)室溫封閉2h,顯影。結(jié)果以目的蛋白相對表達量表示:目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值(IOD)/內(nèi)參積分光密度值(IOD)。

1.2.5透射電鏡檢測透射電鏡檢測小鼠右眼視網(wǎng)膜色素上皮細胞線粒體形態(tài)學變化。將小鼠右眼視網(wǎng)膜制成超薄切片(50nm),樣本先后用3%戊二醛和1%四氧化鋨固定,脫水,醋酸鈾室溫下染色15～20min,透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠右眼眼軸和屈光度測量結(jié)果實驗前,對照組、模型組以及中藥組小鼠右眼眼軸和屈光度差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。實驗結(jié)束時,與對照組相比,模型組和中藥組小鼠右眼屈光度均降低、伴眼軸增長(P<0.05),提示模型組、中藥組小鼠右眼形成軸性近視;與模型組相比,中藥組小鼠右眼眼軸增長趨勢緩慢,且屈光度“近視化漂移”趨勢緩慢,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),這提示中藥對軸性近視小鼠視網(wǎng)膜有一定保護作用,見表2、3。

表2 不同時間點各組小鼠右眼眼軸長度變化

表3 不同時間點各組小鼠右眼屈光度變化

2.2q-PCR結(jié)果與對照組相比,模型組和中藥組MFN1 mRNA、OPA1 mRNA相對表達量減少、DRP1 mRNA相對表達量增加(均P<0.05);與模型組相比,中藥組MFN1 mRNA、OPA1 mRNA相對表達量增加(均P<0.05),而DRP1 mRNA相對表達量減少,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表4。

表4 各組小鼠右眼視網(wǎng)膜MFN1 mRNA、OPA1 mRNA、DRP1 mRNA相對表達量比較

2.3Westernblot結(jié)果與對照組相比,模型組和中藥組MFN1、OPA1蛋白相對表達量減少、DRP1蛋白相對表達量增加(均P<0.05);與模型組相比,中藥組MFN1、OPA1蛋白相對表達量增加(均P<0.05),而DRP1蛋白相對表達量減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1,表5。

圖1 各組小鼠右眼MFN1、OPAI、DRP1蛋白相對表達量。

表5 各組小鼠右眼視網(wǎng)膜MFN1、OPA1、DRP1蛋白相對表達量比較

2.4透射電鏡觀察各組小鼠右眼視網(wǎng)膜色素上皮細胞形態(tài)學表征對照組小鼠右眼視網(wǎng)膜色素上皮細胞超微結(jié)構(gòu)未見明顯病變;模型組視網(wǎng)膜色素上皮細胞線粒體腫脹,嵴紊亂變空;中藥組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞超微結(jié)構(gòu)較正常,偶見線粒體輕微腫脹,且細胞器結(jié)構(gòu)完整,見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞線粒體超微結(jié)構(gòu) A:對照組;B:模型組;C:中藥組。線粒體(↑),細胞核(×),自噬小體(▲),色素顆粒()。

3 討論

近視作為是全球范圍內(nèi)最常見的視力障礙疾病,研究發(fā)現(xiàn)在它的早期就有視功能下降、視網(wǎng)膜肌樣體帶及橢圓體帶變薄等表現(xiàn)[16]。隨著近視的進展,眼軸進一步延長,當形成高度近視時常伴視網(wǎng)膜退變甚至出現(xiàn)后極部視網(wǎng)膜萎縮等表現(xiàn),常常造成不可逆性視力受損[17]。因此,在近視早期階段對它進行干預(yù)具有重要意義。

陳達夫老先生的駐景丸加減方是在《太平圣惠方》駐景方基礎(chǔ)上化裁而成,為眼科臨床常用方,全方具有肝腎同補、活血明目之功[13,18]。補精益視片則是根據(jù)駐景丸加減方制成的中成藥,目前臨床廣泛應(yīng)用于青少年近視防治,其療效確切[19];既往研究發(fā)現(xiàn)駐景丸加減方可以抑制感光細胞凋亡,對感光細胞具有保護作用[20]。本課題組前期研究也表明駐景丸加減方具有干預(yù)FDM小鼠視網(wǎng)膜厚度變薄的作用[13],為研究駐景丸加減方干預(yù)早期軸性近視的作用機制,本研究通過構(gòu)建FDM動物模型,并從線粒體動力學角度開展了更進一步的研究。FDM動物模型已被廣泛應(yīng)用于近視研究[21-22]。據(jù)報道,正常生理狀態(tài)下,小鼠視力發(fā)育呈生理性遠視發(fā)展,FDM小鼠的視力會出現(xiàn)向“近視化漂移”的現(xiàn)象[23],因此,本次實驗結(jié)果用“相對近視化”即屈光度降低作為評判小鼠近視表現(xiàn)。此外,眼軸增長是軸性近視的主要特征之一,因此上述兩個指標是判斷近視的重要指征[24]。本課題組前期實驗通過該方法構(gòu)建小鼠近視模型,發(fā)現(xiàn)FDM小鼠視力會明顯出

現(xiàn)屈光度降低、眼軸變長等近視的表現(xiàn)[18]。這與本研究結(jié)果一致,本次實驗結(jié)果表明,小鼠形覺剝奪4wk后,與對照組相比,模型組和中藥組小鼠右眼屈光度和眼軸長度發(fā)生明顯變化,表現(xiàn)出屈光度向“近視化漂移”,眼軸變長,這提示模型組和中藥組小鼠發(fā)生“相對近視發(fā)展”。在本研究中,對近視小鼠進行了藥物干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠屈光度明顯低于中藥組小鼠,但是模型組小鼠眼軸增長明顯快于中藥組,這提示駐景丸加減方對近視小鼠視力具有一定的保護作用。

眼是高耗能器官,擁有豐富的線粒體,以維持它高耗能的生理活動需求[25]。線粒體的形態(tài)和質(zhì)量控制是它功能的基礎(chǔ),而線粒體動力學平衡可以維持線粒體的正常形態(tài)和質(zhì)量[26]。線粒體功能與線粒體的結(jié)構(gòu)和形態(tài)密不可分,線粒體形態(tài)改變可能是線粒體功能受損的早期表現(xiàn)[27]。Jin等[28]發(fā)現(xiàn)當線粒體功能障礙時,線粒體常呈碎片化表現(xiàn),即調(diào)控線粒體形態(tài)的動力學發(fā)生了異常。在本實驗中,我們發(fā)現(xiàn)正常組小鼠視網(wǎng)膜線粒體結(jié)構(gòu)完整,近視組小鼠視網(wǎng)膜線粒體出現(xiàn)明顯腫脹,嵴紊亂變空等現(xiàn)象;而與模型組小鼠相比,中藥組小鼠視網(wǎng)膜線粒體僅表現(xiàn)出輕微結(jié)構(gòu)紊亂和腫脹,這提示駐景丸加減方對線粒體起保護作用。在正常生理條件下,線粒體通過不斷地融合和分裂維持其穩(wěn)態(tài)和功能,同時也影響其本身在細胞內(nèi)的運動和合理分布;其中具有GTP酶活性的DRP1是調(diào)控線粒體分裂的重要因子之一,MFN1和OPA1對調(diào)控線粒體融合過程至關(guān)重要[10]。因此基于上述研究,我們研究了駐景丸加減方對線粒體動力學的關(guān)鍵蛋白的影響。

線粒體的融合是由膜間蛋白OPA1和定位于線粒體外膜的MFN1共同介導(dǎo)完成。MFN1定位于線粒體外膜,是介導(dǎo)線粒體外膜的融合的關(guān)鍵細胞因子。目前研究已證實MFN1對于近視的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。據(jù)報道MFN1基因的遺傳變異與中國人群中低至中度近視密切相關(guān),其中MFN1基因內(nèi)的rs13098637位點與近視顯著相關(guān)[29]。曾官鵬等[30]在豚鼠視網(wǎng)膜上可見MFN1陽性表達,早期階段近視豚鼠視網(wǎng)膜上MFN1陽性表達主要見于RGCs,隨著近視度數(shù)加深,MFN1在視錐視桿細胞中也出現(xiàn)表達。與此相一致,Cai等[9]發(fā)現(xiàn)可以在近視豚鼠視網(wǎng)膜中觀察到MFN1陽性細胞表達。而本實驗對MFN1在近視中的作用進行了定量研究,結(jié)果表明與對照組相比,近視小鼠視網(wǎng)膜上MFN1表達降低,而經(jīng)過中藥干預(yù)后近視小鼠視網(wǎng)膜上MFN1表達增加。OPA1是協(xié)同MFN1促進線粒體融合的重要蛋白,對于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞突觸結(jié)構(gòu)和連接至關(guān)重要。Hu等[31]研究發(fā)現(xiàn),OPA1過表達可能通過增強線粒體融合、防止RGCs丟失,這提示OPA1過表達促進線粒體融合,從而對線粒體起到保護作用。這與本研究一致,本實驗結(jié)果顯示,正常組小鼠OPA1呈高表達,而模型組小鼠OPA1表達水平下降,電鏡下可見線粒體腫脹空泡形成;而與模型組相比,中藥組小鼠OPA1表達水平增高,且電鏡觀察到線粒體僅見輕微腫脹。

DRP1是促線粒體分裂的重要蛋白,是具有GTP酶活性的動力酶蛋白家族成員之一,線粒體分裂是一個多步驟的過程,而在這個過程中DRP1募集是關(guān)鍵的一步[32-33]。在正常生理情況下,線粒體分裂對細胞增長必不可少,但當細胞的生存微環(huán)境發(fā)生異常,可以促進線粒體分裂增加,線粒體呈現(xiàn)碎片化表現(xiàn)[27]。在本實驗中,與對照組小鼠相比,模型組小鼠視網(wǎng)膜DRP1表達水平增加,經(jīng)過藥物干預(yù)后,與模型組相比,中藥組小鼠DRP1表達水平降低,而且與模型組小鼠相比,中藥組小鼠視網(wǎng)膜線粒體僅表現(xiàn)出輕微結(jié)構(gòu)紊亂和腫脹,這提示駐景丸加減方可能通過抑制近視小鼠視網(wǎng)膜DRP1表達,實現(xiàn)維持視網(wǎng)膜線粒體完整的作用。

總之,線粒體目前已成為眼科疾病研究的熱點[34],而在近視相關(guān)研究中,早期對線粒體動力學主要是進行定性研究,缺少定量研究的同時,對其他調(diào)控線粒體動力學的關(guān)鍵細胞因子也缺少探討,而本研究通過構(gòu)建近視小鼠模型,進一步探討了駐景丸加減方對線粒體動力學關(guān)鍵蛋白MFN1、OPA1、DRP1的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)駐景丸加減方可能是通過調(diào)控線粒體動力學關(guān)鍵蛋白,發(fā)揮保護視網(wǎng)膜線粒體的作用,從而對軸性近視小鼠視力起到保護作用。