新疆昌吉市2 型豬鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析

陳 旺，王 元，劉英玉*，劉俊飛，王雅雯，田亞琴，宋超慧

（ 1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 ； 2. 昌吉天康畜牧有限公司，新疆 昌吉 831100 ）

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（Streptococcus suis）引起的一種細(xì)菌性傳染病，通常引發(fā)豬的肺炎和敗血癥等疾病，是由C、D、E 及L 群鏈球菌引起的一種多型性豬傳染病的總稱(chēng)，臨床表現(xiàn)分為關(guān)節(jié)腫大、淋巴結(jié)腫脹、腦膜腦炎及敗血癥等多種類(lèi)型[1-3]。豬鏈球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，在自然界分布非常廣泛，不僅可以感染豬，還可以引起人、馬、牛、羊等多種動(dòng)物的感染。豬鏈球菌可分為35 個(gè)血清型（1～34 型和1/2 型），其中1、2、7、9 型在中國(guó)比較常見(jiàn)，2 型毒力最強(qiáng)而且流行最廣[4]。常見(jiàn)的豬鏈球菌診斷方法主要有臨床診斷、動(dòng)物尸體剖檢、病原分離培養(yǎng)及生化鑒定、血清學(xué)鑒定、分子水平鑒定等[5]。

2型豬鏈球菌可通過(guò)黏膜或傷口等傳播途徑感染人并引發(fā)疾病，是一種重要的人畜共患病原菌[6]。2型鏈球菌病通常呈地方性流行，一年四季均可發(fā)病，但常見(jiàn)于4～11周齡的豬群[7-8]。1998—1999 年中國(guó)江蘇省部分地區(qū)和2005年四川省暴發(fā)2型鏈球菌病，對(duì)豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。2022年7月，新疆昌吉市某規(guī)模化豬場(chǎng)的保育仔豬出現(xiàn)發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫脹、站立不穩(wěn)、腹部背部皮膚有紫色斑塊等臨床癥狀。本試驗(yàn)采集了部分病死豬的組織樣品，并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定試驗(yàn)，分離純化菌株通過(guò)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察、生化反應(yīng)鑒定、PCR鑒定及血清型分型、藥敏試驗(yàn)進(jìn)一步確定病因，以期為盡快確診并指導(dǎo)豬場(chǎng)合理使用藥物進(jìn)行預(yù)防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源

樣品采集地點(diǎn)為新疆昌吉市某規(guī)模化豬場(chǎng)，無(wú)菌采集病死豬的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)等組織器官作為試驗(yàn)樣品。

1.1.2 主要儀器與試劑

細(xì)菌生化管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；PCR 儀、凝膠成像儀購(gòu)自Bio Rad 公司；生物安全柜購(gòu)自濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；全自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)自上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司。

革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；核酸提取試劑盒購(gòu)自上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購(gòu)自美國(guó)BD 公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原的分離培養(yǎng)與純化

嚴(yán)格按照無(wú)菌要求操作，將病死保育豬的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)等樣品劃線(xiàn)接種在TSA 平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，察看菌落培養(yǎng)生長(zhǎng)情況。挑取2～3株疑似目標(biāo)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀(guān)察，同時(shí)劃線(xiàn)接種于TSA瓊脂平板進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 生化試驗(yàn)

將菌液分別接種于七葉苷、棉籽糖、甘露糖、尿素、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖等生化鑒定管中以及甘油、6.5% NaCl液體和麥康凱平板上，培養(yǎng)10～12 h觀(guān)察生化鑒定結(jié)果。

1.2.3 PCR檢測(cè)和16S rRNA測(cè)序

用核酸提取試劑盒提取DNA，-20 ℃保存。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]合成豬鏈球菌管家基因谷氨酸脫氫酶（gdh）引物，預(yù)擴(kuò)增目的片段大小為689 bp；按照參考文獻(xiàn)[10]合成豬鏈球菌16S rRNA引物，預(yù)擴(kuò)增目的片段大小為328 bp，引物序列見(jiàn)表1。將陽(yáng)性PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果放在美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST堿基序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 PCR引物序列信息Tab.1 Primer sequences information for PCR

1.2.4 血清型分型（見(jiàn)表1）

參照文獻(xiàn)[9]合成2型豬鏈球菌莢膜多糖（CPS2J）特異性分型用引物，預(yù)擴(kuò)增片段大小為675 bp。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，檢測(cè)該分離菌對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、磺胺嘧啶鈉、青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、氟苯尼考等8 種臨床常用藥物的敏感性。將培養(yǎng)10～12 h生長(zhǎng)良好的100 μL 分離菌液涂布于TSA 平板表面，取藥敏紙片貼于TSA平板表面，待完全吸收后，將平板37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，測(cè)定抑菌圈直徑大小，依據(jù)抑菌環(huán)直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)[5,11]判定菌株對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離純化及染色鏡檢

無(wú)菌取病死豬的心、肺、淋巴結(jié)等組織器官涂抹在TSA 平板上，37 ℃培養(yǎng)10～12 h后觀(guān)察菌落形態(tài)并挑取目標(biāo)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀(guān)察，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 分離株菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果Fig.1 Colony morphology and microscopic examination results of isolated strains

由圖1（a）可知，分離株菌落針尖大小、灰白色、圓形、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊。

由圖1（b）可知，菌株革蘭氏陽(yáng)性，有長(zhǎng)鏈狀、短鏈狀、單鏈或雙鏈等多種形態(tài)。

2.2 分離株生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

將純化后的分離株接種于細(xì)菌生化反應(yīng)管內(nèi)，培養(yǎng)12 h后觀(guān)察。結(jié)果顯示，分離株可發(fā)酵葡萄糖、棉籽糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘露糖、果糖；能夠分解七葉苷，但不能分解尿素；在甘油、6.5% NaCl溶液和麥康凱平板中無(wú)法生長(zhǎng)。生化鑒定結(jié)果與豬鏈球菌的生化特性相符。

2.3 分離株P(guān)CR鑒定及測(cè)序結(jié)果（見(jiàn)圖2、圖3）

圖2 分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification results for isolated strains

圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果Fig.3 Construction results of phylogenetic tree

由圖2可知，采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物和豬鏈球菌管家基因gdh引物對(duì)分離株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出約328 bp和689 bp的目的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致。

由圖3 可知，將16S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST堿基序列比對(duì)，結(jié)果顯示分離株與豬鏈球菌同源性高達(dá)100%，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上與2型豬鏈球菌處于同一分支，確定所分離株為2型豬鏈球菌。

2.4 分離株血清型分型結(jié)果（見(jiàn)圖4）

由圖4 可知，使用CPS2J特異性基因引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增和電泳后，擴(kuò)增出約675 bp的目的條帶，該菌株為2型豬鏈球菌。

注 ： M為DL2000 Marker；1為2型豬鏈球菌；2為陰性對(duì)照。

2.5 分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）

表2 分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Drug sensitivity test results of isolated strain

由表2可知，分離株對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、阿莫西林、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考均敏感，對(duì)青霉素中介，對(duì)磺胺嘧啶鈉耐藥。

3 討論

豬鏈球菌病是一類(lèi)非常重要的人畜共患急性傳染病，除了能夠感染人和豬以外，還能夠感染馬、羊、貓、狗、野豬等其他動(dòng)物[5]。豬鏈球菌的致病性差異非常大，與其不同的血清型有關(guān)，只有強(qiáng)毒力的菌株才能夠引起豬肺炎、敗血癥和突然死亡等癥狀，低毒力的菌株多見(jiàn)于豬的呼吸道[12-14]。近些年，隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)蓬勃發(fā)展，豬鏈球菌發(fā)病率也呈升高的趨勢(shì)發(fā)展，極大地影響了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[15]。尤其是在中國(guó)湖南、廣東、廣西、江蘇、四川、新疆、上海等地均有2 型豬鏈球菌感染的報(bào)道[6,15]。此外，豬鏈球菌作為革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)各種抗生素藥物的抵抗力不是很強(qiáng)[16-17]。但隨著近年來(lái)日常生產(chǎn)過(guò)程中抗生素的大量使用，導(dǎo)致豬鏈球菌出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象，進(jìn)而產(chǎn)生了大量的耐藥菌株，引起臨床用藥效果不明顯、疾病控制難度越來(lái)越大等現(xiàn)象。而且，豬鏈球菌的耐藥基因可通過(guò)食物鏈傳遞給人類(lèi)，因此豬場(chǎng)管理者在臨床用藥時(shí)應(yīng)按照交替輪換用藥、聯(lián)合用藥的準(zhǔn)則，避免產(chǎn)生大量耐藥菌株[18]。

本研究中，經(jīng)藥敏試驗(yàn)表明分離株對(duì)8 種臨床常見(jiàn)藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對(duì)環(huán)丙沙星、林可霉素、恩諾沙星、阿莫西林、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考敏感，對(duì)青霉素中介，對(duì)磺胺嘧啶鈉耐藥，推測(cè)可能與臨床長(zhǎng)期使用磺胺類(lèi)藥物存在較大關(guān)系。此藥敏試驗(yàn)結(jié)果與彭凌等[19]、劉澤文等[20]、徐引弟等[21]研究結(jié)果不完全相同，說(shuō)明抗生素在生產(chǎn)過(guò)程中的普遍使用造成臨床上菌株的耐藥性差異很大。因此，為了解在豬鏈球菌的防治過(guò)程中抗生素的耐藥情況，開(kāi)展藥敏試驗(yàn)非常有必要。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，新疆昌吉市某規(guī)模化豬養(yǎng)殖場(chǎng)保育仔豬死亡的原因是2型豬鏈球菌感染，建議該豬場(chǎng)可選擇環(huán)丙沙星、林可霉素、恩諾沙星等藥物進(jìn)行治療與防控。